本發(fā)明屬于食品健康領(lǐng)域，特別涉及一種鑒定黃牛肉真?zhèn)蔚臋z測(cè)方法。

背景技術(shù)：

肉是人類優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和多種營養(yǎng)素的主要來源，含有豐富的必需氨基酸和多種微量元素。近年來，肉的摻假和欺詐行為越來越受到人們的關(guān)注。在“馬肉風(fēng)波”事件之前，國內(nèi)早已爆出應(yīng)用化學(xué)藥物處理的“假魚翅”、以及牛肉膏處理的豬肉或鴨肉冒充牛肉等事件。這不僅涉及到食品摻假欺詐的商業(yè)行為而且涉及到民族和宗教信仰問題。因此，基于經(jīng)濟(jì)和宗教方面的考慮，肉的物種鑒定具有非常重要的意義。另一方面，對(duì)加工食品而言，物種的原始可識(shí)別形態(tài)特征消失，使得物種的鑒別變得相對(duì)困難。目前關(guān)于肉的物種鑒定方法有：感官分析，解剖和組織學(xué)鑒定，顯微技術(shù)，化學(xué)方法，電泳法，色譜法以及免疫學(xué)技術(shù)等方法。但是，因加工后的肉品大多已改變其原始形態(tài)，采用這些方法通常不能做出正確判斷。目前迫切需要一些更靈敏和可靠的檢測(cè)方法來鑒定動(dòng)物食品或動(dòng)物源性加工食品的物種來源。

正是在這樣的背景下，發(fā)展了各種基于DNA的分子鑒定技術(shù)，如PCR,PCR-RFLP,Real-time PCR,DNA條形碼技術(shù)等。盡管目前的分子技術(shù)已經(jīng)用于許多肉的物種鑒定，如豬肉，鴨肉，雞肉，鵝肉，牛肉，鹿肉，魚肉等。

黃牛是中國固有的普通牛種。黃牛肉質(zhì)鮮美，品質(zhì)優(yōu)良，蛋白質(zhì)含量高，礦物質(zhì)豐富，脂肪少，且脂肪中胡蘿卜素含量豐富，是廣受消費(fèi)者青睞的天然綠色食品。但是，基于黃牛肉需求量大，黃牛肉的價(jià)格相對(duì)于豬肉、魚肉更高，這樣一來，為了經(jīng)濟(jì)利益，不法商販利用其它肉類加工后充當(dāng)黃牛肉在市場(chǎng)上進(jìn)行銷售，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的權(quán)益，也帶來了諸多的食品安全隱患。如何進(jìn)行黃牛肉的真?zhèn)舞b定顯得非常重要。目前，關(guān)于黃牛肉真?zhèn)舞b定技術(shù)方面的研究報(bào)道還不多，國內(nèi)外報(bào)道的文獻(xiàn)也只有寥寥幾篇，因此，還需要不斷開發(fā)新的更加快速的方法。

基于以上的分析和目前迫切的需求，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)一種能夠簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確鑒定黃牛肉真?zhèn)蔚募夹g(shù)。為目前市場(chǎng)上售賣的黃牛肉及其制品的監(jiān)督提供急需的技術(shù)支持，也為消費(fèi)者的利益提供技術(shù)保障，將具有良好的應(yīng)用前景和推廣價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種鑒定黃牛肉真?zhèn)蔚臋z測(cè)方法。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒用于黃牛肉的鑒定，所述試劑盒中包括引物對(duì)：

上游引物：5’-CACACCTCCAAACAACGAAGC-3’(SEQ ID NO.1)；和

下游引物：5’-TACATTACCCCTTGCGTAGGT-3’(SEQ ID NO.2)。

進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括DNA提取試劑。

進(jìn)一步的，所述DNA提取試劑選自下組的一種或多種：

TE緩沖液、約10％(w/v)的SDS溶液、約10mg/mL的蛋白酶K、約5M NaCl、CTAB/NaCl、和體積體積比約為24：1的氯仿/異戊醇溶液。

進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括用于PCR擴(kuò)增的試劑。

進(jìn)一步地，所述用于PCR擴(kuò)增的試劑選自下組的一種或多種：

不含Mg²⁺的10×PCR緩沖液、約25mM的MgCl₂、約2.5mM的dNTPs、約5U/l的Taq DNA聚合酶、和超純水。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種鑒定黃牛肉真?zhèn)蔚臋z測(cè)方法，所述方法包括步驟：

1)DNA提取

提供待測(cè)樣品，并自所述待測(cè)樣品中提取DNA，作為后續(xù)PCR擴(kuò)增的模板；

2)PCR擴(kuò)增

使用如下引物對(duì)，對(duì)步驟1)獲得的DNA進(jìn)行擴(kuò)增：

上游引物：5’-CACACCTCCAAACAACGAAGC-3’(SEQ ID NO.1)；和

下游引物：5’-TACATTACCCCTTGCGTAGGT-3’(SEQ ID NO.2)；

3)結(jié)果鑒定

對(duì)步驟2)中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，觀察電泳結(jié)果，黃牛肉的擴(kuò)增片段大小為534bp，如有534bp大小的片段，則判定結(jié)果為陽性，所述待測(cè)樣品是黃牛肉；如無534bp大小的片段，則判定結(jié)果是陰性，所述待測(cè)樣品不是黃牛肉。

進(jìn)一步地，所述步驟1)將提取的DNA濃度稀釋至約100ng/l作為后續(xù)PCR擴(kuò)增的模板。

進(jìn)一步地，所述步驟1)包括步驟：

將待測(cè)樣品在液氮中研磨成細(xì)粉；取1.0g細(xì)粉于15ml的離心管中，加入TE緩沖液1.8ml，放入70℃水浴10min，加入200 l的10％SDS,10uL的10mg/mL的蛋白酶K，70℃水浴15min，取出后加入200 l的5M NaCl，以及70 l的CTAB/NaCl，70℃水浴15min，-20℃放置30min，取出加入等體積的24：1的氯仿/異戊醇混勻，離心取上清；重復(fù)上述步驟一次；最后用2倍體積的冰無水乙醇混勻，-20℃靜置45min，離心取上清，沉淀用70％的乙醇洗滌，干燥，沉淀溶于50l雙蒸水中，使用超微量核算蛋白質(zhì)測(cè)定儀，將DNA濃度稀釋至100ng/l左右作為后續(xù)PCR擴(kuò)增的模板。

進(jìn)一步地，所述步驟2)中，PCR擴(kuò)增體系包括：

不含Mg²⁺的10×PCR緩沖液2 l，濃度為25mM的MgCl2 1.6 l，濃度為2.5mM的dNTPs 1.2 l，所述上游引物和所述下游引物的10M混合物1 l，5U/l的Taq DNA聚合酶0.2 l，超純水補(bǔ)充至20 l。

進(jìn)一步地，所述步驟2)中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min；40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min；4℃保存。

進(jìn)一步地，所述步驟3)中，電泳條件為：取10 l PCR產(chǎn)物與1 l的6×上樣緩沖液混合，2.0％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行點(diǎn)樣，120V條件下電泳25min。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物僅針對(duì)黃牛物種的COI基因序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增，其他哺乳動(dòng)物不能擴(kuò)增出來，并且采用普通PCR即可進(jìn)行黃牛肉的鑒定，不需要進(jìn)行酶切和測(cè)序。本發(fā)明操作方便，檢測(cè)時(shí)間短，監(jiān)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，具有很好的應(yīng)用前景，滿足于市場(chǎng)監(jiān)督檢測(cè)。

以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

附圖說明

圖1是采集的8份不同黃牛肉樣品采用該發(fā)明進(jìn)行檢測(cè)的凝膠電泳圖。

圖中1-8泳道表示是1-8份不同的黃牛肉樣品；M為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；N為陰性對(duì)照。8份黃牛鮮肉樣品均能檢測(cè)出534bp的陽性條帶，表明所檢樣品屬于黃牛肉。

圖2是采集的8種不同來源和物種的鮮肉樣品采用該發(fā)明進(jìn)行檢測(cè)的凝膠電泳圖。

圖中1-8泳道分別為新鮮雞肉，豬肉，鴨肉，魚肉，黃牛肉，兔肉，冷凍黃牛肉，黃牛肉干樣品；M為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；N為陰性對(duì)照；P為陽性對(duì)照。5種不同物種的樣品中，只有5號(hào)泳道的新鮮黃牛肉樣品，7號(hào)冷凍黃牛肉樣品和8號(hào)的黃牛肉干樣品能夠擴(kuò)增出534bp的陽性條帶，其他樣品未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，表明該發(fā)明具有很好的特異性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。

本發(fā)明中針對(duì)黃牛特有的基因，設(shè)計(jì)了數(shù)十對(duì)的引物進(jìn)行測(cè)試，其中有些引物對(duì)雖然特異性較好，但是擴(kuò)增不穩(wěn)定，結(jié)果準(zhǔn)確率較低，容易造成假陰性的結(jié)果。最終獲得了特異性好，擴(kuò)增穩(wěn)定的黃牛肉特征引物COI-F(5’-CACACCTCCAAACAACGAAGC-3’(SEQ ID NO.1))和COI-R(5’-TACATTACCCCTTGCGTAGGT-3’(SEQ ID NO.2))，對(duì)黃牛肉樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)，測(cè)試了50個(gè)批次，結(jié)果準(zhǔn)確率100％，說明PCR擴(kuò)增的穩(wěn)定性極好。該引物對(duì)針對(duì)黃牛物種(Bostaurus)的特異性基因COI基因(NC_006853.1)，擴(kuò)增片段長度534bp。

實(shí)施例1

為了便于直觀理解本發(fā)明的技術(shù)方案，在上海市各區(qū)菜場(chǎng)采集新鮮黃牛樣品8份，按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.DNA提?。簩⑿迈r的動(dòng)物肌肉組織取下一小塊，切碎后放入研缽中加入液氮，快速將組織在液氮中搗碎并研磨成細(xì)粉；取1.0g細(xì)粉于15ml的離心管中，加入TE緩沖液(10mM Tris.C1,1mM EDTA,pH8.0；CTAB/NaCl為1％CTAB,0.73M NaCl)共1.8ml，放入70℃水浴10min，加入200 l的10％SDS,10uL的10mg/mL的蛋白酶K，70℃水浴15min，取出后加入200 l的5M NaCl，以及70 l的CTAB/NaCl，70℃水浴15min，-20℃放置30min，取出加入等體積的24：1的氯仿/異戊醇混勻，離心取上清；重復(fù)上述步驟一次；最后用2倍體積的冰無水乙醇混勻，-20℃靜置45min，離心取上清，沉淀用70％的乙醇洗滌，干燥，沉淀溶于50 l雙蒸水中，使用超微量核算蛋白質(zhì)測(cè)定儀，將DNA濃度稀釋至100ng/l左右作為模板。

2.PCR:PCR擴(kuò)增采用20 l的體系，DNA模板1 l，不含Mg²⁺的10×PCR緩沖液2 l，濃度為25mM的MgCl2 1.6 l，濃度為2.5mM的dNTPs 1.2 l，黃牛肉特征上游引物和下游引物的10 M混合物1 l，5U/l的Taq DNA聚合酶0.2 l，如超純水補(bǔ)充至20 l；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min；40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min；4℃保存。

3.電泳檢測(cè)：取10 L PCR產(chǎn)物(使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物擴(kuò)增)與1 L L的6×Loading buffer(上樣緩沖液)混合，2.0％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行點(diǎn)樣，120V條件下電泳40min，然后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

4.結(jié)果鑒定：觀察電泳結(jié)果，上述9份黃牛肉的擴(kuò)增片段大小都為534bp，結(jié)果為陽性，8份樣品證實(shí)都是黃牛肉，結(jié)果見附圖1。

實(shí)施例2

為了便于直觀理解本發(fā)明的技術(shù)方案，在市場(chǎng)上采集新鮮牛肉，雞肉，豬肉，鴨肉，兔肉，羊肉和魚肉，按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.DNA提取：將新鮮的動(dòng)物肌肉組織取下一小塊，切碎后放入研缽中加入液氮，快速將組織在液氮中搗碎并研磨成細(xì)粉；取1.0g細(xì)粉于15ml的離心管中，加入TE緩沖液(10mM Tris.C1,1mM EDTA,pH8.0；CTAB/NaCl為1％CTAB,0.73M NaCl)共1.8ml，放入70℃水浴10min，加入200 l的10％SDS,10uL的10mg/mL的蛋白酶K，70℃水浴15min，取出后加入200 l的5M NaCl，以及70 l的CTAB/NaCl，70℃水浴15min，-20℃放置30min，取出加入等體積的24：1的氯仿/異戊醇混勻，離心取上清；重復(fù)上述步驟一次；最后用2倍體積的冰無水乙醇混勻，-20℃靜置45min，離心取上清，沉淀用70％的乙醇洗滌，干燥，沉淀溶于50 l雙蒸水中，使用超微量核算蛋白質(zhì)測(cè)定儀，將DNA濃度稀釋至100ng/l左右作為模板。

2.PCR:PCR擴(kuò)增采用20 l的體系，DNA模板1 l，不含Mg²⁺的10×PCR緩沖液2 l，濃度為25mM的MgCl₂ 1.6 l，濃度為2.5mM的dNTPs 1.2 l，黃牛肉特征引物COI-F(5’-CACACCTCCAAACAACGAAGC-3’)和COI-R(5’-TACATTACCCCTTGCGTAGGT-3’)的10 M混合物1 l，5U/l的Taq DNA聚合酶0.2 l，如超純水補(bǔ)充至20 l；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min；40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min；4℃保存。

3.電泳檢測(cè)：取10 L PCR產(chǎn)物與1 L L的6×Loading buffer(上樣緩沖液)混合，2.0％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行點(diǎn)樣，120V條件下電泳40min，然后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

4.結(jié)果鑒定：觀察電泳結(jié)果，只有黃牛肉的擴(kuò)增片段大小都為534bp，其他肉品均未擴(kuò)增出條帶，結(jié)果見附圖2。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。

序列表

<110> 河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院

<120> 一種鑒定黃牛肉真?zhèn)蔚臋z測(cè)方法

<130> 0001

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacacctcca aacaacgaag c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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