本發(fā)明涉及一種分子探針、試劑盒及該分子探針的應(yīng)用，具體涉及一種轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的分子探針、試劑盒及該分子探針的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：前列腺癌(Prostatecancer,PCa)是嚴(yán)重威脅男性健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在歐美國(guó)家高居首位，死亡率居第二位。近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人口老齡化加重和飲食結(jié)構(gòu)改變，PCa的發(fā)病率和死亡率已逐年增長(zhǎng)。2015年最新癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示PCa已成為泌尿男性生殖系統(tǒng)發(fā)病率和死亡率最高、增長(zhǎng)率最快的惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者5年的生存率僅34％。PCa正在加速影響著我國(guó)老年男性的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命。由于PCa迥異的生物學(xué)行為及復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，以術(shù)前前列腺特異性抗原(Prostate-specificantigen,PSA)、GS(GleasonScore)評(píng)分及臨床TNM分期建立的PCa風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估并不能準(zhǔn)確反映PCa患者個(gè)體生物學(xué)信息。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為只有腫瘤突破包膜才開始向全身進(jìn)展，而PCa早期就可以發(fā)生微轉(zhuǎn)移。因此，尋找與PCa轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的生物標(biāo)記物迫在眉睫。近年來(lái)，隨著腫瘤病因?qū)W和分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，人們逐步認(rèn)識(shí)到腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多通路、多環(huán)節(jié)、多層次、高度復(fù)雜但可控的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，并與促癌基因及抑癌基因的活性密切相關(guān)。檢測(cè)外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells,CTCs)在監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、確定腫瘤分子特征及判斷預(yù)后等方面有重要應(yīng)用價(jià)值。CTCs的本質(zhì)是存在于外周循環(huán)的各類腫瘤細(xì)胞，由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血。外周血中的CTCs會(huì)發(fā)生主動(dòng)或被動(dòng)的凋亡，只有小部分CTCs能存活下來(lái)進(jìn)而通過(guò)血行轉(zhuǎn)移的方式發(fā)展成為新的轉(zhuǎn)移灶。CTCs的出現(xiàn)早于腫瘤轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)，提示癌癥轉(zhuǎn)移可能由CTCs導(dǎo)致。但大部分CTCs在外周循環(huán)中發(fā)生凋亡，或被吞噬，只有少數(shù)發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶。檢測(cè)這部分能形成轉(zhuǎn)移灶的CTCs數(shù)目在泌尿外科腫瘤治療中有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)CTCs的形成與上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)有關(guān)。CTCs富集效果直接決定著后續(xù)檢測(cè)的靈敏度，目前常規(guī)方法根據(jù)原理分為基于細(xì)胞生物化學(xué)特性的富集法和基于細(xì)胞物理學(xué)特性的富集法?；诩?xì)胞生物化學(xué)特性的富集法主要有免疫磁珠富集法(immunomagneticseparation,IMS)和粘附富集法。其中，IMS是一種高效、高靈敏度的CTCs富集方法。CTCs表面上皮粘附分子(EpCAM)能與鏈接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，使CTCs具有磁性并能滯留在磁場(chǎng)中。將免疫磁珠富集法與常規(guī)檢測(cè)技術(shù)(如免疫細(xì)胞化學(xué)法，流式細(xì)胞術(shù)RT-PCR等)相結(jié)合，可大大提高外周血樣本中CTCs的濃度從而提高檢出率。IMS需借助CTC表面EpCAM的表達(dá)，從而導(dǎo)致該方法僅適用于有限的癌種。粘附富集法基于CTCs與捕獲表面的親和作用，捕獲表面通過(guò)一定的生物化學(xué)修飾獲得了與CTCs的親和力。該方法可以在靜態(tài)或者常用的連續(xù)微流控芯片模式下進(jìn)行分離富集。在靜態(tài)分離模式中，樣本首先在捕獲表面上孵育一段時(shí)間。隨后，未粘附的細(xì)胞被沖洗掉，而CTCs將被吸附在捕獲表面。由于轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞更傾向于侵入骨基質(zhì)等膠原性的組織，因此這個(gè)方法被用來(lái)捕獲具有較高侵襲性的CTCs?；诩?xì)胞物理學(xué)特性的富集法主要有膜過(guò)濾富集法、梯度密度富集法和OncoQuick富集法。其中，膜過(guò)濾富集法的原理是基于細(xì)胞大小及機(jī)械性能進(jìn)行過(guò)濾。將血標(biāo)本通過(guò)5-10μm孔徑的濾膜可將CTC富集。對(duì)循環(huán)腫瘤微栓子(CTM)的富集效果比基于免疫學(xué)原理的富集法有優(yōu)勢(shì)，但會(huì)有小部分腫瘤細(xì)胞因直徑小于濾膜孔徑而丟失，導(dǎo)致該方法的靈敏度偏低。梯度密度富集法的原理是基于血液中各種細(xì)胞密度差別，用分層液將腫瘤細(xì)胞和單核細(xì)胞與其他細(xì)胞層分離。這種方法操作簡(jiǎn)單，但該分離方法要求的血標(biāo)本量較大(通常15-30ml)，且靈敏度和特異度均較低。OncoQuick富集法利用一種內(nèi)置多孔屏障的50ml專用試管，在進(jìn)行離心之前將15-30ml的全血平鋪于多孔膜上，通過(guò)離心將腫瘤細(xì)胞從其他細(xì)胞中分離出來(lái)進(jìn)而達(dá)到CTC富集的目的。該方法在分離過(guò)程中有可能丟失少量細(xì)胞，而且一旦血液抗凝不完全則存在于微小血凝塊中的腫瘤細(xì)胞可能沉降至梯度密度液的底部。目前，前列腺癌的檢測(cè)方法主要有影像學(xué)檢查法、血清學(xué)檢測(cè)法和病理活檢監(jiān)測(cè)。用于前列腺癌診斷的影像學(xué)檢查主要有超聲、MR和PET-CT為基礎(chǔ)的擴(kuò)展技術(shù)。超聲技術(shù)是前列腺癌診斷最古老最廣泛應(yīng)用的技術(shù)。B超能夠較好區(qū)分前列腺區(qū)帶，因?yàn)锽超下外周帶回聲比中央帶和移行帶較強(qiáng)。黑白超聲技術(shù)能良好地分辨低回聲病灶，經(jīng)直腸黑白超聲技術(shù)隨機(jī)系統(tǒng)穿刺聯(lián)合低回聲病灶穿刺奠定了前列腺穿刺診斷的基礎(chǔ)(HodgeKK,McnealJE,StameyTA.Ultrasoundguidedtransrectalcorebiopsiesofthepalpablyabnormalprostate.[J].JUrol,1989,142(1):66-70；HodgeKK,McNealJE,TerrisMK,StameyTA.Randomsystematicversusdirectedultrasoundguidedtransrectalcorebiopsiesoftheprostate.[J]JUrol.1989；142(1):71–74.)。但是B超和黑白超聲技術(shù)中一些良性疾病如前列腺炎、前列腺增生也會(huì)顯示為低回聲病灶。早期前列腺癌周圍大量的良性腺體回聲掩蓋會(huì)導(dǎo)致其顯示為等回聲而難以檢測(cè)出來(lái)(UkimuraO,FaberK,GillIS.Intraprostatictargeting.CurrOpinUrol.2012；22(2):97–103.)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，60％的超聲病灶是良性病變，21-47％的前列腺癌在初次穿刺活檢中漏診(LochT,EppelmannU,LehmannJ,WullichB,LochA,StockleM.Transrectalultrasoundguidedbiopsyoftheprostate:randomsextantversusbiopsiesofsono-morphologicallysuspiciouslesions.WorldJUrol.2004；22(5):357–360；SinghH,CantoEI,ShariatSF,etal.Predictorsofprostatecancerafterinitialnegativesystematic12corebiopsy.JUrol.2004；171(5):1850–1854；TairaAV,MerrickGS,GalbreathRW,etal.Performanceoftransperinealtemplate-guidedmappingbiopsyindetectingprostatecancerintheinitialandrepeatbiopsysetting.ProstateCancerProstaticDis.2010；13(1):71–77.)。此外，隨機(jī)系統(tǒng)穿刺方法既不是腫瘤特異性也不是患者個(gè)性化的診斷方法，有時(shí)診斷出臨床無(wú)意義的前列腺癌，有時(shí)又低估了前列腺癌的Gleason評(píng)分(TairaAV,MerrickGS,GalbreathRW,etal.Performanceoftransperinealtemplate-guidedmappingbiopsyindetectingprostatecancerintheinitialandrepeatbiopsysetting.ProstateCancerProstaticDis.2010；13(1):71–77；ZaytounOM,MoussaAS,GaoT,FareedK,JonesJS.Ofcebasedtransrectalsaturationbiopsyimprovesprostatecancerdetectioncomparedtoextendedbiopsyintherepeatbiopsypopulation.JUrol.2011；186(3):850–854；IsariyawongseBK,SunL,BanezLL,etal.SignifcantdiscrepanciesbetweendiagnosticandpathologicGleasonsumsinprostatecancer:thepredictiveroleofageandprostate-specifcantigen.Urology.2008；72(4):882–886.)。多普勒超聲能夠檢測(cè)血流信號(hào)，而腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程為滿足營(yíng)養(yǎng)需要常常發(fā)生局部血流增加。但是其局限性在于，多普勒超聲對(duì)于直徑<0.1mm血管分辨率極為有限(UkimuraO,FaberK,GillIS.Intraprostatictargeting.CurrOpinUrol.2012；22(2):97–103.),而腫瘤生長(zhǎng)恰恰以直徑10–50μm的新生血管為主。因此，多普勒超聲所檢測(cè)的也是較晚期Gleason級(jí)別較高的前列腺癌。超聲造影能夠檢測(cè)腫瘤進(jìn)展過(guò)程中血管生成和新生血管紊亂引起的微血管密度變化(RussoG,MischiM,ScheepensW,delaRosetteJJ,WijkstraH.Angiogenesisinprostatecancer:onset,progressionandimaging.BJUInt.2012；110(11ptC):E794–E808.)，但對(duì)大血管的分辨率存在局限。多參數(shù)核磁共振(mpMRI)包含解剖序列T2加權(quán)像和至少兩個(gè)功能序列彌散加權(quán)像和動(dòng)態(tài)造影增強(qiáng)像。mpMRI具有較好的分辨率，能夠分辨組織差異識(shí)別前列腺癌，在前列腺癌初診、復(fù)發(fā)、分期及轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)發(fā)揮重要作用。但其昂貴的費(fèi)用極大限制了其廣泛應(yīng)用，而且也不能進(jìn)行實(shí)時(shí)顯像，技術(shù)操作也需要大量的培訓(xùn)學(xué)習(xí)。mpMRI融合超聲技術(shù)結(jié)合了兩者的優(yōu)點(diǎn)，在前列腺癌診斷上更加精確，但增加了mpMRI的費(fèi)用，其培訓(xùn)難度較mpMRI亦更加困難。因此，也不可能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用。基于PET的影像技術(shù)，目前有18F-FDG代表的代謝靶向PET，還有18-FACBC代表的增殖靶向PET，PSMA代表的報(bào)告子靶向PET。PET用于前列腺癌初診較少，臨床上主要用于分期、生化復(fù)發(fā)和局部復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移灶檢測(cè)。根據(jù)靶向指標(biāo)的不同，PET可以精確到每個(gè)腺體信息進(jìn)而明確分期，但其缺點(diǎn)在于費(fèi)用昂貴和輻射暴露。血清學(xué)檢測(cè)應(yīng)用于前列腺癌診斷、轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的研究報(bào)道眾多。PSA是研究報(bào)道最多的生物標(biāo)記物，其除作為常規(guī)的前列腺癌篩查分子以外，還具有治療評(píng)價(jià)和預(yù)后判斷的重要作用(SmithMR,KabbinavarF,SaadF,etal.Naturalhistoryofrisingserumprostate-specifcantigeninmenwithcastratenonmetastaticprostatecancer.JClinOncol.2005；23(13):2918–2925；Acontemporaryprognosticnomogramformenwithhormone-refractorymetastaticprostatecancer:aTAX327studyanalysis.ClinCancerRes.2007；13(21):6396–6403.)。治療后PSA水平與疾病總體生存密切相關(guān)?；A(chǔ)PSA和動(dòng)態(tài)PSA變化如PSA倍增時(shí)間、PSA增速等與前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。(SmithMR,KabbinavarF,SaadF,etal.Naturalhistoryofrisingserumprostate-specifcantigeninmenwithcastratenonmetastaticprostatecancer.JClinOncol.2005；23(13):2918–2925；D’AmicoAV,CoteK,LofredoM,RenshawAA,SchultzD.Determinantsofprostatecancer-specifcsurvivalafterradiationtherapyforpatientswithclinicallylocalizedprostatecancer.JClinOncol.2002；20(23):4567–4573；PoundCR,PartinAW,EisenbergerMA,ChanDW,PearsonJD,WalshPC.NaturalhistoryofprogressionafterPSAelevationfollowingradicalprostatec-tomy.JAMA.1999；281(17):1591–1597；VickersAJ,BrewsterSF.PSAvelocityanddoublingtimeindiagnosisandprog-nosisofprostatecancer.BrJMedSurgUrol.2012；5(4):162–168；ChunFK,BrigantiA,GallinaA,etal.Prostate-specifcantigenimprovestheabilityofclinicalstageandbiopsyGleasonsumtopredictthepathologicstageatradicalprostatectomyinthenewmillennium.EurUrol.2007；52(4):1067–1074；SchellhammerPF,ChodakG,WhitmoreJB,SimsR,FrohlichMW,KantofPW.Lowerbaselineprostate-specifcantigenisassociatedwithagreateroverallsurvivalbeneftfromsipuleucel-TintheImmunotherapyforProstateAdenocarcinomaTreatment(IMPACT)trial.Urology.2013；81(6):1297–1302)。但是PSA只具有器官特異性，不具有腫瘤特異性，不少良性疾病也能引起PSA的動(dòng)態(tài)變化。此外，不少研究報(bào)道PCA3和ERG也與前列腺癌的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)，監(jiān)測(cè)其血清表達(dá)水平變化能夠預(yù)測(cè)前列腺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。然而，這些血清學(xué)標(biāo)志物的特異性和/或敏感性并不太理想。主要原因可能在于現(xiàn)有的血清腫瘤標(biāo)志物在前列腺癌的轉(zhuǎn)移中并不是關(guān)鍵的驅(qū)動(dòng)基因。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、涉及多種信號(hào)通路的生物學(xué)過(guò)程，目前研究的腫瘤血清標(biāo)志物可能僅限于在某一步驟或某一通路發(fā)揮作用，但在多信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用未得而知。病理活檢監(jiān)測(cè)前列腺癌轉(zhuǎn)移的缺點(diǎn)則在于活檢創(chuàng)傷大，在深部病灶穿刺不方便?；顧z組織的穿刺獲取通常需要影像學(xué)手段輔助，因此穿刺也僅限于影像學(xué)能檢測(cè)的病灶，也就是說(shuō)穿刺并不能對(duì)早期微轉(zhuǎn)移做出診斷預(yù)測(cè)。而且，活檢具備一定的感染、出血等并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道，2.67％的前列腺穿刺患者因穿刺嚴(yán)重的相關(guān)并發(fā)癥住院治療(GaylisF,NasseriR,FinkL,etal.ProstateBiopsyComplications:ADualAnalysis.[J].Urology,2016,93:135-140.)。上述前列腺癌的檢測(cè)方法存在如下缺陷：常見(jiàn)的影像學(xué)手段，通過(guò)獲取解剖學(xué)信息及代謝信息，對(duì)腫瘤的大小(>0.2cm的腫瘤病灶)以及腫瘤的代謝進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)而判斷腫瘤的現(xiàn)狀，然后，這往往需要等到腫瘤具備一定的體積才能夠被發(fā)現(xiàn)，因此，存在一定的滯后性，除此以外，因?yàn)檩椛涞陌踩詥?wèn)題，也不能夠長(zhǎng)期多次使用。而血清學(xué)方面，它通過(guò)腫瘤蛋白標(biāo)志物來(lái)反映腫瘤的狀態(tài)，所以特異性和敏感性還較低。至于病理學(xué)手段，能夠準(zhǔn)確的獲取腫瘤的基因信息，然后，它依托于有創(chuàng)的腫瘤組織樣本，因?yàn)閷?duì)于晚期沒(méi)有辦法獲得組織的樣本的患者來(lái)說(shuō)存在一定的限制性。因此，有必要尋找前列腺癌的新檢測(cè)方法。目前已存在一些關(guān)于CRMPs的研究。CRMPs家族有CRMP1-5五個(gè)成員。文獻(xiàn)報(bào)道在肺癌細(xì)胞的一些亞系中CRMP1低表達(dá)提示疾病預(yù)后差，與疾病進(jìn)展(P＝0.010)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＝0.043)、術(shù)后早期復(fù)發(fā)(P＝0.030)、生存時(shí)間短(P＝0.016)有關(guān)。此后，他又發(fā)現(xiàn)了CRMP-1的新異構(gòu)體LCRMP-1。序列分析顯示其外顯子1的氮端序列與CRMP-1不同，但外顯子2-14的碳端序列卻完全相同。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)LCRMP-1表達(dá)也與非小細(xì)胞肺癌患者的臨床結(jié)局和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。LCRMP-1通過(guò)增強(qiáng)偽足形成促進(jìn)腫瘤侵襲性的能力可被CRMP-1拮抗，這一現(xiàn)象提示LCRMP-1和CRMP-1在調(diào)節(jié)癌癥細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中具有相反的功能。一方面，LCRMP-1增強(qiáng)偽足形成，穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞遷移，侵襲力。這一過(guò)程需要LCRMP-1高度保守的氮端區(qū)域穩(wěn)定及WAVE-1參與。它還可能通過(guò)作用于Rho家族蛋白Cdc42。Cdc42蛋白與肌動(dòng)蛋白重組相關(guān)。另一方面，CRMP1通過(guò)打斷LCRMP1和WAVE-1相互作用而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移(PanSH,ChaoYC,ChenHY,etal.Longformcollapsinresponsemediatorprotein-1(LCRMP-1)expressionisassociatedwithclinicaloutcomeandlymphnodemetastasisinnon-smallcelllungcancerpatients.[J].LungCancer,2010,67(1):93-100；ShihJY,YangSC,HongTM,etal.Collapsinresponsemediatorprotein-1andtheinvasionandmetastasisofcancercells.[J].JNatlCancerInst,2001,93(18):1392-1400；PanSH,ChaoYC,HungPF,etal.TheabilityofLCRMP-1topromotecancerinvasionbyenhancingfilopodiaformationisantagonizedbyCRMP-1.[J].JClinInvest,2011,121(8):3189-3205.)。Hiroshima等(HiroshimaY,NakamuraF,MiyamotoH,etal.CollapsinResponseMediatorProtein4ExpressionisAssociatedwithLiverMetastasisandPoorSurvivalinPancreaticCancer.[J].AnnSurgOncol,2013,Suppl3:S369-78.)的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)亞型CRMP4的表達(dá)增加與胰腺癌肝轉(zhuǎn)移較差的臨床預(yù)后有關(guān)，表現(xiàn)為促癌基因。QuinnCC等(QuinnCC,ChenE,KinjoTG,etal.TUC-4b,anovelTUCfamilyvariant,regulatesneuriteoutgrowthandassociateswithvesiclesinthegrowthcone.[J].JNeurosci,2003,23(7):2815-2823.)的研究也發(fā)現(xiàn)，75kDa的CRMP4的長(zhǎng)亞型(TUC-4BCRMP4b)和短亞型CRMP4a(TUC-4A)在軸突生長(zhǎng)中也具有相反功能。因此，一個(gè)可能的解釋就是CRMP4具有剪接異構(gòu)體，在胰腺癌肝轉(zhuǎn)移過(guò)程中體現(xiàn)了CRMP4b長(zhǎng)亞型的特性。LaureDuplan等(DuplanL,BernardN,CasseronW.etal.CollapsinResponseMediatorProtein4a(CRMP4a)IsUpregulatedinMotoneuronsofMutantSOD1MiceandCanTriggerMotoneuronAxonalDegenerationandCellDeath.JNeurosci.2010,13；30(2):785-96.)也通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)報(bào)道CRMP4存在CRMP4a和CRMP4b兩種亞型。4a型在氨基酸N末端13aa區(qū)域與4b氨基酸N末端126aa區(qū)域不同編碼，屬于鏈異構(gòu)。并證實(shí)CRMP4a能正向調(diào)節(jié)并促發(fā)小鼠突變型SOD1運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突變性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種具有較高準(zhǔn)確性、敏感性和特異性的轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的分子探針和試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于提供上述轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的分子探針的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的分子探針，其包含LCRMP4探針，所述LCRMP4探針的序列如SEQIDNO:8所示。LCRMP4是塌陷反應(yīng)介導(dǎo)蛋白4(collaspsinresponsemediatorprotein4,CRMP4)的異構(gòu)體。LCRMP4的N端127個(gè)氨基酸不同于CRMP4，而CRMP4除N端13個(gè)氨基酸外，14-570aa與LCRMP4的128-684aa完全相同。LCRMP4探針能夠特異性的區(qū)別CRMP4長(zhǎng)短鏈RNA異構(gòu)體，特異性檢測(cè)編碼LCRMP4蛋白的mRNA。我們的研究顯示，CRMP4在正常前列腺組織和局限性PCa組織中表達(dá)較高，且兩組間無(wú)表達(dá)差異，在轉(zhuǎn)移性PCa組織中表達(dá)明顯降低，體外侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)CRMP4轉(zhuǎn)染后能夠抑制PCa細(xì)胞的侵襲能力，并且在臨床組織樣本中證實(shí)CRMP4在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，提示CRMP4可能為PCa轉(zhuǎn)移抑制基因。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CRMP4的異構(gòu)體LCRMP4在前列腺癌中發(fā)揮與CRMP4相反的腫瘤生物學(xué)功能，即LCRMP4促進(jìn)前列腺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。在前列腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)LCRMP4明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，并且能夠維持激素非依賴性的前列腺癌LNCaP細(xì)胞在去勢(shì)狀態(tài)下顯著增長(zhǎng)。此外，細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)LCRMP4明顯促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移侵襲能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LCRMP4促進(jìn)前列腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制是調(diào)控經(jīng)典的β-catenin信號(hào)通路，并且這種調(diào)控作用不依賴于WNT配體的激活。此外，AR受體為前列腺癌發(fā)生、進(jìn)展的重要蛋白，LCRMP4能夠促進(jìn)AR向細(xì)胞核內(nèi)移位進(jìn)而促進(jìn)AR靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。裸鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了LCRMP4促進(jìn)前列腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。LCRMP4是與前列腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，其表達(dá)量的高低與前列腺癌的分級(jí)及轉(zhuǎn)移程度密切相關(guān)。將其作為轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的探針時(shí)檢測(cè)結(jié)果具有較高準(zhǔn)確性、敏感性和特異性。作為本發(fā)明所述轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的分子探針的優(yōu)選實(shí)施方式，所述分子探針還包含上皮標(biāo)志物、間質(zhì)標(biāo)志物和CD45探針；所述上皮標(biāo)志物由EpCAM探針、CK8探針、CK18探針和CK19探針組成，所述間質(zhì)標(biāo)志物由Vimentin探針和Twist探針組成；其中，所述EpCAM探針的序列如SEQIDNO:1所示，CK8探針的序列如SEQIDNO:2所示，CK18探針的序列如SEQIDNO:3所示，CK19探針的序列如SEQIDNO:4所示，Vimentin探針的序列如SEQIDNO:5所示，Twist探針的序列如SEQIDNO:6所示，CD45探針的序列如SEQIDNO:7所示。Twist是一種高度保守的堿性螺旋.環(huán).螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族重要成員，在動(dòng)物與人類的胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵調(diào)控作用。在動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中，Twist作為轉(zhuǎn)錄因子在誘導(dǎo)細(xì)胞移動(dòng)及組織塑形中起主要作用。最近研究表明，Twist在表皮一間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)換調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，Twist過(guò)表達(dá)在腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成與腫瘤細(xì)胞耐藥中發(fā)揮重要作用。Twist能通過(guò)多種途徑引起腫瘤的發(fā)生，目前已在多種人類上皮來(lái)源腫瘤中發(fā)現(xiàn)Twist表達(dá)增高，并與患者預(yù)后關(guān)系密切。另外，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒，為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒，其包含上述轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的分子探針。LCRMP4在前列腺癌中發(fā)揮促癌作用并與前列腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，將其用于轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒中，得到的試劑盒也可以對(duì)轉(zhuǎn)移性前列腺癌進(jìn)行早期預(yù)測(cè)，且結(jié)果具有較高準(zhǔn)確性、敏感性和特異性。作為本發(fā)明所述轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒為原位雜交檢測(cè)試劑盒，所述LCRMP4探針、EpCAM探針、CK8探針、CK18探針、CK19探針、Vimentin探針、Twist探針和CD45探針均帶有標(biāo)記物。更優(yōu)選地，所述試劑盒為RNA原位雜交檢測(cè)試劑盒。在原位雜交檢測(cè)試劑盒中，上述探針均用作雜交探針。RNA原位雜交技術(shù)是運(yùn)用cRNA或寡核苷酸等探針檢測(cè)細(xì)胞和組織內(nèi)RNA表達(dá)的一種原位雜交技術(shù)。其基本原理是：在細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)保持不變的條件下，用標(biāo)記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對(duì)原則，與待測(cè)細(xì)胞或組織中相應(yīng)的基因片段相結(jié)合(雜交)，所形成的雜交體(Hybrids)經(jīng)顯色反應(yīng)后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位雜交技術(shù)應(yīng)用的領(lǐng)域已遠(yuǎn)超出DNA原位雜交技術(shù)。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已成為最有效的分子病理學(xué)技術(shù)，同時(shí)在分析低豐度和罕見(jiàn)的mRNA表達(dá)方面具有優(yōu)勢(shì)。利用CTCs的RNA原位雜交技術(shù)檢測(cè)LCRMP4表達(dá)水平，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)前列腺癌患者轉(zhuǎn)移，其敏感性達(dá)95.5％，特異性達(dá)91.7％。能夠以較少創(chuàng)傷的CTCs液體活檢技術(shù)早期預(yù)測(cè)前列腺癌轉(zhuǎn)移；并且該方法采用的是抽血檢測(cè)，創(chuàng)傷小并發(fā)癥少，能夠檢測(cè)臨床影像學(xué)所不能檢測(cè)出來(lái)的腫瘤微轉(zhuǎn)移。作為本發(fā)明所述轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述標(biāo)記物為放射性核素或非放射性標(biāo)記物；更優(yōu)選地，所述非放射性標(biāo)記物為生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化酶或熒光素。標(biāo)記物可按照本
技術(shù)領(lǐng)域：
的常規(guī)方式進(jìn)行選擇，當(dāng)以熒光素作為標(biāo)記物時(shí)，上皮標(biāo)志物、間質(zhì)標(biāo)志物、CD45探針和LCRMP4探針上所帶的是不同顏色的熒光標(biāo)記。作為本發(fā)明所述轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒還包含透化劑、消化液、雜交緩沖溶液、預(yù)擴(kuò)增工作液、擴(kuò)增工作液、顯色液和復(fù)染液。作為本發(fā)明所述轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述消化液由PBS(磷酸鹽緩沖液)和消化酶組成；所述雜交緩沖溶液包含曲拉通和甲酰胺；所述預(yù)擴(kuò)增工作液由擴(kuò)增緩沖溶液和預(yù)擴(kuò)增探針組成；所述擴(kuò)增工作液由擴(kuò)增液和擴(kuò)增探針組成；所述顯色液由顯色緩沖液和顯色探針組成；所述復(fù)染液為4',6-二脒基-2-苯基吲哚。作為本發(fā)明所述轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述預(yù)擴(kuò)增探針由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:8所示序列組成；所述擴(kuò)增探針由SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:8所示序列組成；所述顯色探針由SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:8所示序列組成。其中，SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15為上皮標(biāo)志物(EpCAM探針、CK8探針、CK18探針和CK19探針)的DNA探針，SEQIDNO:10、SEQIDNO:13和SEQIDNO:16為間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin探針和Twist探針)的DNA探針，SEQIDNO:11、SEQIDNO:14和SEQIDNO:17為CD45的DNA探針。作為本發(fā)明所述轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述擴(kuò)增緩沖溶液、擴(kuò)增液和顯色緩沖液均包含下述組分：馬血清30％(w/w)，1.5％十二烷基硫酸鈉(w/w)，3mMTris-HCl，所述Tris-HCl的pH值為8.0。作為本發(fā)明所述轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒還包含洗滌液。本發(fā)明采用原位雜交的方法對(duì)轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)，采用原位雜交的方法時(shí)，上述試劑盒具體的使用方法為：(1)采集外周血，進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，然后離心和固定，最后進(jìn)行脫水，得到待測(cè)樣品；(2)將所得待測(cè)樣品進(jìn)行親水及透化處理，再進(jìn)行消化，然后與探針雜交、擴(kuò)增；(3)顯色及鏡檢。最后，本發(fā)明還提供了上述分子探針在制備用于轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒中的應(yīng)用。作為本發(fā)明所述應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒為原位雜交檢測(cè)試劑盒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供了一種新的轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的探針組和試劑盒，該探針組和試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)移性前列腺癌進(jìn)行早期預(yù)測(cè)時(shí)，準(zhǔn)確性、敏感性和特異性均較高。本發(fā)明轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒可為原位雜交檢測(cè)試劑盒，尤其是RNA原位雜交檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明通過(guò)CTCs檢測(cè)技術(shù)(Surexam益善)，采用分子病理學(xué)中液態(tài)活檢方式，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤患者血液中CTC及其分型；設(shè)計(jì)與轉(zhuǎn)移性PCa密切相關(guān)的LCRMP4基因檢測(cè)探針，采用多重RNA原位雜交檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)CTCs中LCRMP4基因的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析建立術(shù)前預(yù)測(cè)PCa患者是否存在轉(zhuǎn)移。利用CTCs的RNA原位雜交技術(shù)檢測(cè)LCRMP4表達(dá)水平，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)前列腺癌患者轉(zhuǎn)移，其敏感性達(dá)95.5％，特異性達(dá)91.7％。能夠以較少創(chuàng)傷的CTCs液體活檢技術(shù)早期預(yù)測(cè)前列腺癌轉(zhuǎn)移。此外，本發(fā)明還具有如下優(yōu)點(diǎn)：1.本發(fā)明檢測(cè)樣本為患者血液，可根據(jù)患者病情治療狀況多次采集標(biāo)本，避免了傳統(tǒng)的組織穿刺，創(chuàng)傷小，并發(fā)癥少，并且本發(fā)明的檢測(cè)方法微創(chuàng)、安全、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，能夠把臨床影像學(xué)隱匿性的轉(zhuǎn)移檢測(cè)出來(lái)。2.本發(fā)明的檢測(cè)方法自動(dòng)化、方便快捷：CTC提取采用儀器自動(dòng)化，能夠批量操作檢測(cè)。附圖說(shuō)明圖1為利用CTCs的RNA原位雜交技術(shù)檢測(cè)LCRMP4表達(dá)水平的流程圖；圖2為CTCs鑒定及分型方法檢測(cè)結(jié)果圖；圖3為L(zhǎng)CRMP4在CTCs中表達(dá)的結(jié)果圖；圖4為CTCs行RNA原位雜交檢測(cè)預(yù)測(cè)前列腺癌(淋巴結(jié)/骨)轉(zhuǎn)移ROC分析結(jié)果圖；圖5為CTCs行RNA原位雜交檢測(cè)預(yù)測(cè)前列腺癌淋巴轉(zhuǎn)移ROC分析分析結(jié)果圖；圖6為CTCs行RNA原位雜交檢測(cè)預(yù)測(cè)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移ROC分析分析結(jié)果圖。具體實(shí)施方式為更好地說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將以RNA原位雜交檢測(cè)CTCs中LCRMP4基因的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析術(shù)前預(yù)測(cè)PCa患者是否存在轉(zhuǎn)移為例，并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。下述實(shí)施例中，LCRMP4探針用于原位雜交檢測(cè)中，但需指出的是，LCRMP4探針也可用于其他轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒中；同時(shí)，在下述實(shí)施例中，采用的是原位熒光雜交的方法，故雜交探針上的標(biāo)記物為熒光素；但標(biāo)記物并不限于熒光素，我們可以根據(jù)實(shí)際需要，根據(jù)采用的檢測(cè)選擇適合的標(biāo)記物。實(shí)施例1本發(fā)明轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的探針組的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的探針組包含上皮標(biāo)志物、間質(zhì)標(biāo)志物、CD45探針和LCRMP4探針；所述上皮標(biāo)志物由EpCAM探針、CK8探針、CK18探針和CK19探針組成，所述間質(zhì)標(biāo)志物由Vimentin探針和Twist探針組成；其中，所述EpCAM探針的序列如SEQIDNO:1所示，CK8探針的序列如SEQIDNO:2所示，CK18探針的序列如SEQIDNO:3所示，CK19探針的序列如SEQIDNO:4所示，Vimentin探針的序列如SEQIDNO:5所示，Twist探針的序列如SEQIDNO:6所示，CD45探針的序列如SEQIDNO:7所示，LCRMP4探針的序列如SEQIDNO:8所示。所述探針的具體序列如下表1所示。表1實(shí)施例2本發(fā)明轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述轉(zhuǎn)移性前列腺癌早期預(yù)測(cè)的試劑盒為原位雜交檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含：雜交探針、透化劑、消化液、雜交緩沖溶液、預(yù)擴(kuò)增工作液、擴(kuò)增工作液、顯色液、復(fù)染液和洗滌液；其中，所述雜交探針為實(shí)施例1所述探針組，所述LCRMP4探針、EpCAM探針、CK8探針、CK18探針、CK19探針、Vimentin探針、Twist探針和CD45探針上均帶有標(biāo)記物；上皮標(biāo)志物(EpCAM探針、CK8探針、CK18探針和CK19探針)帶紅色熒光標(biāo)記；間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin探針和Twist探針)帶綠色熒光標(biāo)記；LCRMP4探針帶紫色熒光標(biāo)記；CD45探針帶藍(lán)色熒光標(biāo)記。所述消化液由PBS和消化酶組成；所述雜交緩沖溶液由以下成分組成：10％硫酸葡聚糖、10mmol/LNaCl、50％甲酰胺、0.1％焦磷酸鈉、0.2％聚乙烯基吡咯啉、0.2％FICOLL、5mmol/LEDTA二鈉、0.1％TritonX-100、50mmol/LTris-HCl；所述預(yù)擴(kuò)增工作液由擴(kuò)增緩沖溶液和預(yù)擴(kuò)增探針組成；所述擴(kuò)增工作液由擴(kuò)增液和擴(kuò)增探針組成，所述顯色液由顯色緩沖液和顯色探針組成；其中，所述預(yù)擴(kuò)增探針由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:8所示序列組成；所述擴(kuò)增探針由SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:8所示序列組成；所述顯色探針由SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:8所示序列組成；所述擴(kuò)增緩沖溶液、擴(kuò)增液和顯色緩沖液均包含下述組分：馬血清30％(w/w)，十二烷基硫酸鈉1.5％(w/w)，3mMTris-HCl，所述Tris-HCl的pH值為8.0；所述SEQIDNO:9～SEQIDNO:17的具體序列見(jiàn)表2。所述復(fù)染液為4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。表2SEQIDNO:9CGCAGCCTCAGCCSEQIDNO:10GACGGTCGGCGTTSEQIDNO:11GCGCGCTGTAGGGSEQIDNO:12CCCAGACCCTACCSEQIDNO:13GTCACCGCTCCACSEQIDNO:14AGGCGAGGGGAGASEQIDNO:15CTACAAACAAACAATATTSEQIDNO:16CTTCTCAATAACTAACATSEQIDNO:17CTTTATACCTTTCTTTCA實(shí)施例3本實(shí)施例采用實(shí)施例2所述試劑盒、利用CTCs的RNA原位雜交技術(shù)檢測(cè)LCRMP4表達(dá)水平，以對(duì)轉(zhuǎn)移性前列腺癌進(jìn)行預(yù)測(cè)。本實(shí)施例利用CTCs的RNA原位雜交技術(shù)檢測(cè)LCRMP4表達(dá)水平的流程如圖1所示。的具體步驟如下：一、臨床樣本收集及處理a、采集外周血：1、用EDTA抗凝采血管采集5mL外周血，每位患者采集2管(公10mL)；2、采血后顛倒采血管5次以上充分混勻后于4℃保存，保存時(shí)間不超過(guò)4小時(shí)；3、記錄患者對(duì)應(yīng)編號(hào)，用連通器將采血管內(nèi)的血液轉(zhuǎn)入樣本保存管(含紅細(xì)胞裂解液)。b、紅細(xì)胞裂解：1、將樣本保存管上下顛倒混勻10次，室溫(15-30℃)靜置30min裂解，室溫低于15℃時(shí)裂解時(shí)間延長(zhǎng)至1小時(shí)；2、室溫裂解的紅細(xì)胞如不能及時(shí)處理，可保存于4℃，保存時(shí)間不超過(guò)8小時(shí)。c、離心和固定：1、將樣本以1850rpm(600×g)離心5min,棄上清；2、依次加入4mLPBS和1mL固定劑(用于樣本預(yù)處理的固定)，渦旋混勻，室溫靜置8min。d、抽濾再固定：1、檢查過(guò)濾器是否完好，是否有濾膜，將過(guò)濾器固定到真空歧板上；2、打開真空泵，使負(fù)壓上升至-0.06MPa(此步驟在樣本固定期間完成)；3、將樣本保存管中的液體轉(zhuǎn)移至過(guò)濾器中，打開二通閥門，將樣本抽濾至過(guò)濾器中的濾膜上，完成過(guò)濾后關(guān)閉閥門，過(guò)濾器中加入1mL樣本固定液，固定1h。e、脫水及保存：依次用1mL50％脫水劑、100％脫水劑浸泡處理，每次浸泡2min，處理結(jié)束后，將樣本放入-20℃冰箱可保存兩周，或放入-80℃冰箱可保存6個(gè)月。二、CTCs樣本分型檢測(cè)a、親水及透化：1、依次用400uL100％乙醇、70％乙醇、50％乙醇浸泡處理，各2min；2、加入1-2mLPBS洗滌三次，每次浸泡2min；3、將濾膜倒扣在100uL的透化劑上，室溫孵育5min；4、加入1-2mLPBS洗滌三次，每次浸泡2min。b、消化：1、將濾膜倒扣在100uL的消化液(590uLPBS+10uL消化酶)上，室溫孵育1h；2、加入1-2mLPBS洗滌三次，每次浸泡2min。c、探針雜交：1、將濾膜倒扣在100uL的雜交液(84uL雜交緩沖液+16uL雜交探針)上，40℃孵育3h；2、加入1-2mL洗滌液(即探針洗滌液)洗滌三次，每次浸泡2min。d、擴(kuò)增：1、將濾膜倒扣在預(yù)擴(kuò)增工作液(90uL擴(kuò)增緩沖液+10uL預(yù)擴(kuò)增探針)上，40℃孵育30min；2、加入1-2mL洗滌液(即探針洗滌液)洗滌三次，每次浸泡2min；3、將濾膜倒扣在100uL的擴(kuò)增工作液(90uL擴(kuò)增液+10uL擴(kuò)增探針)上，40℃孵育30min；2、加入1-2mL洗滌液(即探針洗滌液)洗滌三次，每次浸泡2min。e、顯色及鏡檢：1、將濾膜倒扣在100uL的顯色液(90uL顯色緩沖液+10uL顯色探針上，40℃孵育30min；2、加入1-2mL洗滌液(即探針洗滌液)洗滌三次，每次浸泡2min；3、濾膜正面朝上置于載玻片上，用刀片沿鐵圈內(nèi)環(huán)濾膜割下。4、加10uL復(fù)染液，蓋上18mm×18mm的蓋撥片，直接鏡檢或放入-20℃冰箱保存。三、CTCs鏡檢流程圖a、開機(jī)：開啟電腦；開啟顯微鏡開關(guān)(顯微鏡左下方的開關(guān))；開啟熒光電源；啟動(dòng)軟件(左鍵雙擊桌面“Metafer4”軟件)b、20倍掃描：左鍵單擊setup，選擇surexam01-CTC-20×程序拍攝；拍攝完成后選擇1和3區(qū)域的細(xì)胞，“RejectUndefined”去除未選擇的細(xì)胞。(每張片約5分鐘)c、40倍DAPI拍攝：左鍵單擊setup，選擇surexam01-CTC-40×-DAPI程序拍攝；40倍DAPI拍攝完成后選擇核紋清晰的細(xì)胞，“RejectUndefined”去除未選擇的細(xì)胞。(每張片約2分鐘)d、40倍熒光信號(hào)拍攝：左鍵單擊setup，選擇surexam01-CTC-40×-4F程序拍攝；(每個(gè)細(xì)胞約40秒)e、圖像調(diào)整：在Review軟件中打開拍攝的結(jié)果，右鍵點(diǎn)擊細(xì)胞，在Colors選項(xiàng)中調(diào)整細(xì)胞亮度、對(duì)比度。f、結(jié)果判定：在CTCs鏡檢結(jié)果判定單上進(jìn)行結(jié)果判定，CTCs判斷標(biāo)準(zhǔn)：1、細(xì)胞核清晰且有核紋；2、紅色信號(hào)點(diǎn)或綠色信號(hào)點(diǎn)大于或等于7個(gè)，且為白色信號(hào)點(diǎn)少于7個(gè)。g、圖像輸出：通過(guò)點(diǎn)擊ExportCellGallery，分別輸出上皮型、混合型、間質(zhì)型及LCRMP4在各型CTCs中表達(dá)的圖片。CTCs鑒定及分型方法檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。圖2中，DAPI表示4',6-二脒基-2-苯基吲哚；Emarker表示上皮標(biāo)志物，由EpCAM探針、CK8探針、CK18探針和CK19探針組成；Mmarker表示間質(zhì)標(biāo)志物，由Vimentin探針和Twist探針組成；CD45為白細(xì)胞標(biāo)志物。h、結(jié)果分析：根據(jù)檢測(cè)結(jié)果中CTCs數(shù)量及類型，繪制CTCs數(shù)量類型變化柱狀圖，統(tǒng)計(jì)分析LCRMP4在各型CTC中表達(dá)情況，計(jì)算出LCRMP4表達(dá)信號(hào)數(shù)。收集臨床患者信息，通過(guò)ROC曲線分析CTCs中LCRMP4表達(dá)與轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。LCRMP4在CTCs中表達(dá)的結(jié)果如圖3所示。圖3中，A表示LCRMP4無(wú)表達(dá)，B和C表示LCRMP4表達(dá)(紫色)。CTCs行RNA原位雜交檢測(cè)預(yù)測(cè)前列腺癌(淋巴結(jié)/骨)轉(zhuǎn)移ROC分析結(jié)果如圖4所示；CTCs行RNA原位雜交檢測(cè)預(yù)測(cè)前列腺癌淋巴轉(zhuǎn)移ROC分析分析結(jié)果如圖5所示；CTCs行RNA原位雜交檢測(cè)預(yù)測(cè)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移ROC分析分析結(jié)果如圖6所示。由圖4可見(jiàn)，RNA原位雜交熒光數(shù)預(yù)測(cè)前列腺癌(淋巴結(jié)/骨)轉(zhuǎn)移閥值0時(shí)敏感性95.5％,特異性91.7％；由圖5可見(jiàn)，RNA原位雜交熒光數(shù)預(yù)測(cè)前列腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移閥值0時(shí)敏感性83.3％,特異性91.7％；由圖6可見(jiàn)，RNA原位雜交熒光數(shù)預(yù)測(cè)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移閥值5時(shí)敏感性80％,特異性94.7％。最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3