本發(fā)明涉及一種用于評(píng)價(jià)嗜酸乳桿菌免疫調(diào)節(jié)作用的方法及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

益生乳酸菌是一群能夠粘附于宿主腸道后通過(guò)定植作用改變宿主某一部位菌群組成，從而對(duì)宿主發(fā)揮多種有益作用的活的微生物。研究表明，其在維持腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能、降低血清膽固醇和預(yù)防及抑制腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮著重要的作用，是維持機(jī)體健康必不可少的生理菌群之一。腸道正常菌群紊亂會(huì)導(dǎo)致口服免疫耐受喪失，甚至?xí)鹣到y(tǒng)性的超敏反應(yīng)，這些細(xì)菌是胃腸道或系統(tǒng)免疫穩(wěn)態(tài)維持不可缺少的重要組成部分。國(guó)內(nèi)外已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)體內(nèi)的多種乳酸菌可對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，嗜酸乳桿菌(NCFM)作為研究的一種模式菌株，能夠調(diào)節(jié)宿主特異性及非特異性免疫反應(yīng)，且可能對(duì)局部細(xì)胞因子分泌以及局部免疫反應(yīng)有影響。

目前普遍認(rèn)為嗜酸乳桿菌(NCFM)需經(jīng)吸附、定植至腸道上皮細(xì)胞，然后發(fā)揮益生及免疫調(diào)節(jié)作用。Caco-2細(xì)胞體外吸附試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蛣?dòng)物(小鼠)益生菌體內(nèi)灌胃試驗(yàn)?zāi)Ｐ褪窃u(píng)價(jià)免疫調(diào)節(jié)作用常用的研究方法。Caco-2細(xì)胞在特定體外培養(yǎng)條件下可自發(fā)進(jìn)行上皮樣分化形成緊密連接，其形態(tài)學(xué)、結(jié)構(gòu)功能、標(biāo)志酶的功能表達(dá)等都與小腸上皮細(xì)胞類似，因而被廣泛應(yīng)用于乳酸菌的腸道粘附評(píng)估和藥物等物質(zhì)腸道吸收代謝實(shí)驗(yàn)中。小鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣t更加直觀的評(píng)價(jià)嗜酸乳桿菌(NCFM)免疫調(diào)節(jié)作用的效果。

現(xiàn)階段對(duì)嗜酸乳桿菌免疫調(diào)節(jié)作用的評(píng)價(jià)主要依據(jù)《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》中所規(guī)定的臟器/體重比值、細(xì)胞免疫功能測(cè)定、體液免疫功能測(cè)定、巨噬細(xì)胞功能測(cè)定和NK細(xì)胞活性測(cè)定相關(guān)方法，但僅僅依據(jù)某一檢測(cè)指標(biāo)的陽(yáng)性或陰性結(jié)果來(lái)判斷是否具有免疫調(diào)節(jié)作用對(duì)全面、有效、整體化的評(píng)價(jià)有一定局限性。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確的通過(guò)確定和檢測(cè)與免疫調(diào)節(jié)功能緊密相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子來(lái)評(píng)價(jià)嗜酸乳桿菌免疫調(diào)節(jié)作用的方法顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于評(píng)價(jià)嗜酸乳桿菌免疫調(diào)節(jié)作用的方法，采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于評(píng)價(jià)嗜酸乳桿菌免疫調(diào)節(jié)作用的方法，該方法是對(duì)與免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因的動(dòng)態(tài)變化情況進(jìn)行檢測(cè)；所述差異表達(dá)基因包括：上調(diào)的免疫相關(guān)基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和下調(diào)的免疫相關(guān)基因CXCR4。

優(yōu)選地，所述方法是利用Real Time RT-PCR對(duì)與免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因的動(dòng)態(tài)變化情況進(jìn)行檢測(cè)；所述差異表達(dá)基因包括：上調(diào)的免疫相關(guān)基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和下調(diào)的免疫相關(guān)基因CXCR4。

更優(yōu)選地，所述的方法，其特征在于，步驟如下：

1)將嗜酸乳桿菌與宿主細(xì)胞共培養(yǎng)后提取宿主細(xì)胞的總RNA，或?qū)⑹人崛闂U菌菌懸液給受體食用后提取受體的腸組織的總RNA，獲得總RNA；

2)利用步驟1)所得的總RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，根據(jù)差異表達(dá)基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和CXCR4的特異性上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行Real Time RT-PCR檢測(cè)，分析各個(gè)所述差異表達(dá)基因在mRNA水平的表達(dá)情況。

優(yōu)選地，步驟1)所述嗜酸乳桿菌為嗜酸乳桿菌NCFM。

優(yōu)選地，步驟1)所述宿主細(xì)胞，為Caco-2細(xì)胞；優(yōu)選地，當(dāng)宿主細(xì)胞為Caco-2細(xì)胞時(shí)，步驟2)所述GAPDH的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.1-2所示；所述CCL2的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.3-4所示；所述CCL20的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.5-6所示；所述IL1α的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.7-8所示；所述IL1β的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.9-10所示；所述IL6ST的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.11-12所示；所述IL8的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.13-14所示；所述PTX3的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.15-16所示；所述TNFRSF9的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.17-18所示；所述CXCR4的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.19-20所示。

優(yōu)選地，步驟1)所述受體，為小鼠；當(dāng)受體為小鼠時(shí)，步驟2)所述GAPDH的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.21-22所示；所述CCL2的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.23-24所示；所述CCL20的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.25-26所示；所述IL1α的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.27-28所示；所述IL1β的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.29-30所示；所述IL6ST的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.31-32所示；所述IL8的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.33-34所示；所述PTX3的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.35-36所示；所述TNFRSF9的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.37-38所示；所述CXCR4的特異性上、下游引物如SEQ ID NO.39-40所示。

優(yōu)選地，步驟2)所述差異表達(dá)基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和CXCR4的篩選方法為：通過(guò)對(duì)嗜酸乳桿菌NCFM作用后的腸道細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，根據(jù)基因表達(dá)譜分析的結(jié)果，利用Gene Ontology分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選得到的。

優(yōu)選地，步驟2)所述Real Time RT-PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，10s預(yù)變性；95℃，5s；60℃，34s，40個(gè)循環(huán)。

優(yōu)選地，所述評(píng)價(jià)嗜酸乳桿菌具有免疫調(diào)節(jié)作用的判定方法，是基因CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9表達(dá)上調(diào)且基因CXCR4表達(dá)下調(diào)。

本發(fā)明還提供了一種上述任一方法在評(píng)價(jià)乳酸菌免疫調(diào)節(jié)作用中的應(yīng)用。

本發(fā)明有益效果：

本發(fā)明根據(jù)嗜酸乳桿菌(NCFM)免疫調(diào)節(jié)相關(guān)研究結(jié)果，提供了一種可以快速有效的評(píng)價(jià)嗜酸乳桿菌免疫調(diào)節(jié)作用的方法，該方法只需要檢測(cè)九種免疫相關(guān)基因就可以評(píng)估嗜酸乳桿菌的免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)利用Real Time PCR(RT-PCR)可以實(shí)現(xiàn)快速評(píng)估，大大節(jié)約時(shí)間；本發(fā)明還針對(duì)Caco-2細(xì)胞和小鼠細(xì)胞為受體的情況下，分別設(shè)計(jì)了進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)的特異性引物，在小鼠試驗(yàn)中以及Caco-2細(xì)胞中均得到了較好的驗(yàn)證。本發(fā)明克服了現(xiàn)有的嗜酸乳桿菌免疫調(diào)節(jié)功能評(píng)價(jià)的不足，可以客觀評(píng)價(jià)嗜酸乳桿菌對(duì)宿主的免疫調(diào)節(jié)作用。

附圖說(shuō)明

圖1為Caco-2細(xì)胞的形態(tài)(×400)。

圖2為總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖；

(1，對(duì)照：無(wú)NCFM作用Caco-2細(xì)胞；2，NCFM作用Caco-2細(xì)胞2h)。

圖3 Real Time RT-PCR檢測(cè)免疫相關(guān)基因的擴(kuò)增曲線。

圖4總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖；

(1，對(duì)照：無(wú)NCFM作用Caco-2細(xì)胞)；2，3，4，5分別為嗜酸乳桿菌NCFM作用Caco-2細(xì)胞2、4、8和12h)。

圖5 Real Time RT-PCR檢測(cè)免疫相關(guān)基因表達(dá)的擴(kuò)增曲線；

(1，2，3，4分別為嗜酸乳桿菌NCFM作用于Caco-2細(xì)胞2、4、8和12h)。

圖6嗜酸乳桿菌NCFM作用后Caco-2細(xì)胞相關(guān)免疫基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化；

(A，CCL2；B，CCL20；C，IT1α；D，IL1β；E，IL6ST；F，IL8；G，PTX3；H，TNFRSF9；ICXCR4)。

圖7總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖；

(1：對(duì)照；2,，3，4，5分別為嗜酸乳桿菌NCFM對(duì)小鼠灌胃1、3、5和7天)。

圖8 Real Time RT-PCR檢測(cè)免疫相關(guān)基因的擴(kuò)增曲線；

(A，B，C，D分別為嗜酸乳桿菌NCFM作用于小鼠1、3、5和7天后的擴(kuò)增曲線)

圖9嗜酸乳桿菌NCFM作用后小鼠腸組織細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化；

(A，CCL2；B，CCL20；C，IT1α；D，IL1β；E，IL6ST；F，IL8；G，PTX3；H，TNFRSF9；ICXCR4)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、基因芯片

嗜酸乳桿菌NCFM由丹麥丹尼斯克公司(Danisco)惠贈(zèng)。

人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。

昆明系小白鼠購(gòu)自黑龍江省醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

基因芯片：Affymetrix公司的U133Plus2.0基因表達(dá)譜芯片，由上海生物芯片有限公司-生物芯片上海國(guó)家工程研究中心提供，該芯片涵蓋47000個(gè)轉(zhuǎn)錄本，代表38500個(gè)人類基因。

1.2 人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2的培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，在37℃下用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液于5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液。

1.3 篩選確定免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因

采用Affymetrix公司的U133 Plus 2.0表達(dá)譜芯片對(duì)嗜酸乳桿菌NCFM作用后Caco-2細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析，該芯片涵蓋47000個(gè)轉(zhuǎn)錄本，代表38500個(gè)人類基因?；蛐酒苽浼半s交反應(yīng)和芯片掃描均嚴(yán)格按照Affymetrix基因表達(dá)譜芯片操作指南進(jìn)行。

為了進(jìn)一步分析嗜酸乳桿菌NCFM對(duì)機(jī)體免疫相關(guān)基因的調(diào)控作用及其機(jī)制，根據(jù)基因芯片雜交結(jié)果，利用GO分類標(biāo)準(zhǔn)篩選嗜酸乳桿菌作用后Caco-2細(xì)胞中差異表達(dá)的免疫相關(guān)基因。差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)是基因變化(change)為I或MI，log ration≥1，實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)值(Detection)為P的為上調(diào)基因；change為D或MD，log ratio≤-1，Detection為P的為下調(diào)基因。具體篩選步驟如下：

1.打開基因芯片雜交結(jié)果對(duì)應(yīng)的GO分類附表文件，hs-go-resuLt.xls，全選該表以后在菜單上選擇自動(dòng)篩選；

2.選擇自動(dòng)篩選以后，點(diǎn)擊“immune response”旁邊的小三角形，選擇篩選條件＝1；

3.程序會(huì)自動(dòng)將所有該列值為1的探針號(hào)列出，選擇整張數(shù)據(jù)表，將其復(fù)制后粘貼到一個(gè)新的EXCEL文件中，將此時(shí)生成的新表稱為條件表；

4.打開需要做篩選的數(shù)據(jù)表，點(diǎn)擊探針列后選擇高級(jí)篩選；

5.程序會(huì)自動(dòng)跳出一個(gè)高級(jí)篩選的條件對(duì)話框，點(diǎn)擊條件區(qū)域，準(zhǔn)備填寫篩選條件；

6.切換到條件表后選擇探針序列，點(diǎn)擊確定；

7.EXCEL會(huì)自動(dòng)將數(shù)據(jù)表根據(jù)條件表的探針I(yè)D號(hào)進(jìn)行篩選，僅顯示在條件表內(nèi)出現(xiàn)ID號(hào)的探針，此時(shí)篩選的基因即為免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因。

1.4 Real Time RT-PCR方法驗(yàn)證基因芯片結(jié)果

1.4.1 嗜酸乳桿菌NCFM作用后的Caco-2細(xì)胞總RNA的提取

Caco-2細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)16～17天后達(dá)到極化狀態(tài)。嗜酸乳桿菌NCFM在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整菌濃度為3×108cfu/mL，與極化狀態(tài)的Caco-2細(xì)胞在37℃、5％CO2條件下作用2h，之后用4℃PBS緩沖液對(duì)嗜酸乳桿菌NCFM作用組(實(shí)驗(yàn)組)和無(wú)嗜酸乳桿菌NCFM作用組(對(duì)照組)的Caco-2細(xì)胞沖洗3次。

參用標(biāo)準(zhǔn)的Trizol RNA提取方法抽提實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的Caco-2細(xì)胞總RNA。

1.4.2 RNA完整性和純度的檢測(cè)

1.4.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

將待檢測(cè)的RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用ExScriptTM RT PCR試劑盒(TaKaRa公司)中的反轉(zhuǎn)錄部分進(jìn)行RT反應(yīng)，具體反轉(zhuǎn)錄體系中試劑的名稱及用量如下：

反轉(zhuǎn)錄過(guò)程為：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)37℃，15min；反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)85℃，5s。

1.4.4 Real Time RT-PCR方法驗(yàn)證芯片結(jié)果

對(duì)提取出的Caco-2細(xì)胞總RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后進(jìn)行Real Time RT-PCR反應(yīng)，針對(duì)待檢測(cè)基因GAPDH、CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和CXCR4，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)各基因特異性上下游引物，見表1。

表1 待測(cè)基因Real Time RT-PCR引物的堿基序列、基因定位、Tm值及擴(kuò)增產(chǎn)物的大小

利用ExScriptTM RT-PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系為20μL，具體試劑名稱及用量如下：

使用ABI/7500系統(tǒng)進(jìn)行各基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序如下：95℃，10s預(yù)變性；95℃，5s；60℃，34s，40個(gè)循環(huán)。每種基因的PCR反應(yīng)均進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線分析，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和純度。各基因表達(dá)比較均采用GAPDH作為內(nèi)參基因，所有待測(cè)樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)，并用去離子水代替模板作為陰性對(duì)照。分析各基因的Ct值，計(jì)算出標(biāo)化后的-△△Ct值，利用2-△△Ct法對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行評(píng)估。

1.4.5 免疫相關(guān)基因動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的體外研究

Caco-2細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)16～17天后，達(dá)到極化狀態(tài)。經(jīng)嗜酸乳桿菌NCFM(3×108cfu/mL)作用2、4、8和12h后，按1.4.1提取細(xì)胞總RNA。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及過(guò)程同1.4.3，引物設(shè)計(jì)、Real Time RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同1.4.4，通過(guò)分析各基因的Ct值，計(jì)算出標(biāo)化后的-△△Ct值，利用2-△△Ct法對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行評(píng)估。

1.5 免疫相關(guān)基因動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的體內(nèi)研究

1.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用昆明屬小鼠(清潔級(jí)，雌雄各半，鼠齡8周左右，體重20±2g)，隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組(灌服滅菌脫脂乳)、灌服嗜酸乳桿菌NCFM 1d、3d、5d和7d組。培養(yǎng)嗜酸乳桿菌NCFM至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并按表2以滅菌脫脂乳將嗜酸乳桿菌配成濃度為3×10⁹cfu/mL的含菌脫脂乳懸液，每日一次灌服給各實(shí)驗(yàn)組小鼠。

表2 實(shí)驗(yàn)分組及飼喂方式

1.5.2 小鼠腸組織RNA的提取

頸椎離斷處死小鼠，打開腹腔，取回腸和結(jié)腸，置于預(yù)冷的生理鹽水溶液中，沖洗干凈腸內(nèi)容物后，迅速置于液氮中保存。參用標(biāo)準(zhǔn)的Trizol RNA提取方法抽提小鼠腸組織RNA.

1.5.3 Real Time RT-PCR檢測(cè)免疫相關(guān)基因的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

對(duì)提取出的小鼠腸組織RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后進(jìn)行Real Time RT-PCR反應(yīng)，針對(duì)待檢測(cè)基因GAPDH、CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、IL6ST、IL8、PTX3、TNFRSF9和CXCR4，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)各基因特異性上下游引物(見表3)。

表3 待測(cè)基因Real Time RT-PCR引物的堿基序列、基因定位、Tm值及擴(kuò)增產(chǎn)物的大小

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及過(guò)程同1.4.3，Real Time RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同1.4.4，通過(guò)分析各基因的Ct值，計(jì)算出標(biāo)化后的-△△Ct值，利用2-△△Ct法對(duì)目的基因表達(dá)量進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

由圖1可以看出，Caco-2細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液，5天傳代。連續(xù)培養(yǎng)16～17天后，細(xì)胞可達(dá)極化狀態(tài)。此時(shí)，細(xì)胞緊密連接，與小腸上皮細(xì)胞類似，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 免疫相關(guān)基因的篩選確定

實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)利用涵蓋47 000個(gè)轉(zhuǎn)錄本，代表38 500個(gè)人類基因的人基因表達(dá)譜芯片雜交分析檢測(cè)了嗜酸乳桿菌NCFM作用2h后Caco-2細(xì)胞的基因表達(dá)變化情況。對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌NCFM作用2h后Caco-2細(xì)胞的差異表達(dá)基因?yàn)?08個(gè)，包括473個(gè)基因上調(diào)和35個(gè)基因下調(diào)。

利用Gene Ontology分類(GO分類)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌NCFM作用后可誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞中趨化因子及其受體、白細(xì)胞介素類細(xì)胞因子以及腫瘤壞死因子受體等基因的表達(dá)變化，這些基因都與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。表4列出了嗜酸乳桿菌NCFM作用后Caco-2細(xì)胞免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化情況。

表4 嗜酸乳桿菌NCFM對(duì)Caco-2細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

↑代表上調(diào)表達(dá)，↓代表下調(diào)表達(dá)

2.3 Real Time RT-PCR方法驗(yàn)證芯片結(jié)果

2.3.1 Caco-2細(xì)胞中總RNA的質(zhì)量檢測(cè)

對(duì)提取的Caco-2細(xì)胞總RNA進(jìn)行260nm和280nm處的OD值檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，并計(jì)算OD260/OD280的比值，結(jié)果如表5。由檢測(cè)結(jié)果可以看出，RNA純度較高、蛋白質(zhì)污染較低，Trozol法可以獲得高質(zhì)量的RNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表5 RNA樣品的純度及濃度檢測(cè)

經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，由圖2可以看出，18s RNA和28s RNA電泳條帶清晰，28s RNA條帶無(wú)明顯降解。說(shuō)明總RNA質(zhì)量較好，可以用于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 Real Time RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證基因芯片的準(zhǔn)確性，我們以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用Real TimeRT-PCR方法對(duì)篩選出的免疫相關(guān)基因在mRNA表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中免疫相關(guān)基因和GAPDH基因mRNA表達(dá)的擴(kuò)增曲線重合度良好，均呈現(xiàn)出典型的“S”型，見圖3。

通過(guò)分析嗜酸乳桿菌NCFM作用于Caco-2細(xì)胞后免疫相關(guān)基因擴(kuò)增曲線的Ct值，我們利用2-ΔΔCt法，以GAPDH擴(kuò)增曲線的Ct值消除本底模板差異后，對(duì)Caco-2細(xì)胞中免疫相關(guān)基因受嗜酸乳桿菌NCFM作用后mRNA表達(dá)水平的變化進(jìn)行量化。通過(guò)表4可以看出，嗜酸乳桿菌NCFM作用后Caco-2細(xì)胞中免疫相關(guān)基因表達(dá)的Real Time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，與基因芯片的相應(yīng)分析結(jié)果基本一致。

2.4 免疫相關(guān)基因動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的體外研究

2.4.1 Caco-2細(xì)胞的總RNA質(zhì)量檢測(cè)

抽提的Caco-2細(xì)胞總RNA經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，18s RNA和28sRNA電泳條帶清晰，28s RNA條帶無(wú)明顯降解(見圖4)。說(shuō)明總RNA質(zhì)量完好，可進(jìn)行RealTime RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 Real Time RT-PCR檢測(cè)免疫相關(guān)基因的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

為進(jìn)一步檢測(cè)嗜酸乳桿菌NCFM作用于Caco-2細(xì)胞后誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，我們利用嗜酸乳桿菌NCFM分別與Caco-2細(xì)胞共同培養(yǎng)2、4、8和12h，然后采用Real Time RT-PCR方法對(duì)免疫相關(guān)基因的表達(dá)在mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，并以管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，結(jié)果如圖5所示。通過(guò)圖5可以看出，嗜酸乳桿菌NCFM與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)2、4、8和12h后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中免疫相關(guān)基因和GAPDH基因mRNA表達(dá)的擴(kuò)增曲線重合度良好，均呈現(xiàn)出典型的“S”型。

通過(guò)分析嗜酸乳桿菌NCFM作用于Caco-2細(xì)胞不同時(shí)間后免疫相關(guān)基因擴(kuò)增曲線的Ct值，我們利用2-ΔΔCt法，以GAPDH擴(kuò)增曲線的Ct值消除本底模板差異后，對(duì)Caco-2細(xì)胞中免疫相關(guān)基因受嗜酸乳桿菌NCFM作用后在mRNA表達(dá)水平的變化進(jìn)行量化。如圖6所示，除上調(diào)基因IL6ST的表達(dá)一直呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)和下調(diào)基因CXCR4的表達(dá)一直呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)外，隨著嗜酸乳桿菌NCFM作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其他基因的表達(dá)均呈現(xiàn)出先增加后減小的規(guī)律，而且均在第4h時(shí)基因的表達(dá)出現(xiàn)最大值；嗜酸乳桿菌NCFM作用后，免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化只有CCL2、CCL20、IL1α、IL1β、PTX3和TNFRSF9基因與對(duì)照組相比差異顯著(p<0.05)，其中CCL2基因的表達(dá)變化在作用第4h時(shí)與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)；趨化因子CCL2和CCL20基因的表達(dá)量與白細(xì)胞介素類細(xì)胞因子IL1α和IL1β的表達(dá)量相比存在一定的差異，趨化因子在嗜酸乳桿菌NCFM作用后的表達(dá)量基本上大于細(xì)胞介素類細(xì)胞因子，尤其是在作用第4小時(shí)時(shí)，表達(dá)量的差異更大。

2.5 免疫相關(guān)基因動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的體內(nèi)研究

2.5.1 小鼠腸組織總RNA的質(zhì)量檢測(cè)

小鼠腸組織總RNA經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，18s RNA和28s RNA電泳條帶清晰，28s RNA條帶無(wú)明顯降解(見圖7)，說(shuō)明總RNA質(zhì)量完好，可進(jìn)行Real Time RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

2.5.2 Real Time RT-PCR檢測(cè)免疫相關(guān)基因的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

為了進(jìn)一步驗(yàn)證嗜酸乳桿菌NCFM作用后免疫相關(guān)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化的體外研究結(jié)果，我們每天以一定濃度(3×10⁹cfu/mL)的嗜酸乳桿菌NCFM菌懸液對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，灌胃1、3、5和7天后處死小鼠，取腸道組織，然后采用Real Time RT-PCR方法檢測(cè)小鼠腸組織免疫相關(guān)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，結(jié)果如圖8所示，嗜酸乳桿菌NCFM灌胃后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的小鼠腸組織中免疫相關(guān)基因和GAPDH基因mRNA表達(dá)的擴(kuò)增曲線重合度良好，均呈現(xiàn)出典型的“S”型。

通過(guò)分析嗜酸乳桿菌NCFM對(duì)小鼠灌胃不同時(shí)間后免疫相關(guān)基因表達(dá)的擴(kuò)增曲線Ct值，我們利用2-ΔΔCt法，以GAPDH擴(kuò)增曲線的Ct值消除本底模板差異后，對(duì)小鼠腸組織中免疫相關(guān)基因受嗜酸乳桿菌NCFM作用后在mRNA表達(dá)水平的變化進(jìn)行量化，結(jié)果見圖9。從圖中可以看出，隨著嗜酸乳桿菌NCFM作用時(shí)間的延長(zhǎng)，除下調(diào)基因CXCR4基因的表達(dá)量增加外，其他基因的表達(dá)均呈現(xiàn)出先增加后減小的規(guī)律，其中CCL2、CCL20、IL1α、IL1β和PTX3基因在灌胃后第5天出現(xiàn)最大值，而IL6ST、IL8和TNFRSF9基因表達(dá)出現(xiàn)峰值是在灌胃后第3天；免疫相關(guān)基因中只有CCL2、CCL20、IL1β和TNFRSF9基因的表達(dá)量與對(duì)照組相比差異顯著(p<0.05)。

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