乳腺癌分子探針及其制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種乳腺癌分子探針，由信號(hào)組件和親和組件構(gòu)成，其特征在于其親和組件是對(duì)乳腺癌干細(xì)胞靶點(diǎn)特異性結(jié)合的組件；信號(hào)組件是由近紅外熒光信號(hào)單元和磁共振信號(hào)單元組成。其制備方法為：采用化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)方法將信號(hào)功能單元與乳腺癌干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物單克隆抗體偶聯(lián)，再經(jīng)過(guò)純化。本發(fā)明是對(duì)乳腺癌干細(xì)胞多靶點(diǎn)特異結(jié)合的分子探針，通過(guò)該分子探針能夠解決對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的在體檢測(cè)和定量分析，為實(shí)體腫瘤干細(xì)胞成像診斷和靶向治療療效評(píng)估新策略提供依據(jù)，為腫瘤早期診斷和分級(jí)提供“新模式”，為腫瘤治療提供精確信息和評(píng)估方法，并為進(jìn)一步解決復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移問(wèn)題墊定診斷信息基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】乳腺癌分子探針及其制造方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)成像【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來(lái)說(shuō)是一種分子探針，特別是一種乳腺癌分子探針，用于醫(yī)學(xué)上乳腺癌診斷和治療的成像。

【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7-10%，在婦女僅次于子宮癌，已成為威脅婦女健康的主要病因。它是一種通常發(fā)生在乳房腺上皮組織，嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。乳腺癌男性罕見(jiàn)，僅約1-2%的乳腺患者是男性。
[0003]乳腺癌的治療原則臨床上對(duì)早、中期以手術(shù)治療為首選，采用根治性切除為主。中、晚期以綜合治療為主。癌癥治療中的放、化療的副作用給病人正常機(jī)體帶來(lái)的傷害和痛苦是有目共睹的。
[0004]對(duì)于癌癥的治療，早發(fā)現(xiàn)早治療的效果要優(yōu)于晚期治療。然而，乳腺癌的早期可無(wú)癥狀，隨著病情發(fā)展，可能表現(xiàn)出局部及全身癥狀。例如腫塊、疼痛、乳房皮膚改變、乳腺輪廊改變、乳頭乳暈改變、乳頭溢液、區(qū)域淋巴結(jié)腫大以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移表現(xiàn)等。因此，對(duì)于乳腺癌的早期準(zhǔn)確診斷，是早發(fā)現(xiàn)和有效治療的基礎(chǔ)和保障。乳腺癌的診斷方法很多，傳統(tǒng)方法主要包括:X線診斷、超聲顯像檢查、細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)診斷等，這些方法雖然在乳腺癌的常規(guī)檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用，但其檢測(cè)的都是疾病終末期的解剖改變，難以實(shí)現(xiàn)真正意義上的早期診斷。
[0005]分子影像學(xué)是采用高精度影像成像技術(shù)，無(wú)創(chuàng)性地對(duì)活體內(nèi)參與生理或病理過(guò)程的分子、基因和細(xì)胞的變化進(jìn)行可視化的定性和定量檢測(cè)。分子影像學(xué)主要應(yīng)用領(lǐng)域是腫瘤學(xué)，其基本策略是向體內(nèi)引入能與靶標(biāo)特異結(jié)合的分子探針(由信號(hào)組件和親和組件兩部分構(gòu)成)，通過(guò)直接檢測(cè)探針上的信號(hào)組件，或者間接檢測(cè)分子探針在細(xì)胞內(nèi)外作用后的產(chǎn)物，獲得分子信息，以達(dá)到示蹤和診斷目的。分子影像學(xué)是在真實(shí)、完整的生理環(huán)境中通過(guò)圖像直接監(jiān)視細(xì)胞和分子通路，對(duì)生物活動(dòng)的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)成像。分子影像技術(shù)與傳統(tǒng)方法相比可以更好地在分子水平研宄疾病的機(jī)制和特征，可以活體上早期、連續(xù)地觀測(cè)治療機(jī)制和療效，是一種真正的癌癥早期檢測(cè)手段，對(duì)提高診斷和治療效果，減少?gòu)?fù)發(fā)率，降低死亡率都具有重量意義。
[0006]分子影像中的關(guān)鍵技術(shù)是分子探針的制備和應(yīng)用。分子探針是指對(duì)某一特定生物分子(如蛋白、DNA和RNA)具有特異性的、并能進(jìn)行體內(nèi)或體外示蹤的標(biāo)記化合物分子，這些標(biāo)記化合物分子能夠在體或離體反映其靶生物分子的量或功能。分子探針通常由信號(hào)組件和親和組件兩部分構(gòu)成。信號(hào)組件是指能產(chǎn)生影像學(xué)信號(hào)且能被高精度成像技術(shù)探測(cè)的對(duì)比劑或標(biāo)記物部分(如放射性核素、熒光素或順磁性分子)，親和組件是與成像靶點(diǎn)特異性結(jié)合的部分(如配體或抗體等)。
[0007]李緒斌等用化學(xué)偶聯(lián)法，將超順磁性氧化鐵顆粒(SP1)與生長(zhǎng)激素抑制素類似物奧曲肽(OCT)偶聯(lián)，制備對(duì)乳腺癌細(xì)胞表皮長(zhǎng)生激素受體(SSTR)的特異性結(jié)合的磁共振分子探針SP1-OCT，該分子探針細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記率達(dá)到96.15% (北京大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，Vol.41Νο.2Apr.2009)。
[0008]朱媛等以乳腺癌表皮生長(zhǎng)因子受體2 (HER2)為靶點(diǎn)，制備以順磁性粒子釓為載體的磁共振(MR)分子探針，通過(guò)MR靶向成像為乳腺癌個(gè)體化治療提供影像學(xué)依據(jù)。材料與方法利用課題組前期制備的針對(duì)HER2的熒光標(biāo)記探針FITC-LTVSPWY與釓噴替酸葡甲胺(Gd-DTPA)偶聯(lián)獲得MR靶向探針(“乳腺癌HER2靶向分子探針的制備及體外MRI初步研宄”，《中國(guó)醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志》2014年22卷第5期)。
[0009]中國(guó)專利文獻(xiàn)CN102399772A公開(kāi)了對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，獲得HER2、T0P2A、AGTRE基因探針。
[0010]然而，目前公布的乳腺癌分子探針，還普通具有如下不足:(I)獲得的分子影像不能更全面反映乳腺癌的生物學(xué)行為，基于目前分子探針成像技術(shù)進(jìn)行診斷和治療，乳腺癌復(fù)發(fā)率高，放化療效果不佳。(2)目前的不同乳腺癌分子探針其成像各有不足。其中熒光成像雖然無(wú)創(chuàng)、敏感性高，可進(jìn)行在體實(shí)時(shí)多目標(biāo)成像，但存在空間分辨率低、解剖背景不清晰的弱點(diǎn)。與之相反，磁共振成像具有極高的空間分辨力和組織分辨力、無(wú)創(chuàng)、無(wú)輻射，但是敏感性相對(duì)較差。(3)乳腺癌等大多數(shù)腫瘤是多基因性疾病，平均每個(gè)腫瘤病人有8-10個(gè)與腫瘤有關(guān)的基因異常變異，當(dāng)前采用單一靶標(biāo)的腫瘤或腫瘤干細(xì)胞靶向治療多數(shù)療效不佳。
[0011]隨著乳腺癌干細(xì)胞(breast cancer stem cell，BCSC)的成功分離、鑒定，和對(duì)其生理作用和過(guò)程的研宄，表明乳腺癌細(xì)胞中存在著一部分具有自發(fā)更新、多向分化潛能以及高度致瘤能力的細(xì)胞亞群一一乳腺癌干細(xì)胞。乳腺癌干細(xì)胞在乳腺癌組織中占比小(平均約2-9% )，在轉(zhuǎn)移灶或轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中絕對(duì)含量更少，因此其檢測(cè)難度大。但其與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和治療抵抗密切相關(guān)(“乳腺癌干細(xì)胞的研宄進(jìn)展”，劉明明等，《中國(guó)癌癥雜志》，2013年第23卷第8期)。根據(jù)2012年2月13日發(fā)表在《干細(xì)胞》期刊上的一篇文章，美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校的研宄人員第一次報(bào)道了放射療法在殺死腫瘤細(xì)胞同時(shí)，也能夠?qū)⑵渌┘?xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榈挚怪委煹娜橄侔└杉?xì)胞。而一些研宄人員認(rèn)為乳腺癌干細(xì)胞是乳腺癌復(fù)發(fā)的唯一來(lái)源。然而，雖然乳腺癌干細(xì)胞的分離和鑒別，以及對(duì)其作用的研宄已經(jīng)取得了許多科研成果，但還未有報(bào)道有對(duì)乳腺癌干細(xì)胞靶向成像的分子探針，因此提供一種能夠?qū)θ橄侔└杉?xì)胞靶向成像的分子探針，以解決乳腺癌干細(xì)胞活體成像和定量分析，為乳腺癌的早期診斷和療效評(píng)估提供新方法，為乳腺癌靶向治療提供新策略，具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種新型的乳腺癌分子探針，通過(guò)對(duì)乳腺癌干細(xì)胞靶向分子成像，為乳腺癌的早期診斷和療效評(píng)估提供新方法，為乳腺癌干細(xì)胞和/或乳腺癌靶向的腫瘤治療提供新策略。
[0013]本發(fā)明采用的技術(shù)該案為:一種乳腺癌分子探針，由信號(hào)組件和親和組件構(gòu)成，其特征在于其親和組件是對(duì)乳腺癌干細(xì)胞靶點(diǎn)特異性結(jié)合的組件，信號(hào)組件是由近紅外熒光信號(hào)單元和磁共振信號(hào)單元組成。雖然乳腺癌分子探針的信號(hào)組件可以為現(xiàn)有分子影像學(xué)中已有的信號(hào)組件，但本發(fā)明考慮到輻射對(duì)活體的影響問(wèn)題，以及為解決單一熒光成像和單一磁共振成像在分辨力和敏感性上的不足，本發(fā)明優(yōu)選熒光-磁共振雙模態(tài)成像，即所述信號(hào)組件是將適用于分子探針的熒光物質(zhì)與磁共振成像物質(zhì)偶合成一體的信號(hào)組件制成雙模態(tài)分子探針。
[0014]進(jìn)一步地，所述親和組件是乳腺癌干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物⑶44+、ESA+或CD24-中的配體。由于其他細(xì)胞膜上沒(méi)有或極少有CD44+與ESA+，故選擇此兩個(gè)靶標(biāo)能使本探針靶向特異性高。優(yōu)選CD44+和/或ESA+配體，特別是選用特異性更好的CD44單克隆抗體CD44_和/或ESA單克隆抗體ESA mAb，采用抗原-抗體特異性結(jié)合的分子成像策略。
[0015]由于普通熒光穿透活體組織能力比較弱，本發(fā)明優(yōu)選波長(zhǎng)在700nm-1200nm的近紅外熒光材料作為信號(hào)組件，該波長(zhǎng)范圍內(nèi)的近紅外熒光對(duì)組織的穿透力強(qiáng)，而此范圍內(nèi)生物組織本身的自發(fā)熒光較弱，從而避免背景干擾，提高檢測(cè)靈敏度。近紅外熒光組件可以是有機(jī)熒光染料，最好是用具有優(yōu)異光學(xué)性質(zhì)的量子點(diǎn)(quantum dots, QDs)作為熒光材料，QDs是由I1-VI族或II1-V族或1-1I1-VI族元素組成的、直徑約Inm-lOnm、能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米晶粒，QDs克服了以往常用于細(xì)胞和生物分子熒光標(biāo)記成像的有機(jī)染料分子的較大缺陷(激發(fā)光譜窄、發(fā)射光譜很寬且不對(duì)稱；熒光譜峰之間很大重疊，限制了可同時(shí)應(yīng)用的熒光探針數(shù)量；光穩(wěn)定性差、易發(fā)生光漂白和光解，光解產(chǎn)物對(duì)生物分子往往有殺傷作用等)，具有激發(fā)光譜寬且連續(xù)分布，可以用各種不同波長(zhǎng)的光進(jìn)行激發(fā)；發(fā)射光譜窄、對(duì)稱而不重疊；光穩(wěn)定性好、顏色豐富可調(diào)等多種優(yōu)勢(shì)。其中波長(zhǎng)650nm-900nm的近紅外QDs相對(duì)較易合成，能承受多次的激發(fā)和光發(fā)射，有持久的光化學(xué)穩(wěn)定性，能夠在體內(nèi)外長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)成像觀測(cè)。同時(shí)由于近紅外QDs的熒光波長(zhǎng)可以根據(jù)量子點(diǎn)粒徑大小進(jìn)行精確調(diào)節(jié)，因此是可視化區(qū)分不同靶標(biāo)的最佳探針。
[0016]進(jìn)一步地，本發(fā)明的較佳實(shí)施例，是將不同粒徑的QDs標(biāo)記不同靶標(biāo)，在同一激發(fā)光下可呈現(xiàn)不同顏色的熒光，從而實(shí)現(xiàn)多靶向分子成像。
[0017]在現(xiàn)有的QDs中，研宄發(fā)現(xiàn)含鎘QDs (如CdTe)含有輕毒性，為提高分子探針的安全性，本發(fā)明優(yōu)選非鎘近紅外QDsJn InP、CuInS。本發(fā)明QDs優(yōu)選采用Zn-Cu-1n-S核量子點(diǎn)，最優(yōu)選的是還可對(duì)該核量子點(diǎn)進(jìn)行表面無(wú)機(jī)層(如ZnS)包覆，形成的核殼近紅外QDs，可提高核殼量子點(diǎn)的熒光效率和光化學(xué)穩(wěn)定性。
[0018]對(duì)于磁共振分子成像探針信號(hào)組件可以用超順磁性氧化鐵(SP1)和順磁性釓(Gd3+)。本發(fā)明人在本項(xiàng)研宄中發(fā)現(xiàn)，SP1納米顆粒具有很強(qiáng)的光吸收性，對(duì)與其偶合的QDs熒光有較強(qiáng)的淬滅效應(yīng)，影響QDs體內(nèi)熒光成像效果。因此本發(fā)明優(yōu)選順磁性釓(Gd3+)作為雙模態(tài)分子探針的MR成像信號(hào)功能單元。
[0019]作為本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明將Gd3+作和近紅外QDs兩個(gè)功能單元，組裝成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的焚光效率高、順磁性好的近紅外非鎘量子點(diǎn)納米顆粒(paramagnetic QDs, pQDs)作為雙模態(tài)探針的信號(hào)組件。同時(shí)選取不同粒徑(對(duì)應(yīng)不同發(fā)射波長(zhǎng))的近紅外非鎘QDs分別與Gd3+)構(gòu)建雙模態(tài)分子探針標(biāo)記不同靶標(biāo)，實(shí)現(xiàn)多靶向分子雙模態(tài)成像。
[0020]為實(shí)現(xiàn)多靶向分子成像，本發(fā)明優(yōu)選的親和組件是基于特異性表面標(biāo)志物CD44+和ESA+的配體，將⑶44_和ESAmAb兩種單克隆抗體分別與不同波長(zhǎng)的近紅外pQDs偶聯(lián)，形成BCSC靶向的兩種雙模態(tài)分子探針，其不同波長(zhǎng)的近紅外pQDS選擇波長(zhǎng)如700nm和800nm兩種，分別表示為pQD700、pQD800，對(duì)應(yīng)地本發(fā)明的兩種雙模態(tài)分子探針為pQD.-⑶44mAb和PQD80O-ESAiiia13,或者為 pQD.-CDA^b和 pQD 7(l(l_ESAmiib。
[0021]對(duì)于雙模態(tài)探針，在偶聯(lián)前，需要磁共振成像材料先偶合在熒光材料表面。例如在偶合前先通過(guò)在QDs表面修飾Gd3+螯合劑DOTA，將Gd3+螯合在納米QDs表面。本方法通過(guò)在QDs表面修飾Gd3+螯合劑DOTA，提供高密度的Gd3+結(jié)合位點(diǎn)，減少了 Gd3 +旋轉(zhuǎn)來(lái)提高其弛預(yù)速率，提高敏感性。
[0022]在本發(fā)明的一種較佳實(shí)施例中，為躲避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕捉，增加探針在體內(nèi)循環(huán)的時(shí)間，消除在非病灶部位的非特異性吸附，降低本底信號(hào)和假陽(yáng)性，還用高分子材料如聚乙二醇(PEG)、丙烯酸樹(shù)脂(PAA)或多羥基醇等對(duì)pQDs進(jìn)行表面修飾。
[0023]本發(fā)明還提供了前述乳腺癌分子探針的制備方法:采用化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)方法將熒光/磁共振雙信號(hào)功能單元與乳腺癌干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物偶聯(lián)，再經(jīng)過(guò)純化。
[0024]本發(fā)明的技術(shù)效果和意義體現(xiàn)在如下幾個(gè)方面:
[0025](I)與現(xiàn)有公開(kāi)的乳腺癌分子探針不同，本發(fā)明是對(duì)乳腺癌干細(xì)胞多靶點(diǎn)特異結(jié)合的分子探針，通過(guò)該分子探針能夠解決對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的在體檢測(cè)和定量分析，為實(shí)體腫瘤干細(xì)胞成像診斷和靶向治療療效評(píng)估新策略提供依據(jù)，為腫瘤早期診斷和分級(jí)提供“新模式”，為腫瘤治療提供精確信息和評(píng)估方法，并為進(jìn)一步解決復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移問(wèn)題墊定診斷信息基礎(chǔ)。
[0026](2)采用雙模態(tài)分子探針，使熒光和MR成像得以揚(yáng)長(zhǎng)避短和優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，可成倍增加單個(gè)BCSC上信號(hào)組分的數(shù)量和密度，提高分子探針的敏感性和分辨率，能夠檢測(cè)更低含量甚至微量的BCSC。
[0027](3)采用多靶向技術(shù)，結(jié)合雙模態(tài)，能夠得到BCSC在活體上的位置、含量和分布等重要信息，并檢測(cè)前哨淋巴結(jié)中BCSC的重要信息，為手術(shù)方式的選擇、放療計(jì)劃等提供精確信息，為個(gè)性化治療提供依據(jù)。此外，依據(jù)BCSC滅活和殘存情況，來(lái)早期無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)治療療效，及時(shí)調(diào)整并加強(qiáng)針對(duì)BCSC的治療該案，能更有效預(yù)防乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為量子點(diǎn)的TEM圖。
[0029]圖2為Zn-Cu-1n-S及其Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜。其中的插圖為Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點(diǎn)在不同發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光效率。
[0030]圖3為Zn-Cu-1n-S和Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點(diǎn)的熒光衰減圖。
[0031]圖2、3中的ZCIS為Zn-Cu-1n-S量子點(diǎn)的縮寫(xiě)。
[0032]圖4為親水性非鎘Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點(diǎn)的體內(nèi)活體熒光成像。
[0033]圖5a為對(duì)照組(QDs經(jīng)PAA修飾但未螯合Gd3+) Tl測(cè)量圖；
[0034]圖5b為實(shí)驗(yàn)組(pQDs，即QDs經(jīng)PAA修飾且螯合Gd3+)的Tl測(cè)量；
[0035]圖5c為Tl加權(quán)成像(TR = 100ms, TE = 3.1ms)顯示，其中I為去離子水信號(hào)，II為未螯合Gd3+探針的QDs信號(hào)；111為pQDs信號(hào)。

【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合最佳實(shí)施例，以雙模態(tài)分子探針為例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容。
[0037]1、分子探針的制備
[0038]1.1順磁性量子點(diǎn)制備
[0039]1.1.1親油性量子點(diǎn)的制備
[0040]本實(shí)施例采用1-1I1-VI族元素(如銅，銦，硫，鋅等)，通過(guò)高溫油相法制備出單分散性好且結(jié)晶度高的Zn-Cu-1n-S核量子點(diǎn)。為獲得更具光穩(wěn)定性的量子點(diǎn)，繼而對(duì)該核量子點(diǎn)進(jìn)行表面無(wú)機(jī)層(如ZnS)包覆，提高核殼量子點(diǎn)的熒光效率和光化學(xué)穩(wěn)定性。在設(shè)計(jì)殼層的組分和結(jié)構(gòu)時(shí)需綜合考慮殼層與核量子點(diǎn)的晶格匹配參數(shù)，以及殼層材料的禁帶寬度，合理結(jié)構(gòu)和組分的核殼量子點(diǎn)對(duì)外界物理、化學(xué)環(huán)境具有很強(qiáng)的抵抗作用，在親水性修飾過(guò)程中能很好的維持原有的熒光效率。具體合成過(guò)程如下:
[0041]Zn-Cu-1n-S核量子點(diǎn)制備過(guò)程:分別稱取醋酸銅(0.1mmol)，醋酸銦(0.2mmol)，醋酸鋅(0.1mmol)，量取0.5mL油酸，將其混合溶解在1mL十八烯中。整個(gè)混合體系抽真空30分鐘后通氬氣，再加熱到120攝氏度，直到混合體系變得光學(xué)透明，再加入1.0mL正十二烷基硫醇。反應(yīng)繼續(xù)升溫到200攝氏度，再加入0.3mmol硫源(9.7mg溶解在0.5mL油胺和
1.0mL十八烯中)，整個(gè)體系維持在200攝氏度反應(yīng)2小時(shí)。
[0042]Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點(diǎn)制備過(guò)程:先配置好殼層的鋅前體，即稱取0.1mmol的醋酸鋅，使其溶解在體積比(1/4)的油胺/十八烯溶液中。取上述得到的4.0mLZn-Cu-1n-S核量子點(diǎn)，再加入5mL十八烯和ImL正十二烷基硫醇，通氬氣30分鐘后開(kāi)始加熱升溫到220攝氏度，再注入事先配置好的鋅前體，維持體系溫度在220攝氏度，反應(yīng)I小時(shí)后降溫到室溫，加入無(wú)水乙醇，離心純化得到Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點(diǎn)。
[0043]采用高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM)、原子力顯微鏡(AFM)、光電子能譜、粒度分析儀、熒光和紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)等對(duì)量子點(diǎn)的形貌、結(jié)構(gòu)、粒徑、光譜等進(jìn)行表征。
[0044]由圖1可以看出，量子點(diǎn)的尺寸在4納米左右，尺寸均一。
[0045]由圖2和3可以看出，采用ZnS包裹后的核殼量子點(diǎn)比未包裹的核量子點(diǎn)熒光效率提高數(shù)倍，衰減速度明顯降低。
[0046]1.1.2量子點(diǎn)親水性改性
[0047]雙親性高分子的制備--聚(叔丁基丙烯酸脂乙基丙烯酸脂甲基丙烯酸)三嵌段共聚物與辛胺以1:40的摩爾比混合溶解在DMF中，加入偶聯(lián)劑EDC反應(yīng)12h，得到的混合物透析純化，凍干后保存待用。
[0048]取適量的親油性量子點(diǎn)粉末和雙親性三嵌段高分子溶解在氯仿/乙醇混合溶液中，攪拌數(shù)小時(shí)以除去氯仿有機(jī)溶劑。再加入適量的PBS緩沖溶液，超聲分散3分鐘。所得到的溶液過(guò)0.22um膜以除去大量未結(jié)合的高分子，過(guò)膜后溶液變得光學(xué)透明。所得溶液過(guò)凝膠色譜柱(G200)，進(jìn)一步除去未結(jié)合的高分子，最終得到純化好的親水性量子點(diǎn)。
[0049]1.1.3順磁性量子點(diǎn)制備
[0050]將親水性量子點(diǎn)與DOTA-NH2分子偶聯(lián)，再加入GdCl 3進(jìn)行Gd3+螯合，獲得順磁性量子點(diǎn)。具體制備過(guò)程是:按照摩爾比1:100:4000將親水性量子點(diǎn)，DOTA-NH2和碳二亞胺鹽酸鹽混合，室溫反應(yīng)2小時(shí)，超速離心純化得到QDs-DOTA。再在所獲得的QDs-DOTA基礎(chǔ)上，加入Gd3+，室溫螯合反應(yīng)4小時(shí)，再經(jīng)過(guò)超速離心純化得到順磁性量子點(diǎn)。
[0051]根據(jù)納米量子點(diǎn)粒徑不同，分別獲得pQD700、pQD800。
[0052]為考察本發(fā)明順磁性量子點(diǎn)的MR成像特性，進(jìn)行MR成像實(shí)驗(yàn)。如圖5所示，圖5a為對(duì)照組(QDs經(jīng)PAA修飾但未螯合Gd3+) Tl測(cè)量。圖5b為實(shí)驗(yàn)組(pQDs，即QDs經(jīng)PAA修飾且螯合Gd3+)的Tl測(cè)量。兩者比較后發(fā)現(xiàn)，pQDs的Tl時(shí)間明顯縮短，弛豫率明顯升高。圖5c為Tl加權(quán)成像(TR = 100ms, TE = 3.1ms)顯示，pQDs信號(hào)強(qiáng)度(III)顯著高于去離子水(I)和未螯合Gd3+探針的QDs (II)。
[0053]1.2革El向乳腺癌干細(xì)胞的順磁性量子點(diǎn)制備
[0054]將順磁性量子點(diǎn)與單克隆抗體分子CD44mAb、ESAmAb偶聯(lián)，獲得可特異性識(shí)別乳腺癌干細(xì)胞的順磁性量子點(diǎn)。具體制備過(guò)程是:按照摩爾比1:10:4000將順磁性量子點(diǎn)，抗體和碳二亞胺鹽酸鹽混合，室溫反應(yīng)2小時(shí)。超速離心純化得到靶向乳腺癌干細(xì)胞的順磁性量子點(diǎn) pQDTOO-aMtAdP PQD800-ESA.。
[0055]2、活體測(cè)試
[0056]為了驗(yàn)證本發(fā)明的分子探針用于BCSC多靶向雙模態(tài)成像效果和安全性，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):
[0057]2.1基于親水性非鎘Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點(diǎn)的體內(nèi)活體熒光成像
[0058]將親水性Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點(diǎn)首先進(jìn)行了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明所制備的親水性Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點(diǎn)具有良好的生物相容性。隨后進(jìn)行了體內(nèi)熒光成像的研宄，結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明制備的近紅外非鎘Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點(diǎn)可以進(jìn)行活體熒光成像。
[0059]2.2安全性實(shí)驗(yàn)
[0060]配置不同濃度的分子探針，經(jīng)過(guò)細(xì)胞毒性3-(4，5-dimethylthiazol_2-yl)-2，5_diphenyltetrazolium bromide (MTT)試驗(yàn)，本發(fā)明的分子探針具有很好的生物安全性。以Cu含量計(jì)算，Cu離子含量在2 μΜ，經(jīng)過(guò)96小時(shí)共孵育，細(xì)胞存活率在95%以上。
[0061]2.3成像敏感性實(shí)驗(yàn)
[0062]對(duì)裝有經(jīng)雙模態(tài)分子探針標(biāo)記但BCSC數(shù)目不同的(BCSC細(xì)胞數(shù)分別為1、5、I X 10\50,1 X 12U X 10\ I X 10\ I X 15)的Ep管分別行熒光成像、MR Tl成像，觀察并比較熒光成像、MR Tl成像能夠檢測(cè)的最低細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，熒光成像模式的最低可分辨的成像細(xì)胞個(gè)數(shù)為5 ；MR Tl成像模式的最低可分辨的成像細(xì)胞個(gè)數(shù)為50。
[0063]2.4靶向特異性實(shí)驗(yàn)
[0064]以⑶44-/ESA-的乳腺癌細(xì)胞做對(duì)照，將BCSC分別與pQD700_⑶44mAb雙模態(tài)分子探針、PQD700共培養(yǎng)孵育，洗滌后與熒光顯微鏡下觀測(cè)BCSC和CD44-/ESA-的乳腺癌細(xì)胞的熒光信號(hào)，再分別行MR TlW成像，評(píng)價(jià)熒光信號(hào)與磁共振信號(hào)是否一致，并判斷該探針的靶向性能。對(duì)PQDSOO-ESAmAb雙模態(tài)分子探針同樣進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)細(xì)胞靶向成像實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明的雙模態(tài)分子探針具有優(yōu)異的靶向性檢測(cè)效果。
【權(quán)利要求】
1.一種乳腺癌分子探針，由信號(hào)組件和親和組件構(gòu)成，其特征在于其親和組件是對(duì)乳腺癌干細(xì)胞靶點(diǎn)特異性結(jié)合的組件；信號(hào)組件是由近紅外熒光信號(hào)單元和磁共振信號(hào)單元組成。
2.如權(quán)利要求1所述的乳腺癌分子探針，其特征在于:所述親和組件是乳腺癌干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物⑶44+和/或23八—的配體。
3.如權(quán)利要求1所述的乳腺癌分子探針，其特征在于:所述親和組件是0)44單克隆抗體⑶44-和/或單克隆抗體
4.如權(quán)利要求3所述的乳腺癌分子探針，其特征在于:所述熒光信號(hào)單元為近紅外量子點(diǎn)。
5.如權(quán)利要求4所述的乳腺癌分子探針，其特征在于:所述近紅外量子點(diǎn)為211-011-111-8非錦量子點(diǎn)。
6.如權(quán)利要求4所述的乳腺癌分子探針，其特征在于:所述近紅外量子點(diǎn)為211-011-111-8核量子點(diǎn)外包括有2113的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)。
7.如權(quán)利要求4所述的乳腺癌分子探針，其特征在于:所述磁共振信號(hào)材料為順磁性釓。
8.如權(quán)利要求5所述的乳腺癌分子探針，其特征在于:所述探針為多靶向雙模態(tài)分子探針，為和？卯口叫與？卯2在近紅外波段但波長(zhǎng)不同。
9.一種權(quán)利要求1至8中之一所述乳腺癌分子探針的制造方法，其特征在于:采用化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)方法將信號(hào)功能單元與乳腺癌干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物單克隆抗體偶聯(lián)，再經(jīng)過(guò)純化。
10.如權(quán)利要求9所述的制造方法，其特征在于:還用聚乙二醇、丙烯酸樹(shù)脂或多羥基醇對(duì)？如8進(jìn)行表面修飾。
【文檔編號(hào)】G01N24/10GK104483296SQ201410718641
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月1日
【發(fā)明者】方向明, 張兵波, 胡春洪 申請(qǐng)人:無(wú)錫市人民醫(yī)院