本發(fā)明涉及乳腺癌診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是一種乳腺癌轉(zhuǎn)移評(píng)估試劑盒，用于乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移情況評(píng)估。
背景技術(shù)：
：在中國(guó)，癌癥的健康負(fù)擔(dān)逐年增長(zhǎng)，每年超過160萬人診斷為癌癥，120萬因癌癥而死亡。與其他大多數(shù)國(guó)家一樣，乳腺癌也成為了中國(guó)女性最常見的癌癥；每年中國(guó)乳腺癌新發(fā)數(shù)量和死亡數(shù)量分別占全世界的12.2％和9.6％。腫瘤專家指出，近年來我國(guó)癌癥發(fā)病呈明顯上升趨勢(shì)，但得到規(guī)范治療的患者卻不足一半。ER+/HER2-乳腺癌是乳腺癌的一種亞型，約占全部乳腺癌的2/3，每年約有33000女性被診斷出患有此種類型的乳腺癌。治療ER+/HER2-乳腺癌通常需要先手術(shù)再內(nèi)分泌治療，若懷疑存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也可能需要進(jìn)行化療，因?yàn)槿羰谴嬖谶h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移意味著疾病可能無法被治愈。2013年，英國(guó)批準(zhǔn)了OncoTypeDX基因檢測(cè)來幫助存在轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者評(píng)估是否需要進(jìn)行化療，隨后ASCO和NCCN也將其納入相關(guān)指南。這是一類以多基因表達(dá)檢測(cè)為基礎(chǔ)的風(fēng)險(xiǎn)模型，可用于評(píng)價(jià)ER+/HER2-乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，幫助臨床決策。2012年圣安東尼奧乳腺癌會(huì)議中，有關(guān)EndoPredict及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的新數(shù)據(jù)被發(fā)布。結(jié)果表明低風(fēng)險(xiǎn)人群5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移約3％，而6-10年約2％。因此該手段不僅可以區(qū)分不必要化療人群，也可以充分進(jìn)行五年的抗激素治療而減少不必要的過多治療。Endopredict能夠識(shí)別出不需化療的遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)低風(fēng)險(xiǎn)患者，因?yàn)镋ndopredict結(jié)合淋巴結(jié)情況及腫瘤大小等參數(shù)，故相比OncotypeDX提供了更精確的預(yù)后信息，并且OncotypeDX檢測(cè)需要運(yùn)送到專業(yè)實(shí)驗(yàn)室分析，而Endopredict在普通實(shí)驗(yàn)室就可以進(jìn)行分析，縮短相應(yīng)的檢測(cè)時(shí)間。有研究結(jié)果表明，在預(yù)測(cè)ER+/HER2-乳腺癌復(fù)發(fā)低風(fēng)險(xiǎn)方面，EndoPredict比21基因OncotypeDX檢測(cè)更為精準(zhǔn)，從而可以免除此類患者的術(shù)后化療。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提高乳腺癌轉(zhuǎn)移評(píng)估準(zhǔn)確率，為乳腺癌患者10年遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)情況提供更加可靠的診斷試劑。本發(fā)明的發(fā)明思路是基于Endopredict原理，利用PCR-熒光定量PCR法，通過設(shè)計(jì)篩選特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高的擴(kuò)增引物，分別檢測(cè)11個(gè)目標(biāo)基因的表達(dá)量，通過表達(dá)量的差異計(jì)算評(píng)分，達(dá)到準(zhǔn)確判斷乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)情況。本發(fā)明提供的乳腺癌轉(zhuǎn)移評(píng)估試劑盒，包括BIRC5、DHCR7、UBE2C、AZGP1、IL6ST、MGP、RBBP8、STC2、CALM2、OAZ1和RPL37A共計(jì)11個(gè)目的基因的特異熒光定量PCR檢測(cè)引物對(duì)，用于檢測(cè)11個(gè)目的基因的表達(dá)量，其核苷酸序列如下所示：BIRC5的檢測(cè)引物對(duì)：F:CCACTGCCCCACTGA(SEQIDNO:1)，R:AGGAAAGCGCAACCGG(SEQIDNO:2)；DHCR7的檢測(cè)引物對(duì)：F:CTCTGCTTCCCGAT(SEQIDNO:3)，R:CATAGGGCAAGCAGAAA(SEQIDNO:4)；UBE2C的檢測(cè)引物對(duì)：F:AGTTCCTGTCTCTCTGCCA(SEQIDNO:5)，R:GCTGTAGCCTTTTGCC(SEQIDNO:6)；AZGP1的檢測(cè)引物對(duì)：F:CTGGACCGGCAAGA(SEQIDNO:7)，R:TAGGCCAGGCACTTCAG(SEQIDNO:8)；IL6ST的檢測(cè)引物對(duì)：F:GTGACTTTCAAGGGAACTTA(SEQIDNO:9)，R:CCTTTGGAAGGTGGAGCT(SEQIDNO:10)；MGP的檢測(cè)引物對(duì)：F:ATTAACAGGAGAAATGCAA(SEQIDNO:11)，R:GAGCTCGTGGACAGGCT(SEQIDNO:12)；RBBP8的檢測(cè)引物對(duì)：F:AGCAGAGGTTTTCTAAATA(SEQIDNO:13)，R:AAGTCGTCTTTGGACAGG(SEQIDNO:14)；STC2的檢測(cè)引物對(duì)：F:TTGACAAATTTCCCTTAGGA(SEQIDNO:15)，R:CAGGACGCAGCTTTACCA(SEQIDNO:16)；CALM2的檢測(cè)引物對(duì)：F:CGAGCTGAGTGGTTGT(SEQIDNO:17)，R:GTCAGTTGGTCAGCCATG(SEQIDNO:18)；OAZ1的檢測(cè)引物對(duì)：F:GAGCCGACCATGTCTTCA(SEQIDNO:19)，R:AGCCCAAAAAGCTGAAG(SEQIDNO:20)；RPL37A的檢測(cè)引物對(duì)：F:GTTCCTGCATGAAGAC(SEQIDNO:21)，R:ACAGCGGAAGTGGTATTGTA(SEQIDNO:22)。上述試劑盒，11對(duì)引物主要用于檢測(cè)乳腺癌患者特別是其腫瘤組織中11個(gè)基因的表達(dá)情況，這11個(gè)基因包括8個(gè)腫瘤相關(guān)基因和3個(gè)內(nèi)參基因，其中8個(gè)腫瘤相關(guān)基因包括：3個(gè)增殖相關(guān)基因(BIRC5、DHCR7、UBE2C)和5個(gè)ER信號(hào)/分化相關(guān)基因(AZGP1、IL6ST、MGP、RBBP8、STC2)。3個(gè)內(nèi)參基因是CALM2、OAZ1、RPL37A。優(yōu)選地，上述乳腺癌轉(zhuǎn)移評(píng)估試劑盒，還包括11個(gè)目的基因的檢測(cè)探針，探針核苷酸序列的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，探針的核苷酸序列如下：BIRC5探針：CCAGACTTGGCCCAGTGTT(SEQIDNO:23)；DHCR7探針：AGCGCCCACCCTCTCG(SEQIDNO:24)；UBE2C探針：CGGATGGCTTCCCAAA(SEQIDNO:25)；AZGP1探針：CAGCCACCAGGCCCC(SEQIDNO:26)；IL6ST探針：GCCTTTATGGATTCAGGGC(SEQIDNO:27)；MGP探針：TTCATATCCCCTCAGCAGAG(SEQIDNO:28)；RBBP8探針：CGATTCCGCTACATTCCACCC(SEQIDNO:29)；STC2探針：CACCTTGACCCTCAGCC(SEQIDNO:30)；CALM2探針：GCGTCTCGGAAACCGGTA(SEQIDNO:31)；OAZ1探針：TTCCACAAGAACCGCGAG(SEQIDNO:32)；RPL37A探針：CTGGCGGTGCCTGGA(SEQIDNO:33)。上述設(shè)計(jì)篩選出最佳的11條探針序列，特異性和靈敏度都非常好，結(jié)合探針法對(duì)上述11個(gè)目的基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，能夠進(jìn)一步提高檢測(cè)的特異性及靈敏度。優(yōu)選地，上述乳腺癌轉(zhuǎn)移評(píng)估試劑盒，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，所述熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1。優(yōu)選地，上述乳腺癌轉(zhuǎn)移評(píng)估試劑盒，以乳腺癌患者組織中mRNA為檢測(cè)對(duì)象。提取mRNA的試劑可以采用QIAGEN公司的產(chǎn)品FFPEKit。優(yōu)選地，上述乳腺癌轉(zhuǎn)移評(píng)估試劑盒，所述試劑盒結(jié)合乳腺癌患者淋巴結(jié)狀態(tài)和腫瘤大小使用，可以通過多種參數(shù)得出EPclin評(píng)分，更加準(zhǔn)確地判斷乳腺癌患者10年遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)情況。優(yōu)選地，以上任一所述的乳腺癌轉(zhuǎn)移評(píng)估試劑盒，還包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、和Mg2+。通過在反應(yīng)液中添加DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶及相應(yīng)其他化學(xué)成分，使得反轉(zhuǎn)錄和DNA擴(kuò)增一步完成，整個(gè)PCR過程可以采用全封閉形式，避免了交叉污染的可能，使結(jié)果更加精準(zhǔn)。優(yōu)選地，上述乳腺癌轉(zhuǎn)移評(píng)估試劑盒，其特征在于，還包括UDG酶。加入U(xiǎn)DG酶，能夠提高PCR準(zhǔn)確率，進(jìn)而提高評(píng)估結(jié)果的準(zhǔn)確率。本發(fā)明提供的乳腺癌轉(zhuǎn)移評(píng)估試劑盒，具有如下有益效果：本發(fā)明提供了高特異性和靈敏度的11個(gè)目標(biāo)基因表達(dá)檢測(cè)引物，對(duì)乳腺癌相關(guān)基因：3個(gè)增殖相關(guān)基因(BIRC5、DHCR7、UBE2C)和5個(gè)ER信號(hào)/分化相關(guān)基因(AZGP1、IL6ST、MGP、RBBP8、STC2)以及3個(gè)內(nèi)參基因(CALM2、OAZ1、RPL37A)進(jìn)行表達(dá)水平的檢測(cè)，進(jìn)而確定出更加適合中國(guó)地區(qū)檢測(cè)乳腺癌患者10年內(nèi)出現(xiàn)的復(fù)發(fā)以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估試劑盒。在分子水平上檢測(cè)相關(guān)腫瘤基因的表達(dá)量的同時(shí)，進(jìn)一步通過結(jié)合乳腺癌患者的病理信息如淋巴結(jié)狀態(tài)和腫瘤大小來更為精準(zhǔn)的評(píng)估患者的復(fù)發(fā)以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，有利于患者采取相應(yīng)的治療措施，避免過度治療。本發(fā)明試劑盒主要采用Taqman探針檢測(cè)的手段，設(shè)計(jì)的探針具有高識(shí)別靈敏度以及與序列特異性結(jié)合的特性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目的基因精準(zhǔn)有效的檢測(cè)。本發(fā)明的試劑盒，操作簡(jiǎn)便、易于判讀，對(duì)儀器的要求不高，并且整個(gè)PCR過程采用全封閉形式，避免了交叉污染的可能，使結(jié)果更加精準(zhǔn)。附圖說明圖1為實(shí)施例1的試劑盒檢測(cè)11個(gè)目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。具體實(shí)施方式為了使本
技術(shù)領(lǐng)域：
的人員更好地理解本發(fā)明方案，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例1配制PCR擴(kuò)增MIX，具體成分如下表1：表1PCR擴(kuò)增MIX組分及用量組分一人份加入量(μL)DNA聚合酶0.25反轉(zhuǎn)錄酶0.25dNTPs2Mg2+3～3.510×DNA聚合酶buffer2.55×反轉(zhuǎn)錄酶buffer5UDG酶0.1dUTP0.01按照SEQIDNO.1～33制備引物和探針核苷酸序列，并且在每條探針的核苷酸序列5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，配制PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，如下表2：表2、引物探針混合液表1和表2的試劑分別裝在三個(gè)試劑管中，組成乳腺癌轉(zhuǎn)移評(píng)估試劑盒，可以直接對(duì)提取完成的樣本進(jìn)行檢測(cè)，使檢測(cè)步驟更為簡(jiǎn)便。具體步驟如下：1)提取乳腺癌患者組織切片(5～10片，厚度5μm左右)，采用QIAGEN公司FFPEKit試劑盒提取組織中的mRNA；2)將提取之后的mRNA進(jìn)行濃度測(cè)定，并將濃度稀釋至50ng/μL進(jìn)行后續(xù)的PCR反應(yīng)過程；3)反應(yīng)體系的成分組成：將上述表1和表2的試劑混合，然后加入提取的mRNA，組成PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，具體包括dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶buffer、反轉(zhuǎn)錄buffer、11個(gè)基因的引物和探針、DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、UDG酶、dUTP、純化水，以及mRNA模板。4)PCR擴(kuò)增程序如下：第一擴(kuò)增階段：37℃UDG酶反應(yīng)2min；第二擴(kuò)增階段：50℃反轉(zhuǎn)錄20min；第三擴(kuò)增階段：95℃預(yù)變性3min；第四擴(kuò)增階段：94℃變性15s，60℃退火延伸35s，45個(gè)循環(huán)；信號(hào)收集，第四階段60℃收集FAM信號(hào)。5)結(jié)果分析根據(jù)PCR反應(yīng)結(jié)束后，得到的各個(gè)基因的Ct值，聯(lián)合患者相關(guān)的病理信息(淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤大小)，得出患者復(fù)發(fā)以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估EPclin。EPclin值＜3.3提示復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)低，EPclin值≥3.3提示復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高。EndoPredict(EPclin)是一種乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)手段，通過整合8個(gè)基因特征(EP評(píng)分)以及腫瘤大小和淋巴結(jié)狀態(tài)得出綜合預(yù)后信息，預(yù)測(cè)ER+/HER2-乳腺癌患者未來10年遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。來自英國(guó)、德國(guó)和奧地利的研究團(tuán)隊(duì)分析了風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)EndoPredict(EPclin)，為ER+/HER2-乳腺癌患者提供的10年遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后信息(研究結(jié)果在線發(fā)表于JournaloftheNationalCancerInstitute雜志)。6)成品試劑盒的性能驗(yàn)證利用配制完成的成品試劑盒進(jìn)行產(chǎn)品精密度、穩(wěn)定性的檢測(cè)，根據(jù)上述設(shè)置的條件進(jìn)行產(chǎn)品性能驗(yàn)證，使用上述提取的樣本，根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算得出EPclin值。EPclin值＜3.3提示復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)低，EPclin值≥3.3提示復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高。成品試劑盒驗(yàn)證結(jié)果：產(chǎn)品精密度和產(chǎn)品穩(wěn)定性檢測(cè)Ct值的變異系數(shù)(CV，100％)≤5％，均滿足實(shí)驗(yàn)要求。以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司<120>乳腺癌轉(zhuǎn)移評(píng)估試劑盒<130>P20160145<160>33<170>PatentInversion3.5<210>1<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>1ccactgccccactga15<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>2aggaaagcgcaaccgg16<210>3<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>3ctctgcttcccgat14<210>4<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>4catagggcaagcagaaa17<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>5agttcctgtctctctgcca19<210>6<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>6gctgtagccttttgcc16<210>7<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>7ctggaccggcaaga14<210>8<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>8taggccaggcacttcag17<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9gtgactttcaagggaactta20<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>10cctttggaaggtggagct18<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>11attaacaggagaaatgcaa19<210>12<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>12gagctcgtggacaggct17<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>13agcagaggttttctaaata19<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>14aagtcgtctttggacagg18<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>15ttgacaaatttcccttagga20<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>16caggacgcagctttacca18<210>17<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>17cgagctgagtggttgt16<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>18gtcagttggtcagccatg18<210>19<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>19gagccgaccatgtcttca18<210>20<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>20agcccaaaaagctgaag17<210>21<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>21gttcctgcatgaagac16<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>22acagcggaagtggtattgta20<210>23<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>23ccagacttggcccagtgtt19<210>24<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>24agcgcccaccctctcg16<210>25<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>25cggatggcttcccaaa16<210>26<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>26cagccaccaggcccc15<210>27<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>27gcctttatggattcagggc19<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28ttcatatcccctcagcagag20<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>29cgattccgctacattccaccc21<210>30<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>30caccttgaccctcagcc17<210>31<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>31gcgtctcggaaaccggta18<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>32ttccacaagaaccgcgag18<210>33<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>33ctggcggtgcctgga15當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3