本發(fā)明屬于種子科學(xué)與技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及水稻種子快速萌發(fā)QTL qGS11的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，播種后常會(huì)遇到低溫和洪澇等非生物脅迫，低活力種子萌發(fā)緩慢、出苗率低且抗性差，造成田間幼苗腐爛、壞死及雜草叢生等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)。同時(shí)，隨著勞動(dòng)力日益短缺，直播稻推廣越來(lái)越廣。因此，提高種子萌發(fā)速度，選育高活力水稻品種具有重要意義。通過(guò)挖掘、定位克隆水稻種子快速萌發(fā)相關(guān)的基因/QTL，利用分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)選育高活力水稻品種，是一個(gè)非常有效地方法。

利用構(gòu)建不同的水稻遺傳群體，已有不少學(xué)者定位了多個(gè)控制種子萌發(fā)相關(guān)的QTLs，但僅有一個(gè)控制水稻種子低溫萌發(fā)的主效QTL qLTG3-1被成功克隆。前期，利用秈稻品種IR28和粳稻品種大關(guān)稻構(gòu)建的重組自交系(RILs)群體檢測(cè)到了多個(gè)種子萌發(fā)相關(guān)QTLs。在此基礎(chǔ)上，對(duì)位于水稻11號(hào)染色體上控制種子萌發(fā)速度QTL qGS11進(jìn)行精細(xì)定位，為利用分子標(biāo)記輔助選擇方法(MAS)培育高活力水稻品種鑒定了基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供水稻種子快速萌發(fā)篩選的分子標(biāo)記方法。通過(guò)檢測(cè)與水稻種子快速萌發(fā)基因位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記，可以快速篩選出快速萌發(fā)的水稻品種，提高水稻種子活力篩選的可靠性、有效性；可以確定有無(wú)控制種子快速萌發(fā)基因?qū)氲接N品系中，提高水稻高活力性狀的選擇效率、加快育種進(jìn)程。

本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

水稻種子快速萌發(fā)QTL qGS11的分子標(biāo)記，所述的分子標(biāo)記選自YB20、YB21、RM26614中的任意一種；所述的分子標(biāo)記YB20上游引物為YB20L：SEQ ID NO.1，下游引物為YB20R：SEQ ID NO.2，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為133bp；所述的分子標(biāo)記YB21上游引物為YB21L：SEQ ID NO.3，下游引物為YB21R：SEQ ID NO.4，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為194bp；所述的分子標(biāo)記RM26614上游引物為RM26614L：SEQ ID NO.5，下游引物為RM26614R：SEQ ID NO.6，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為183bp。

本發(fā)明所述的水稻種子快速萌發(fā)QTL qGS11的分子標(biāo)記引物，所述的分子標(biāo)記YB20上游引物為YB20L：SEQ ID NO.1，下游引物為YB21R：SEQ ID NO.2，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為133bp；所述的分子標(biāo)記YB21上游引物為YB21L：SEQ ID NO.3，下游引物為YB21R：SEQ ID NO.4，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為194bp；所述的分子標(biāo)記RM26614上游引物為RM26614L：SEQ ID NO.5，下游引物為RM26614R：SEQ ID NO.6，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為183bp。

本發(fā)明所述的分子標(biāo)記在篩選快速萌發(fā)的水稻品種中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的分子標(biāo)記引物在篩選快速萌發(fā)的水稻品種中的應(yīng)用。

水稻種子快速萌發(fā)分子篩選方法，步驟如下：

(1)取水稻葉片，提取基因組DNA。

(2)利用表1中的任意1對(duì)或1對(duì)以上分子標(biāo)記引物對(duì)所述的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在8％非變性聚丙烯酰胺膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，如果擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)大小的DNA片段，標(biāo)志著qGS11增效等位基因存在。

表1

其中，所述的PCR反應(yīng)體系：體積為25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mMMgCl₂1.5微升，4pmol/微升引物對(duì)2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，5單位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA 20納克，加水至25微升。反應(yīng)程序?yàn)镈NA 95℃預(yù)變性5min；95℃預(yù)變性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循環(huán)35次；最后72℃延伸10min。

用SSR分子標(biāo)記YB20的上下游引物擴(kuò)增秈稻品種IR28或者IR28與粳稻雜交后代的基因組DNA，如果能夠擴(kuò)增出133bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著qGS11的秈稻IR28增效等位基因存在，否則擴(kuò)增出128bp，則表明增效等位基因沒(méi)有導(dǎo)入。在5125個(gè)BC₅F₂分離群體中，用交換配子數(shù)計(jì)算，此標(biāo)記與種子快速萌發(fā)基因qGS11共分離，單標(biāo)記選擇效率達(dá)99.9％。

用SSR分子標(biāo)記YB21的上下游引物擴(kuò)增秈稻品種IR28或者IR28與粳稻雜交后代的基因組DNA，如果能夠擴(kuò)增出194bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著qGS11的秈稻IR28增效等位基因存在，否則擴(kuò)增出178bp，則表明增效等位基因沒(méi)有導(dǎo)入。在5125個(gè)BC₅F₂分離群體中，用交換配子數(shù)計(jì)算，此標(biāo)記與種子快速萌發(fā)基因qGS11共分離，單標(biāo)記選擇效率達(dá)100％。

用SSR分子標(biāo)記RM26614的上下游引物擴(kuò)增秈稻品種IR28或者IR28與粳稻雜交后代的基因組DNA，如果能夠擴(kuò)增出183bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著qGS11的秈稻IR28增效等位基因存在，否則擴(kuò)增出200bp，則表明增效等位基因沒(méi)有導(dǎo)入。在5125個(gè)BC₅F₂分離群體中，用交換配子數(shù)計(jì)算，此標(biāo)記與種子快速萌發(fā)基因qGS11共分離的，單標(biāo)記選擇效率達(dá)99.8％。

上述3個(gè)分子標(biāo)記對(duì)qGS11的選擇效率在99％以上，其中SSR標(biāo)記YB21與qGS11共分離，選擇準(zhǔn)確率高，達(dá)100％。上述3個(gè)標(biāo)記可以擇一使用，也可以任意選擇2對(duì)或2個(gè)以上標(biāo)記聯(lián)合使用。3個(gè)標(biāo)記中任意2個(gè)分子標(biāo)記組合選擇，選擇效率也達(dá)到100％。

有益效果

本發(fā)明所提供的水稻種子快速萌發(fā)篩選的分子標(biāo)記方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)通過(guò)本發(fā)明開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記首次從秈稻品種IR28中在水稻11號(hào)染色體長(zhǎng)臂上定位到控制種子萌發(fā)速度QTL qGS11，并獲得了共分離或高度緊密連鎖的SSR標(biāo)記YB20、YB21和RM26614。

(2)通過(guò)本發(fā)明分子標(biāo)記定位的水稻種子快速萌發(fā)QTL qGS11，鑒定方法快速簡(jiǎn)便，選擇效率高。只需要檢測(cè)這些標(biāo)記的擴(kuò)增條帶特征，就可以判斷種子萌發(fā)速度基因qGS11是否存在，從而預(yù)測(cè)水稻種子萌發(fā)快慢水平，可以快速、有目的性的篩選高活力水稻品種或品系，用于改良水稻種子活力。這些標(biāo)記與快速萌發(fā)基因qGS11共分離或高度緊密連鎖，單標(biāo)記選擇效率達(dá)99％-100％，任意雙標(biāo)記選擇率達(dá)100％。

(3)分子標(biāo)記輔助選擇育種目標(biāo)明確，節(jié)約成本，不受環(huán)境影響。在傳統(tǒng)育種方法中，首先要收集種子快速萌發(fā)親本與骨干親本進(jìn)行一系列雜交，回交，而且要等到收獲種子破休眠后，對(duì)后代進(jìn)行萌發(fā)表型鑒定從而選擇單株。傳統(tǒng)育種方法受環(huán)境影響大，可靠性低。通過(guò)本發(fā)明的與種子快速萌發(fā)基因qGS11共分離和緊密連鎖的分子標(biāo)記方法，可預(yù)測(cè)水稻種子萌發(fā)快慢，可以在種子萌發(fā)期就鑒定出快速萌發(fā)的單株，淘汰其它植株，可以有效控制育種規(guī)模，提高育種效率，能快速篩選出高活力水稻品種。同時(shí)，在水稻育種群體構(gòu)建時(shí)，可以快速鑒定出具有種子快速萌發(fā)基因qGS11的單株，大大提高選擇效率，縮短育種年限，為水稻高活力品種改良和育種服務(wù)。

附圖說(shuō)明

圖1：兩親本大關(guān)稻和IR28第4d萌發(fā)表型圖

圖2：qGS11在11號(hào)染色體上初定位圖

圖3：qGS11在11號(hào)染色體上精細(xì)定位圖

圖4：新開(kāi)發(fā)的與qGS11緊密連鎖的分子標(biāo)記多態(tài)性電泳條帶

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(一)材料與方法：

1.材料：親本高活力水稻品種IR28和低活力品種大關(guān)稻，及以IR28為輪回親本構(gòu)建BC₁F₂和BC₅F₂群體。

2.用SDS法提取個(gè)體DNA。

3.分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)：以日本晴和9311為參考序列設(shè)計(jì)新引物，以親本IR28與大關(guān)稻為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選多態(tài)性標(biāo)記。

4.PCR反應(yīng)體系：體積為25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升，4pmol/微升引物對(duì)2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，5單位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA 20納克，加水至25微升。反應(yīng)程序?yàn)镈NA 95℃預(yù)變性5min；95℃預(yù)變性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循環(huán)35次；最后72℃延伸10min。在biometre擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在8％非變性聚丙烯酰胺膠(含100ml聚丙烯酰胺溶液中有7.6g丙烯酰胺和0.4g甲叉雙丙烯酰胺)上進(jìn)行電泳分離。

5.種子快速萌發(fā)QTL初位點(diǎn)：親本及BC₁F₂分離群體全部種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站，取樣并收獲成熟的種子，去雜，50℃烘干破除種子休眠，再保存于-20℃冰箱，以備長(zhǎng)期使用；每個(gè)單株取30粒種子，3次重復(fù)，于25℃下進(jìn)行種子萌發(fā)速度鑒定，完成水稻種子萌發(fā)速度QTL初步定位。

6.軟件運(yùn)算：所用軟件為QTL IciMapping 4.1，最小LOD值設(shè)為2.5，步伐為1，獲取連鎖圖譜，進(jìn)行QTL定位分析(圖2)。

7.連鎖標(biāo)記驗(yàn)證與區(qū)間確定：對(duì)含有qGS11位點(diǎn)背景與IR28相似的家系進(jìn)行回交、自交獲得BC₅F₂分離群體每個(gè)單株的后代，進(jìn)行正常條件下種子萌發(fā)速度性狀鑒定，并結(jié)合其基因型構(gòu)建水稻遺傳圖譜，驗(yàn)證連鎖的分子標(biāo)記，從而有效確定縮小定位區(qū)間。

(二)結(jié)果與分析

結(jié)合BC₁F₂分離群體在正常條件下種子萌發(fā)表型，以第4d種子成苗率和發(fā)芽指標(biāo)為指標(biāo)，利用軟件分析發(fā)現(xiàn)位于11號(hào)染色體上控制種子萌發(fā)速度的QTL真實(shí)存在，位于標(biāo)記RM3428與RM26614之間。

對(duì)BC₅F₂分離群體5125株分離個(gè)體表型鑒定與標(biāo)記分析，在分子標(biāo)記YB20和RM26614間獲得11個(gè)交換株。標(biāo)記YB21與qGS11共分離，沒(méi)有交換株，說(shuō)明單標(biāo)記對(duì)qGS11的選擇效率達(dá)100％；標(biāo)記YB21和RM13443與qGS11交換率在1％以下，單標(biāo)記對(duì)qGS11的選擇效率達(dá)99％以上(圖3)。

通過(guò)檢測(cè)與水稻種子萌發(fā)速度基因位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記，可以預(yù)測(cè)水稻種子活力水平，可以確定有無(wú)控制水稻種子萌發(fā)速度基因?qū)胗N品系中，提高水稻育種選擇效率，加快育種進(jìn)度。利用與qGS11共分離或緊密連鎖的YB20、YB21和RM26614進(jìn)行單標(biāo)記選擇，選擇效率可達(dá)到99％-100％，任何雙標(biāo)記組合選擇效率均達(dá)到100％，可用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。

實(shí)施例2

(一)材料與方法：

1.材料：水稻品種IR28與大關(guān)稻

2.用SDS法提取個(gè)體DNA。

3.標(biāo)記：YB20、YB21及RM26614。

4.PCR反應(yīng)體系：體積為25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升，4pmol/微升引物對(duì)2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，5單位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA 20納克，加水至25微升。反應(yīng)程序?yàn)镈NA 95℃預(yù)變性5min；95℃預(yù)變性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循環(huán)35次；最后72℃延伸10min。在biometre擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在8％非變性聚丙烯酰胺膠(含100ml聚丙烯酰胺溶液中有7.6g丙烯酰胺和0.4g甲叉雙丙烯酰胺)上進(jìn)行電泳分離。

(二)結(jié)果與分析

用SSR分子標(biāo)記YB20的上下游引物擴(kuò)增秈稻品種IR28或者大關(guān)稻的基因組DNA，水稻品種IR28能夠擴(kuò)增出133bp的擴(kuò)增片段，標(biāo)志著水稻品種IR28中存在qGS11增效等位基因，大關(guān)稻擴(kuò)增出128bp，表明大關(guān)稻中不存在qGS11增效等位基因。用SSR分子標(biāo)記YB21的上下游引物擴(kuò)增秈稻品種IR28或者大關(guān)稻的基因組DNA，水稻品種IR28能夠擴(kuò)增出194bp的擴(kuò)增片段，標(biāo)志著水稻品種IR28中存在qGS11增效等位基因，大關(guān)稻擴(kuò)增出178bp，表明大關(guān)稻中不存在qGS11增效等位基因。用SSR分子標(biāo)記RM26614的上下游引物擴(kuò)增秈稻品種IR28或者大關(guān)稻的基因組DNA，水稻品種IR28能夠擴(kuò)增出183bp的擴(kuò)增片段，標(biāo)志著水稻品種IR28中存在qGS11增效等位基因大關(guān)稻擴(kuò)增出200bp，表明大關(guān)稻中不存在qGS11增效等位基因(圖4，圖中每種分子標(biāo)記引物對(duì)應(yīng)兩條泳道，左邊的泳道對(duì)應(yīng)大關(guān)稻，左邊的泳道對(duì)應(yīng)水稻品種IR28)。