本發(fā)明屬于家蠶品種選育技術(shù)研究領(lǐng)域，尤其涉及一種單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶品系的純合方法。

背景技術(shù)：

家蠶絲作為紡織材料雖然吸濕性好、易于加工、光澤柔和、舒適性佳，但也存在易生折皺、易變黃、易褪色等缺陷，這些缺陷嚴(yán)重制約了絲織產(chǎn)品品質(zhì)的提升和附加值的提高。如果能有效地克服蠶絲這些固有的缺點，將會大大改善蠶絲的品質(zhì)，推動絲綢織物在更高端、更廣泛方面的應(yīng)用。羊毛角蛋白是毛囊中表達(dá)最豐富的蛋白，并且在很大程度上決定了羊毛纖維的特性。研究表明，羊毛中角蛋白相關(guān)蛋白(keratin-associated proteins，KAP)含量越豐富，羊毛的光澤就越好；該蛋白的數(shù)量與含量是決定羊毛品質(zhì)的一個重要因素。2013年，西南大學(xué)趙愛春教授研究小組將羊毛KAP5.4基因成功轉(zhuǎn)入家蠶基因組，該家蠶品種后部絲腺中表達(dá)了含有羊毛KAP蛋白的絲素蛋白，融合蛋白分泌到絲腺形成了含羊毛KAP蛋白的復(fù)合蠶絲，在蠶絲的改性方面做了重要的創(chuàng)新研究。申請人與西南大學(xué)合作進(jìn)行該轉(zhuǎn)羊毛KAP5.4基因家蠶的后期開發(fā)與利用。通過分析，外源轉(zhuǎn)入的KAP5.4基因位于5號染色體。后續(xù)雜交等遺傳分析也表明KAP5.4基因在該家蠶品系中是單基因遺傳(即外源基因為單拷貝插入)，且只位于一條染色體上，KAP5.4基因的基因型為+-。另外，在轉(zhuǎn)羊毛KAP5.4基因家蠶品種的后期培育中，為了提高綜合經(jīng)濟(jì)性狀，通常會結(jié)合雜交、回交等常規(guī)品種培育方式進(jìn)行，這都會使外源轉(zhuǎn)入的KAP5.4基因的基因型為+-，即雜合子，均需要獲得純合品系，以保證后代性狀不發(fā)生分離。

獲得轉(zhuǎn)基因生物純合體(或純合系)的方法多種多樣，這主要根據(jù)前期轉(zhuǎn)基因方法的不同而確定，主要有通過篩選標(biāo)記篩選獲得、設(shè)計特異PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增篩選獲得等。目前，國內(nèi)未見關(guān)于能夠高效篩選出轉(zhuǎn)基因家蠶純合品系的相關(guān)研究報道。使用上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因家蠶純合品系的篩選與培育存在以下一些問題：(1)其他物種的轉(zhuǎn)基因純合系篩選方法不能完全適用于轉(zhuǎn)基因家蠶純合子篩選；(2)技術(shù)要求高，費時、費力又需要消耗大量資金。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶品系的純合方法，該法可高效篩選獲得單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶純合品系，為培育綜合經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因家蠶品種奠定堅實的基礎(chǔ)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶品系的純合方法，采用累代單蛾區(qū)飼養(yǎng)、標(biāo)記基因篩選、雄蛾測交、雌蛾進(jìn)行PCR擴(kuò)增和后期與常規(guī)品種雜交檢測相結(jié)合來進(jìn)行單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶純合品系的篩選。

上述單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶品系的純合方法，按以下步驟操作進(jìn)行：

<1>使用非轉(zhuǎn)基因蠶品種與單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶陽性個體雜交，獲得雜交F1代；

<2>浸酸、催青F1代蠶卵至轉(zhuǎn)青，挑選轉(zhuǎn)入標(biāo)記基因有表達(dá)的蛾區(qū)進(jìn)行飼養(yǎng)；

<3>飼養(yǎng)步驟<2>挑選出的F1代蛾區(qū)至大蠶期，調(diào)查同一蛾圈內(nèi)所有個體標(biāo)記基因表達(dá)分離比，調(diào)查結(jié)束后淘汰不表達(dá)所轉(zhuǎn)入基因的個體，挑選出目的基因有表達(dá)的個體飼養(yǎng)至化蛾，然后雌雄個體自交獲得雜交F2代；

<4>浸酸、催青雜交F2代蠶卵至轉(zhuǎn)青，挑選轉(zhuǎn)入標(biāo)記基因有表達(dá)的蛾圈進(jìn)行飼養(yǎng)，淘汰轉(zhuǎn)入標(biāo)記基因不表達(dá)的蛾圈；

<5>飼養(yǎng)步驟<3>挑選出的F2代蛾圈至大蠶期，調(diào)查同一蛾圈內(nèi)所有個體標(biāo)記基因表達(dá)分離比，調(diào)查結(jié)束后淘汰不表達(dá)所轉(zhuǎn)入基因的個體，挑選出目的基因有表達(dá)的個體飼養(yǎng)至化蛾，然后雌雄個體自交獲得自交F3代；自交結(jié)束后，對應(yīng)的雄蛾再與常規(guī)非轉(zhuǎn)基因品種雌蛾重交獲得測交系，命名為F3代測交，測交系與自交系的各個蛾圈的蠶卵均一一對應(yīng)編號；自交對應(yīng)雌蛾產(chǎn)完卵以后也一一編號，每個雌蛾用剪刀一分為二，一半裝入離心管放-20℃凍存，另一半送檢毒室進(jìn)行常規(guī)檢疫；

<6>浸酸、催青自交F3代和對應(yīng)的測交系蠶卵至轉(zhuǎn)青，通過篩選標(biāo)記篩選，檢測雄蛾的純合性；自交和對應(yīng)測交系標(biāo)記基因表達(dá)率均為100％的蛾圈所對應(yīng)的父本是純合子，保留下該自交蛾圈卵，淘汰任何標(biāo)記基因表達(dá)率不為100％的蛾圈；

<7>選取步驟<6>中保留蛾圈所對應(yīng)的母蛾編號，取出步驟<5>中對應(yīng)編號凍存的離心管，提取其中母蛾的基因組DNA，然后利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果保留對應(yīng)編號的卵；

<8>保留根據(jù)步驟<6>和<7>篩選出父本和母本均為純合子所產(chǎn)下的蛾圈，飼養(yǎng)繼代，篩選出的自交F3代即為該單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶純合品系。

步驟<7>中的特異性引物是根據(jù)外源轉(zhuǎn)入基因在染色體上插入位點上下游的基因組序列以及轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)序列設(shè)計的PCR引物F、R和LR。

轉(zhuǎn)基因家蠶為轉(zhuǎn)羊毛KAP5.4基因家蠶。

步驟<7>中的特異引物包括KAP5.4基因鑒定引物和piggyBac轉(zhuǎn)座子結(jié)合引物，它們分別具有以下堿基序列：

KAP5.4基因鑒定引物：

F：5’-CTGTAGGAGTATCAAGAACGGAGATG-3’，

R：5’-GACAGACAGATATAGGGACAGAGAAAGC-3’；

piggyBac轉(zhuǎn)座子結(jié)合引物：

LR：5’-CAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGC-3’。

針對目前使用篩選標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)基因家蠶純合子周期長、不夠準(zhǔn)確等缺點，以及使用特異PCR引物進(jìn)行檢測篩選技術(shù)要求高、工作量大而集中、試劑耗材等費用高、假陽性檢測結(jié)果導(dǎo)致篩選不正確等不足，發(fā)明人建立了一種單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶品系的純合方法，采用累代單蛾區(qū)飼養(yǎng)、標(biāo)記基因篩選、雄蛾測交、雌蛾進(jìn)行PCR擴(kuò)增和后期與常規(guī)品種雜交檢測相結(jié)合來進(jìn)行單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶純合品系的篩選。該法操作技術(shù)要求低，縮短了獲得基因型純合的轉(zhuǎn)基因家蠶所需的時間(僅需3代即可篩選出純合子、4代可準(zhǔn)確無誤的確定出轉(zhuǎn)基因純合品系)，所得純合品系后代的轉(zhuǎn)基因表達(dá)率均在98％以上(理論值為100％，但因為一些環(huán)境等因素會造成基因沉默等不表達(dá)的情況)。應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)行轉(zhuǎn)羊毛KAP5.4基因家蠶純合品系的篩選和培育，在3代內(nèi)就能篩選出所需的純合系，快速、高效、技術(shù)難度系數(shù)低，大大縮短了育種周期。因此，本發(fā)明可高效篩選獲得單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶純合品系，為轉(zhuǎn)基因家蠶品種的培育提供重要的技術(shù)支撐；若廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因家蠶品種培育研究，可為培育綜合經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因家蠶品種奠定堅實的基礎(chǔ)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的突出優(yōu)點在于：

<1>若僅使用標(biāo)記基因篩選，則只看得到表現(xiàn)型，難以排除雜合子，使自交后代常常分離出陰性個體，難以選育出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因家蠶品種。而本發(fā)明采用標(biāo)記基因篩選再結(jié)合測交測試結(jié)果篩選，將表現(xiàn)型與基因型有機(jī)結(jié)合，可大幅提高轉(zhuǎn)基因純合系篩選的效率。

<2>許多篩選轉(zhuǎn)基因純合系的方法主要利用特異引物對所有親本進(jìn)行PCR檢測，技術(shù)要求高、工作量大。然而，家蠶所產(chǎn)的卵進(jìn)行即時浸酸后，便開始發(fā)育，大約8天就孵化，如果僅利用分子檢測方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因家蠶純合系篩選，8天時間難以完成所有親本檢測；如果將所產(chǎn)的卵進(jìn)行冷藏，待分子檢測的結(jié)果出來后再進(jìn)行下一代的篩選，會大大延長篩選周期。而本發(fā)明利用簡單的測交測試雄性親本的基因型，有效排除了♀(+/+)×♂(+/-)和♀(+/-)×♂(+/-)的交配方式，制20蛾共排除了16蛾，排除率為80％，而且雄性親本不需要再進(jìn)行PCR檢測，使PCR檢測的工作量減為原來的1/10(按傳統(tǒng)方法，制20個蛾圈需要檢測40只蛾，本發(fā)明通過排除只需要檢測4只蛾)，大大減少了分子檢測的工作量和費用。

<3>本發(fā)明能保證篩選出的純合子基因型的純合性。準(zhǔn)確測試出轉(zhuǎn)基因載體的插入位點是開展后續(xù)PCR檢測篩選純合子的前提，這些實驗過程中的多個步驟容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，將導(dǎo)致篩選失敗或錯誤。發(fā)明人也遇到此類問題，設(shè)計的PCR引物要么擴(kuò)增不出來；要么不特異(多次PCR反應(yīng)并電泳檢測，發(fā)現(xiàn)同一樣品可擴(kuò)增出4-5種大小不同的DNA片段)，擴(kuò)增出來的結(jié)果跟預(yù)期的差距很大、難以說明問題。經(jīng)過反復(fù)研究鎖定了本發(fā)明的引物，該引物可擴(kuò)增出目的基因，雖然擴(kuò)增的結(jié)果也不夠理想，尤其是325bp的片段很弱，但是試驗表明它具備特異性。同時，發(fā)明人通過后續(xù)步驟：同一蛾圈內(nèi)除自交留種的14只雌蛾外，其余個體均與非轉(zhuǎn)基因個體雜交(測交)，然后結(jié)合篩選標(biāo)記篩選，依據(jù)調(diào)查的轉(zhuǎn)基因表達(dá)比率，能有效證明前期PCR檢測結(jié)果的正確與否，確保篩選出的純合子準(zhǔn)確無誤。

附圖說明

圖1是本發(fā)明根據(jù)KAP5.4基因在五號染色體上的插入位點設(shè)計PCR引物F、R和LR的擴(kuò)增原理圖。

圖2是不同個體應(yīng)用圖1擴(kuò)增原理擴(kuò)增結(jié)果示意圖。

圖3是應(yīng)用本發(fā)明高效獲得轉(zhuǎn)羊毛KAP5.4基因家蠶純合品系的流程圖。

圖4是轉(zhuǎn)青期調(diào)查標(biāo)記基因(紅色熒光)表達(dá)結(jié)果圖，圖中：A所有個體為陽性，B陽性∶陰性＝1∶1，C陽性∶陰性＝3∶1，箭頭指示熒光信號。

圖5是挑選出的雌蛾基因組的PCR檢測結(jié)果，圖中：泳道M：DL-2000 Marker；泳道1：非轉(zhuǎn)基因蠶品種932；泳道2：932×KAP5 F3 2號雌蛾；泳道3：932×KAP5 F3 5號雌蛾；泳道4：932×KAP5 F3 10號雌蛾；泳道5：932×KAP5 F3 13號雌蛾；箭頭表示目的片段大小。

具體實施方式

單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶品系的純合方法

一、基本操作步驟

<1>使用非轉(zhuǎn)基因蠶品種與單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶陽性個體雜交，獲得雜交F1代；

<2>浸酸、催青F1代蠶卵至轉(zhuǎn)青，挑選轉(zhuǎn)入標(biāo)記基因有表達(dá)的蛾區(qū)進(jìn)行飼養(yǎng)；

<3>飼養(yǎng)步驟<2>挑選出的F1代蛾區(qū)至大蠶期，調(diào)查同一蛾圈內(nèi)所有個體標(biāo)記基因表達(dá)分離比，調(diào)查結(jié)束后淘汰不表達(dá)所轉(zhuǎn)入基因的個體，挑選出目的基因有表達(dá)的個體(基因型為+-)飼養(yǎng)至化蛾，然后雌雄個體自交獲得雜交F2代；

<4>浸酸、催青雜交F2代蠶卵至轉(zhuǎn)青，挑選轉(zhuǎn)入標(biāo)記基因有表達(dá)的蛾圈進(jìn)行飼養(yǎng)，淘汰轉(zhuǎn)入標(biāo)記基因不表達(dá)的蛾圈；

<5>飼養(yǎng)步驟<3>挑選出的F2代蛾圈至大蠶期，調(diào)查同一蛾圈內(nèi)所有個體標(biāo)記基因表達(dá)分離比，調(diào)查結(jié)束后淘汰不表達(dá)所轉(zhuǎn)入基因的個體，挑選出目的基因有表達(dá)的個體(基因型為+-或++)飼養(yǎng)至化蛾，然后雌雄個體自交獲得自交F3代；自交結(jié)束后，對應(yīng)的雄蛾再與常規(guī)非轉(zhuǎn)基因品種雌蛾重交獲得測交系，命名為F3代測交，測交系與自交系的各個蛾圈的蠶卵均一一對應(yīng)編號；自交對應(yīng)雌蛾產(chǎn)完卵以后也一一編號，每個雌蛾用剪刀一分為二，一半裝入離心管放-20℃凍存，另一半送檢毒室進(jìn)行常規(guī)檢疫。例如，自交的1號雌蛾與1號雄蛾產(chǎn)生的卵編為F3代自交1號蛾圈卵；1號雄蛾對應(yīng)的測交編號為F3代測交1號卵；1號雌蛾對應(yīng)的離心管和蛾袋編號均為1號；共制自交和測交種各28個蛾圈；

<6>浸酸、催青自交F3代和對應(yīng)的測交系蠶卵至轉(zhuǎn)青，通過篩選標(biāo)記篩選，檢測雄蛾的純合性；自交和對應(yīng)測交系標(biāo)記基因表達(dá)率均為100％的蛾圈所對應(yīng)的父本是純合子，保留下該自交蛾圈卵，淘汰任何標(biāo)記基因表達(dá)率不為100％的蛾圈；

<7>選取步驟<6>中保留蛾圈所對應(yīng)的母蛾編號，取出步驟<5>中對應(yīng)編號凍存的離心管，提取其中母蛾的基因組DNA，然后利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果保留對應(yīng)編號的卵；其中特異性引物事先根據(jù)外源轉(zhuǎn)入基因在染色體上插入位點上下游的基因組序列以及轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)序列(pBacL轉(zhuǎn)座子臂)設(shè)計的PCR引物F、R和LR。

<8>保留根據(jù)步驟<6>和<7>篩選出父本和母本均為純合子所產(chǎn)下的蛾圈，飼養(yǎng)繼代，篩選出的自交F3代即為該單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶純合品系。

二、分析驗證方法

分析后代是否分離，驗證按本發(fā)明選出的純合品系：催青上述選出的純合系蠶卵至轉(zhuǎn)青，調(diào)查標(biāo)記基因表達(dá)情況，一個蛾圈內(nèi)所有個體均有表達(dá)；繼續(xù)飼養(yǎng)該蛾圈的所有個體至化蛾，自交14蛾留種，剩下的蛾與常規(guī)非轉(zhuǎn)基因蠶品種進(jìn)行雜交并制種，讓這些種孵化至轉(zhuǎn)青，調(diào)查標(biāo)記基因表達(dá)情況，所有自交和雜交的蠶卵均為陽性。

三、轉(zhuǎn)羊毛KAP5.4基因家蠶的應(yīng)用

1.轉(zhuǎn)基因個體篩選方式

羊毛KAP5.4基因是通過piggyBac轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)入家蠶基因組，piggyBac轉(zhuǎn)座載體基本表達(dá)元件如附圖1所示。標(biāo)記基因紅色熒光蛋白(DsRed)基因與目的基因KAP5.4位于同一個轉(zhuǎn)座載體內(nèi)。通過檢測紅色熒光蛋白的表達(dá)與否來判斷是否為轉(zhuǎn)基因個體。紅色熒光蛋白發(fā)出的信號可在裝有相應(yīng)波長濾光片的熒光顯微鏡下檢測。如果為轉(zhuǎn)基因蠶個體，其胚胎發(fā)育后期、小蠶期、大蠶期、蛹期和蛾期的眼睛內(nèi)均能檢測到紅色熒光信號(張陽，轉(zhuǎn)羊毛KAP基因家蠶繭絲改性研究[D].重慶，西南大學(xué)，2013：21-22)。

2.932×KAP5轉(zhuǎn)基因純合品系的獲得

<1>根據(jù)KAP5.4基因在五號染色體上的插入位點設(shè)計PCR引物F、R和LR。

KAP5.4基因鑒定引物：

F：5’-CTGTAGGAGTATCAAGAACGGAGATG-3’(序列表SEQ.ID.No.1)

R：5’-GACAGACAGATATAGGGACAGAGAAAGC-3’(序列表SEQ.ID.No.2)

piggyBac轉(zhuǎn)座子結(jié)合引物：

LR：5’-CAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGC-3’(序列表SEQ.ID.No.3)

注意：不同個體應(yīng)用圖1擴(kuò)增原理擴(kuò)增結(jié)果不同，如圖2所示，非轉(zhuǎn)基因個體可利用F、R擴(kuò)增出染色體上630bp的片段；因轉(zhuǎn)座載體特別大，純合子利用F、R無法擴(kuò)增出全長轉(zhuǎn)座載體片段，所以只能利用R、LR擴(kuò)增出325bp的片段；而雜合子可同時擴(kuò)增出630bp和325bp的片段。

<2>使用常規(guī)非轉(zhuǎn)基因蠶品種932與轉(zhuǎn)羊毛KAP5.4基因家蠶(命名為KAP5)陽性個體雜交，獲得932×KAP5 F1代，大蠶期調(diào)查其轉(zhuǎn)基因表達(dá)情況。在本次調(diào)查中932×KAP5 F1代所有個體均檢測到了紅色熒光，說明其親本的雜交方式為非轉(zhuǎn)基因♀(-/-)×轉(zhuǎn)基因♂(+/+)，所獲得的F1代基因型為轉(zhuǎn)基因+/-。

<3>調(diào)查轉(zhuǎn)基因表達(dá)情況結(jié)束后淘汰陰性個體(本次調(diào)查中沒有發(fā)現(xiàn))，挑選出陽性個體(其基因型為+/-)，飼養(yǎng)至化蛾，然后雌雄個體自交獲得932×KAP5 F2。

<4>浸酸、催青932×KAP5 F2蠶卵至轉(zhuǎn)青，挑選檢測到紅色熒光信號的蛾圈進(jìn)行飼養(yǎng)，淘汰檢測不到紅色熒光信號的蛾圈。

<5>飼養(yǎng)挑選出的932×KAP5 F2至大蠶期，調(diào)查同一蛾圈內(nèi)所有個體標(biāo)記基因表達(dá)分離比，調(diào)查結(jié)束后淘汰陰性的個體(基因型為-/-)，挑選出轉(zhuǎn)基因陽性個體(其基因型為+/-或+/+)。在本次試驗中調(diào)查了多個蛾圈，932×KAP5 F2同一個蛾區(qū)內(nèi)轉(zhuǎn)基因陽性個體與陰性個體的比率均為或接近3∶1的比率，符合孟德爾單基因遺傳分離比。

<6>飼養(yǎng)挑選出的932×KAP5 F2陽性個體至化蛾，然后雌雄個體自交獲得932×KAP5 F3。自交結(jié)束后，對應(yīng)的雄蛾再與常規(guī)非轉(zhuǎn)基因品種雌蛾重交獲得測交系，命名為932×KAP5測交，測交系與自交系的各個蛾圈均一一對應(yīng)編號；自交對應(yīng)雌蛾產(chǎn)完卵以后也一一編號，每個雌蛾用剪刀一分為二，一半裝入離心管放-20℃凍存，另一半送檢毒室進(jìn)行常規(guī)的檢疫。例如，自交的1號雌與1號雄產(chǎn)生的卵編為自交1號蛾圈；1號雄對應(yīng)的測交編號為932×KAP5 F3測交1號；1號雌對應(yīng)的離心管和蛾袋編號均為1號。共制得合格的自交和測交種各20個蛾圈。

<7>浸酸、催青932×KAP5 F3和對應(yīng)的測交系蠶卵至轉(zhuǎn)青，通過熒光顯微鏡篩選，可以調(diào)查出一個蛾圈內(nèi)陽性與陰性的比率，由此推測出雄蛾的純合性。自交和對應(yīng)測交系熒光表達(dá)率均為100％的蛾圈所對應(yīng)的父本是純合子，保留下該蛾圈，淘汰任何熒光表達(dá)率不為100％的蛾圈。調(diào)查結(jié)果見圖4和表1。

表1 932×KAP5 F3和對應(yīng)的測交蠶卵轉(zhuǎn)青期熒光篩查結(jié)果

<8>選取步驟<7>中保留蛾圈所對應(yīng)的母蛾編號，取出對應(yīng)編號凍存的離心管中的蛾(2、5、10、13號蛾)，提取并純化其中母蛾的基因組DNA作為模板，然后利用步驟<1>的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過檢測可以判斷該雌蛾是否為純合子。另同時提取非轉(zhuǎn)基因蠶品種932母蛾基因組，作為對照。擴(kuò)增引物為F、R、LR三個引物組合進(jìn)行，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，63℃40s，72℃50s(30個循環(huán))；72℃10min；4℃保存至電泳檢測。檢測使用1％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行。結(jié)果見圖5。從圖5可以看出對照932擴(kuò)增出了一條630bp的片段；932×KAP5 F3 2號、5號和10號雌蛾擴(kuò)增出了一條630bp和325bp的片段，說明為雜合子；932×KAP5 F3 13號雌蛾擴(kuò)增出了一條325bp的片段，說明為純合子。但擴(kuò)增效果不是很好，特別是325bp的片段檢測信號很弱，但通過該結(jié)果可進(jìn)一步排除表現(xiàn)型為♀(+/-)×♂(+/+)的后代。

<9>保留13號蛾產(chǎn)下的卵，飼養(yǎng)繼代。

3.分析驗證

通過分析后代分離情況，驗證13號蛾：催青13號蛾產(chǎn)下的蠶卵至轉(zhuǎn)青，在熒光顯微鏡下觀看熒光蛋白表達(dá)情況，一個蛾圈內(nèi)所有個體均有表達(dá)。繼續(xù)飼養(yǎng)該蛾圈的所有個體至化蛾，自交14蛾留種，為932×KAP5 F4。剩下的所有蛾分別與常規(guī)非轉(zhuǎn)基因蠶品種進(jìn)行雜交并制種(9KAP5 F4測交)，讓這些種孵化至轉(zhuǎn)青，在熒光顯微鏡下觀看熒光表達(dá)信號，所有自交和雜交的蠶卵均能表達(dá)熒光蛋白標(biāo)記基因。證明13號雌蛾和雄蛾均為純合子的，所產(chǎn)的后代也是純合子，由此可確立為轉(zhuǎn)基因KAP5.4基因家蠶純合品系，可與經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良的非轉(zhuǎn)基因蠶品種雜交制備一代雜交生產(chǎn)用種。

4.對照

對照品系僅使用篩選標(biāo)記篩選，連續(xù)累代單蛾飼養(yǎng)篩選至第六代均未獲得純合品系。各代的轉(zhuǎn)基因表達(dá)率(同一蛾區(qū)內(nèi)轉(zhuǎn)基因個體與整個蛾區(qū)所有個體的比值)見表2。從表2可以看出，僅使用篩選標(biāo)記篩選進(jìn)行該轉(zhuǎn)基因家蠶的選育具有盲目性，不夠準(zhǔn)確，即使使用上一代轉(zhuǎn)基因表達(dá)率為100％的蛾區(qū)進(jìn)行傳代，下一代依然會分離。

表2僅使用篩選標(biāo)記進(jìn)行篩選選育932×KAP5各個世代的轉(zhuǎn)基因表達(dá)率

發(fā)明人同時應(yīng)用上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)羊毛角蛋白4.3基因家蠶品種純合品系的篩選研究，同樣獲得了成功。另外，因KAP3.2的在家蠶基因組中的插入位點尚未確定，無法設(shè)計特異引物測試該品系雌蛾的純合性，但采用累代單蛾區(qū)飼養(yǎng)、標(biāo)記基因篩選、雄蛾測交和后期與常規(guī)品種雜交檢測相結(jié)合來進(jìn)行轉(zhuǎn)羊毛角蛋白3.2基因家蠶純合品系的篩選，也取得了一定的結(jié)果。說明該發(fā)明可廣泛應(yīng)用于單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶純合品系的篩選。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站

西南大學(xué)

<120> 單拷貝轉(zhuǎn)基因家蠶品系的純合方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

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