專(zhuān)利名稱(chēng)：含嗜酸乳桿菌的藥物制劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制劑，具體涉及一種含嗜酸乳桿菌的藥物制劑及制備方法。
寄生于正常陰道內(nèi)的微生物群主要有細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)和病毒。它們主要棲居于粘膜的皺褶以及穹窿部，其次是宮頸。陰道內(nèi)主要的常住菌有乳桿菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、棒狀桿菌、B族鏈球菌、糞鏈球菌、支原體、白色念珠菌、消化球菌和類(lèi)桿菌等。一般用定性和定量的方法測(cè)得健康婦女陰道排出物中活菌為102CFU/ml-109CFU/ml，厭氧菌與需氧菌之比為5∶1，其中乳桿菌是陰道正常菌群中最重要、數(shù)量最多的常住菌。正常情況下乳桿菌占陰道內(nèi)所有常住菌的95％以上，是正常菌群，其量約每ml陰道分泌物中含≤104CFU。目前研究表明從健康婦女陰道內(nèi)可分離出16種乳桿菌，分離率達(dá)50-80％，其中數(shù)量較多的是嗜酸乳桿菌(77.5％)、唾液乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌，而糖元分解能力強(qiáng)的菌包括嗜酸乳桿菌、萊氏乳桿菌及唾液乳桿菌。乳桿菌在維持陰道微生態(tài)平衡中起重要作用。它可分解陰道粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)的糖元，產(chǎn)生一定量的乳酸進(jìn)而維持陰道內(nèi)較低的酸堿度，使陰道保持酸性環(huán)境，抑制有害菌的過(guò)度生長(zhǎng)，有利于陰道的自?xún)糇饔谩Ｍ瑫r(shí)它可提高機(jī)體的免疫功能，激活巨噬細(xì)胞，維持陰道局部的抗感染能力。
婦科窺器檢查時(shí)陰道分泌物不會(huì)積聚成堆，其中很少有多形核中性白細(xì)胞，陰道分泌物涂片經(jīng)革蘭氏染色，上皮細(xì)胞邊界清晰，涂片中有多量染色較深的革蘭氏陽(yáng)性乳桿菌。陰道壁存在著大量的乳桿菌可形成一種生物膜，起到了占位性保護(hù)作用。嗜酸乳桿菌是健康婦女陰道內(nèi)微生物群中優(yōu)勢(shì)菌屬的正常菌群菌株之一，數(shù)量最多，約占整個(gè)菌群的67％。它們對(duì)正常菌叢起著平衡作用，使宿主陰道微生態(tài)系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡，保持婦女陰道正常功能，免于遭受可能有致病性的內(nèi)棲菌或者外源性致病菌的侵襲。
陰道炎發(fā)病與陰道微生態(tài)環(huán)境改變有關(guān)(1)陰道pH值的升高；(2)月經(jīng)周期中性激素的變化；(3)陰道灌洗，灌洗不當(dāng)使陰道局部受傷；(4)抗生素等應(yīng)用殺滅了病菌的同時(shí)也抑制了陰道正常菌群；(5)同時(shí)伴有其它感染。全身性疾病、陰道局部損傷、卵巢功能底下或免疫抑制劑、抗腫瘤藥物等失度使用均導(dǎo)致陰道菌群中一些常住菌乘虛而入，引起陰道感染。感染的主要來(lái)源是陰道微生物群中許多潛在性致病微生物比如大腸桿菌、類(lèi)桿菌、消化球菌、金黃色葡萄球菌、B族鏈球菌、白色念珠菌、毛滴蟲(chóng)、支原體等。以上5種情況都可以破壞陰道的微生態(tài)平衡，致使致病菌繁殖而致陰道炎。另外，厭氧菌繁殖同時(shí)，有些氨類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生，也進(jìn)一步堿化陰道，使陰道上皮脫落，陰道分泌物異常。而有些氨類(lèi)物質(zhì)也可進(jìn)一步促進(jìn)厭氧菌生長(zhǎng)，加重陰道炎的癥狀，致使陰道微生態(tài)環(huán)境破壞。陰道炎是婦女常見(jiàn)、多發(fā)的疾病之一，與婦女陰道中微生態(tài)平衡有關(guān)。近十多年，由于陰道微生物基礎(chǔ)理論研究的進(jìn)展，為這類(lèi)制劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。
含乳桿菌的制劑，由于在制備的時(shí)候產(chǎn)生的物理碰撞而導(dǎo)致的死亡細(xì)菌細(xì)胞占一定比例，以及當(dāng)它們?cè)陉幍狼恢羞M(jìn)一步擴(kuò)散和它們的繁殖開(kāi)始時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)一步減少，因此，需要處理乳桿菌的適當(dāng)品種，或輔料，和包含它們的制劑，以保證制劑有好的質(zhì)量，給病人使用是真正有益的。另外，制劑應(yīng)能夠保持繁殖的嗜酸乳桿菌的數(shù)量恒定，并確保嗜酸乳桿菌在陰道腔內(nèi)擴(kuò)散時(shí)連續(xù)不變地作用。
申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)可以得到對(duì)治療陰道感染非常有效的嗜酸乳桿菌為基礎(chǔ)的藥物制劑，其提供了以下特征，可滿(mǎn)足可能的最高水平(1)所選的嗜酸乳桿菌菌株必須有對(duì)陰道上皮的高親和性，即粘附到陰道上皮細(xì)胞的高性能，這種性能使細(xì)菌能在生理和病理?xiàng)l件下與陰道粘膜相互作用，執(zhí)行在上皮受體位點(diǎn)與病原有機(jī)體的競(jìng)爭(zhēng)作用，并重建微生物體系和最適pH條件。(2)必須有高的干擾能力，競(jìng)爭(zhēng)大腸桿菌和白色念珠菌在人體陰道上皮細(xì)胞上的粘附。(3)必須有抑制大腸桿菌、白色念珠菌、淋病奈瑟氏菌生長(zhǎng)的高性能。
因此，本發(fā)明的目的是提供滿(mǎn)足以上特征，達(dá)到可能的最高水平的嗜酸乳桿菌為基礎(chǔ)的制劑，并適于有效地用于治療陰道感染，如陰道炎、淋病等。
本發(fā)明提供了一種含嗜酸乳桿菌的藥物制劑，該制劑是由嗜酸乳桿菌與藥用賦形劑組成的。
本發(fā)明使用的嗜酸乳桿菌是經(jīng)體外人工發(fā)酵繁殖后制成的活菌。本菌種以西紅柿汁作為培養(yǎng)基，經(jīng)體外人工發(fā)酵、冷卻、離心、加保護(hù)劑后凍干后制劑化，用于陰道感染的治療，起到陰道微生態(tài)治療作用。本菌種菌粉菌量以108-1010CFU/g為優(yōu)，優(yōu)選菌量大約為1011CFU/g。本嗜酸乳桿菌治療劑量(菌量)應(yīng)大于104CFU/g，優(yōu)選菌量為106-107CFU/g。
本發(fā)明的另一目的是提供了一種含嗜酸乳桿菌的藥物制劑的制備方法，該方法包括下列步驟
1、制備嗜酸乳桿菌菌粉將陰道中分泌物進(jìn)行分離、純化后獲得的嗜酸乳桿菌SL9404菌株于MRS瓊脂斜面上劃線(xiàn)傳代，經(jīng)37±1℃培養(yǎng)48h。選取飽滿(mǎn)、色澤均勻、中等偏大的菌落，再次劃線(xiàn)接種于茄子瓶?jī)?nèi)的MRS瓊脂斜面上，經(jīng)37±1℃培養(yǎng)48h。轉(zhuǎn)種接入牛肉皰肉管，37±1℃培養(yǎng)20-50h。取1-4支皰肉管轉(zhuǎn)入300ml牛奶發(fā)酵培養(yǎng)基或5-20％西紅柿汁發(fā)酵培養(yǎng)基或牛奶+西紅柿汁發(fā)酵培養(yǎng)基，37±1℃培養(yǎng)8-48h發(fā)酵培養(yǎng)，逐步放大至大罐發(fā)酵，離心，冷凍干燥后制得菌粉；2、制備藥劑按處方量稱(chēng)取嗜酸乳桿菌和藥用賦形劑，按常規(guī)藥物制劑方法制成各種制劑。
本菌種的保藏以冷凍干燥的形式為優(yōu)。
該菌種已于2000年6月12日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)為CCTCC NOM200013。
本發(fā)明的含嗜酸乳桿菌制劑的作用機(jī)理主要有(1)維持酸性環(huán)境。陰道乳桿菌活菌制劑可以補(bǔ)充患者陰道內(nèi)最重要的乳桿菌，它可分解陰道粘膜上皮中貯存的糖元產(chǎn)生乳酸、乙酸等酸性物質(zhì)，同時(shí)它本身亦能產(chǎn)生乳酸，這對(duì)維持陰道的酸性環(huán)境，抑殺多種病原微生物起著重要作用。(2)占位保護(hù)作用。大量研究證明外源性的乳桿菌能牢固地粘附于陰道粘膜上皮，形成空間性占位保護(hù)作用。(3)直接拮抗作用。體內(nèi)外的研究證實(shí)乳桿菌對(duì)陰道加德鈉氏菌、滴蟲(chóng)、念珠菌、葡萄球菌等有直接的抑制作用。(4)產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)。乳桿菌能分解陰道粘膜上皮中貯存的糖元，產(chǎn)生乳酸、乙酸等酸性物質(zhì)，同時(shí)它本身亦能產(chǎn)生乳酸，維持陰道的酸性環(huán)境，抑殺多種病原微生物。(5)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)。大量定植于陰道中的乳桿菌，營(yíng)養(yǎng)處于競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，不利于其他菌的生長(zhǎng)。乳桿菌療法是將乳桿菌活菌制劑放入到陰道中，使乳桿菌活菌回到機(jī)體內(nèi)發(fā)揮其自然的生理功能，調(diào)整陰道菌群，維護(hù)生態(tài)平衡，使陰道菌群重新達(dá)到微生態(tài)平衡，達(dá)到防治疾病的目的。
本發(fā)明的制劑形式可以是液體形式、膏體形式或固體形式，如片劑、膠囊劑、散劑、霜?jiǎng)⑷楦鄤?、栓劑或噴霧劑。
本發(fā)明制劑所述的常用藥物賦形劑，包括玉米淀粉、預(yù)膠化淀粉、羧甲基淀粉鈉、糊精、乳糖、異乳糖、甘露醇、葡萄糖、維生素C、檸檬酸、檸檬酸一鈉、檸檬酸二鈉、酒石酸、富馬酸、硼酸、酸性氨基酸類(lèi)(如谷氨酸、天冬氨酸)等弱酸、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉(鈣)、羥丙甲纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、碳酸鈣、碳酸氫鈉、硬脂酸鎂、羊毛脂、聚乙二醇等。添加劑是指食用脫脂奶粉、維生素C、谷氨酸等有關(guān)營(yíng)養(yǎng)劑。
本發(fā)明的含嗜酸乳桿菌制劑可用于婦女陰道感染方面、淋病等疾病的治療和預(yù)防。一、嗜酸乳桿菌對(duì)人陰道上皮細(xì)胞(VEC)粘附作用觀(guān)察(中國(guó)藥品生物制品檢定所檢測(cè))(一)目的觀(guān)察嗜酸乳桿菌SL9404對(duì)人體陰道上皮細(xì)胞的粘附作用。(二)材料與方法1、人體陰道上皮細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱(chēng)VEC)取自健康婦女，年齡40歲以下，醫(yī)院婦科門(mén)診體檢正常。
刮取的VEC標(biāo)本立即懸浮于20mlRPMI-1640中旋渦混合器震蕩洗滌細(xì)胞3次，500rpm×3min，濾器反復(fù)抽濾，除去內(nèi)源性細(xì)菌。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整VEC濃度105/ml。2、菌種(1)分離自健康婦女陰道嗜酸乳桿菌9403、SL9404和9405株菌(2)大腸桿菌CMCC44113株(3)白色念珠菌CMCC 10231株(4)德氏乳桿菌一株，分離自定菌生制品3、菌液制備將乳桿菌接種于MRS培養(yǎng)基、大腸桿菌與白色念珠菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37℃，18小時(shí)培養(yǎng)；試驗(yàn)前刮取菌苔，RPMI-1640洗滌細(xì)菌3次(3000×10min)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/ml。4、方法(1)粘附試驗(yàn)3株嗜酸乳桿菌粘附作用比較取VEC懸液及菌液各1ml，混合，37℃，2小時(shí)培養(yǎng)；涂片，室溫干燥，甲醇固定10min，革蘭氏染色，鏡下觀(guān)察細(xì)菌在VEC上粘附情況并計(jì)數(shù)。(2)乳桿菌對(duì)大腸桿菌、白色念珠菌粘附VEC的影響，分為以下三組進(jìn)行第一組1ml乳桿菌菌液中加入1ml大腸桿菌菌液或1ml白色念珠菌菌液，再加入1mlVEC懸液混勻，37℃，2小時(shí)，按上述試驗(yàn)方法鏡下觀(guān)察并計(jì)數(shù)。
第二組1ml乳桿菌菌液與1mlVEC懸液混勻，37C先培養(yǎng)30min后，再加入1ml大腸桿菌菌液或1ml白色念珠菌菌液，混勻，繼續(xù)37℃，2小時(shí)，同上述試驗(yàn)方法鏡下觀(guān)察并計(jì)數(shù)。5、計(jì)數(shù)鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)50個(gè)VEC上粘附的細(xì)菌數(shù)，計(jì)算平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差。(三)結(jié)果1、不同株嗜酸乳桿菌粘附作用的比較三株嗜酸乳桿菌對(duì)人體VEC的粘附作用是不同的，其中SL9404株對(duì)VEC有較明顯的粘附作用，見(jiàn)表1，即為50個(gè)VEC的細(xì)菌粘附數(shù)(113.8±33.69)，而9403和9405株經(jīng)與VEC培養(yǎng)37℃，2小時(shí)后，大量細(xì)胞分布在混合液中，在VBC上未見(jiàn)明顯粘附。對(duì)照菌即由定菌生分離的德氏乳桿菌粘附作用也不明顯。
表一 嗜酸乳桿菌SL9404株對(duì)VEC的粘附作用
2、嗜酸乳桿菌SL9404株對(duì)大腸桿菌、白色念珠菌粘附VEC的影響(1)大腸桿菌44113株及白色念珠菌10231、白157.14±54.06和31.84±11.65(見(jiàn)表2)。表2、第一組試驗(yàn)結(jié)果
(2)第一組試驗(yàn)結(jié)果(表2)標(biāo)明，將嗜酸乳桿菌SL9404株與大腸桿菌44113株或白色念珠菌10231株同時(shí)培養(yǎng)于37℃后，SL9404株可以抑制其它兩株菌的粘附作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有明顯差異，且比對(duì)照德氏乳桿菌的抑制作用更為明顯。(3)第二組試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)時(shí)嗜酸乳桿菌9405株先與VEC培養(yǎng)后，再加入大腸桿菌44113或白色念株菌10231時(shí)(表3)，則嗜酸乳桿菌SL9404株會(huì)明顯抑制后兩株菌粘附VEC的作用。表3、第2組試驗(yàn)結(jié)果
(4)第三組試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)大腸桿菌44113、白色念珠菌10231先與VEC培養(yǎng)后，再加入嗜酸乳桿菌SL9404株時(shí)，SL9404株對(duì)前兩株菌粘附VEC也有明顯的抑制作用(見(jiàn)表4)表4、嗜酸乳桿菌SL9404株對(duì)大腸肝菌44113或白色念珠菌10231在VEC粘附作用影響
(四)結(jié)論1、嗜酸乳桿菌SL9404株對(duì)人本陰道上皮細(xì)胞有明顯的粘附作用。2、嗜酸乳桿菌SL9404株可以抑制大腸桿菌44113株和白色念珠菌10231株在人體陰道上皮細(xì)胞的粘附作用。3、嗜酸乳桿菌SL9404株對(duì)人體陰道上皮細(xì)胞粘附作用較分離自定菌生制劑的德氏乳桿菌更為明顯。二、嗜酸乳桿菌體外拮抗3種致病菌的研究(中國(guó)生物制品檢定所測(cè)定)(一)目的觀(guān)察嗜酸乳桿菌SL9404在體外對(duì)三種常見(jiàn)陰道致病菌，即致病性大腸桿菌、淋病奈瑟氏菌和白色念珠菌的拮抗作用。(二)材料與方法(1)菌種①嗜酸乳桿菌SL9404株由上海信誼藥業(yè)公司提供。②三種致病菌均由中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心提供致病性大腸桿菌CMCC44l13淋病奈瑟氏菌(以下簡(jiǎn)稱(chēng)淋球病)CMCC29403白色念珠菌CMCC10231(2)培養(yǎng)基①含2％小牛血清TPY培養(yǎng)液用于液體培養(yǎng)。②乳桿菌選擇性培養(yǎng)基采用MRS瓊脂培養(yǎng)基。③大腸桿菌選擇性培養(yǎng)基采用MRS瓊脂培養(yǎng)基。④白色念珠菌選擇性培養(yǎng)基采用虎紅瓊脂培養(yǎng)基。⑤淋球病選擇性培養(yǎng)基采用NG瓊脂培養(yǎng)基。(3)菌液制備分別將各菌株新鮮培養(yǎng)物，用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌比濁管比濁，并用2％小牛血清TPY培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)菌濃度，嗜酸乳桿菌為1×107/ml，其他三種致病菌均為1×105/ml。(4)試驗(yàn)分組嗜酸乳桿菌菌液分別與三種致病菌菌液等量混合于三角瓶中(9ml+9ml)混合構(gòu)成對(duì)照組。
試驗(yàn)組與對(duì)照組均置于37℃水溶液培養(yǎng)至72小時(shí)或96小時(shí)。(5)菌量測(cè)定上述各試驗(yàn)組、對(duì)照組在培養(yǎng)起始(0時(shí))、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)各取樣，分別測(cè)定試驗(yàn)組三角瓶中的嗜酸乳桿菌和三種致病菌的細(xì)菌生產(chǎn)濃度。同時(shí)也測(cè)定各對(duì)照組的菌量。菌量測(cè)定方法參照1995年版《中國(guó)生物制品規(guī)程》規(guī)定的活菌計(jì)數(shù)方法進(jìn)行，并以菌量濃度的對(duì)數(shù)值統(tǒng)計(jì)入表。(三)結(jié)果與分析(1)表5顯示嗜酸乳桿菌SL8404對(duì)三種常見(jiàn)陰道致病菌的拮抗作用，表明當(dāng)SL9404株分別與大腸桿菌、淋球菌和白色念珠菌混合培養(yǎng)72-96小時(shí)生長(zhǎng)良好；每ml活菌濃度均在1×108個(gè)菌以上各試驗(yàn)組中SL9404株的活菌數(shù)量與對(duì)照組近似。(2)表5顯示試驗(yàn)組或?qū)φ战M中三種致病菌培養(yǎng)至12小時(shí)，活菌濃度已明顯增加，兩組菌量相近。(3)表5顯示試驗(yàn)組中的淋病菌培養(yǎng)至12小時(shí)以后，生長(zhǎng)明顯抑制，至24小時(shí)，每ml菌液活菌濃度已少于10個(gè)，而此時(shí)對(duì)照組的菌量仍與12小時(shí)的菌量保持一致。(4)表5顯示對(duì)照組大腸桿菌培養(yǎng)72小時(shí)，細(xì)菌濃度仍每ml大于108。試驗(yàn)組中大腸桿菌培養(yǎng)至24小時(shí)，活菌濃度也在108/ml以上，與對(duì)照組相似，但24小時(shí)后生長(zhǎng)明顯抑制。在48小時(shí)每ml菌液中活菌量低于105。(5)表5也顯示了試驗(yàn)組中白色念珠菌的生長(zhǎng)也有一定抑制，從培養(yǎng)12小時(shí)至96小時(shí)，其活菌濃度較對(duì)照組低。
表五 嗜酸乳桿菌SL9404株拮抗試驗(yàn)結(jié)果
(四)結(jié)論①嗜酸乳桿菌SL9404株在體外對(duì)淋病奈瑟氏菌的生長(zhǎng)可較快抑制。②嗜酸乳桿菌SL9404株在體外可抑制致病性大腸桿菌生長(zhǎng)。③嗜酸乳桿菌SL9404株在體外對(duì)白色念珠菌有一定作用。三、陰道用乳酸桿菌泡騰片對(duì)大鼠陰道刺激試驗(yàn)(中科院上海藥物所測(cè)定)雌性SD大鼠24只，分為3組，給藥組、賦形劑組和未處理組，每組8只。連續(xù)7天陰道給藥，每在觀(guān)測(cè)行為和外陰部情況。末次給藥后24小時(shí)取大鼠陰道組織肉眼檢查并作病理組織學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肉眼觀(guān)察未見(jiàn)外陰部明顯的異常反應(yīng)，病理組織學(xué)檢查無(wú)明顯病變。1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^(guān)察陰道用乳酸桿菌泡騰片連續(xù)7天大鼠陰道給藥后刺激反應(yīng)。2、受試藥物(1)名稱(chēng)陰道用乳酸桿菌泡騰片，白色橄欖狀片劑。(2)規(guī)格1.7×107CFU/片(0.25g/片)(3)提供單位上海信誼藥業(yè)有限公司(4)批號(hào)DM-032573、對(duì)照物(1)賦形劑0.25g/片，上海信誼藥業(yè)有限公司提供。(2)批號(hào)DM032504、動(dòng)物(1)來(lái)源、種屬、品系試驗(yàn)前予處理雌性SD大鼠24只，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證中科動(dòng)管第005號(hào)。單籠飼養(yǎng)，動(dòng)物自由攝食，飲水。實(shí)驗(yàn)前在中科院上海藥物研究所動(dòng)物房飼養(yǎng)一周。(2)體重242±24g(3)性別雌性(4)每組動(dòng)物物按體重隨機(jī)分為3組，每組8只，即受試物組、賦形劑和未處理組。(5)動(dòng)物房溫度23±2℃5、劑量(1)劑量設(shè)置臨床人用陰道用乳酸桿菌泡騰片106CFU/片/人。大鼠給藥劑量定為1.7×107CFU/片/只。局部用藥量約為人用劑量10倍。(2)每只動(dòng)物給藥容量0.25g/片/只。6、給藥途徑大鼠陰道給藥7、方法試驗(yàn)時(shí)將受試物輕輕置入大鼠陰道內(nèi)，在旁觀(guān)察確保藥物與陰道粘膜接觸直至溶解。每天一次，每次一片，連續(xù)7天，每天觀(guān)察大鼠行為和外陰部情況。末次給藥后24小時(shí)解剖進(jìn)行肉眼檢查并取材作組織學(xué)鏡檢。8、觀(guān)察指標(biāo)(1)肉眼觀(guān)察每天觀(guān)察大鼠行為反應(yīng)、陰道口情況。在末次給藥后24小時(shí)處死大鼠，取出陰道組織，觀(guān)察有無(wú)充血、紅腫等刺激現(xiàn)象。(2)組織學(xué)檢查每只大鼠陰道組織取樣作病理組織學(xué)檢查。(3)結(jié)果判斷試驗(yàn)結(jié)果與未處理組進(jìn)行比較判斷。9、結(jié)果(1)肉眼觀(guān)察連續(xù)7天大鼠給藥后行為正常，肉眼觀(guān)察外陰部無(wú)明顯異常反應(yīng)。末次給藥后24小時(shí)，取出陰道組織，未見(jiàn)充血、紅腫等刺激現(xiàn)象。
(2)組織學(xué)檢查病理組織學(xué)觀(guān)察陰道上皮均為復(fù)層鱗狀上皮，結(jié)構(gòu)正常，均未見(jiàn)異常變化。
10、結(jié)論陰道用乳酸桿菌泡騰片1.7×107CFU/片/只連續(xù)7天，給藥后肉眼觀(guān)察大鼠陰道無(wú)明顯異常反應(yīng)，病理組織學(xué)檢查亦未見(jiàn)異常變化。陰道用乳酸桿菌泡騰片對(duì)大鼠陰道無(wú)刺激的反應(yīng)。
四、大鼠陰道用乳酸桿菌泡騰片最大耐受量試驗(yàn)(由中科院藥物所測(cè)定)雌性SD大鼠24只，分為4組。測(cè)試一次陰道給乳酸桿菌泡騰片的急性毒性。劑量為1.7×107、6.9×109CFU/片/只，另設(shè)賦形劑組和未處理組，共4個(gè)劑量組。連續(xù)14天觀(guān)察行為反應(yīng)并記錄體重增長(zhǎng)情況。給藥后大鼠活動(dòng)正常，無(wú)明顯異常變化，無(wú)動(dòng)物死亡。第15天解剖所有動(dòng)物，肉眼檢查內(nèi)臟未見(jiàn)明顯病變。大鼠對(duì)乳酸桿菌泡騰片最大耐受量>6.9×109DFU/只。按絕對(duì)量計(jì)算，為人用量106CFU/片/人的1000倍以上。
1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^(guān)察大鼠陰道一次接觸受試物后所產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)、死亡情況及體重的影響。
2、受試藥物(1)名稱(chēng)陰道用乳酸桿菌泡騰片，白色橄欖狀片劑。
(2)規(guī)格1.7×107、6.9×109CFU/片(0.25g/片)(3)提供單位上海信誼藥業(yè)有限公司(4)批號(hào)DM—03257；DM—032553、對(duì)照物(1)賦形劑0.25g/片，上海信誼藥業(yè)有限公司提供。
(2)批號(hào)DM032504、動(dòng)物來(lái)源、種屬、合格證雌性SD大鼠4只，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證中科動(dòng)管第005號(hào)。試驗(yàn)前一周適應(yīng)性飼養(yǎng)。飼料購(gòu)自中英合資上海西普爾一必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。自由取水、攝食，飼養(yǎng)溫度為23±2℃。
5、劑量(1)劑量設(shè)置臨床人用陰道用乳酸桿菌泡騰片106CFU/片/人(1g/片)。動(dòng)物的有效劑量為106CFU/片/只。為觀(guān)測(cè)毒性反應(yīng)用盡可能大的劑量和考慮到制片的技術(shù)關(guān)系。設(shè)1.7×107CFU/片/只和6.9×109CFU/片/只。按局部用藥量計(jì)算分別相當(dāng)臨床用量10和1000倍，并設(shè)賦形劑和未處理組。
(2)每只動(dòng)物接受容量l片/只。
6、給藥途徑；大鼠陰道給藥。
7、方法試驗(yàn)時(shí)先用生量鹽水沖洗陰道，然后將受試物輕輕置入大鼠陰道內(nèi)。在旁觀(guān)察6小時(shí)確保藥片與陰道粘膜接觸。給藥后即觀(guān)察動(dòng)物反應(yīng)情況，若死亡動(dòng)物即進(jìn)行解剖，檢查內(nèi)臟。
8、觀(guān)察指標(biāo)(1)觀(guān)察期14天(2)毒性反應(yīng)觀(guān)察檢查大鼠外觀(guān)、行為、進(jìn)食、糞便、體重增長(zhǎng)等情況，死亡動(dòng)物進(jìn)行尸解。第15天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，存活大鼠解剖，檢查心、肺、肝、脾、腎等臟器病變。
9、結(jié)果大鼠陰道給于乳酸桿菌泡騰片后，外觀(guān)行為、進(jìn)食和糞便等情況，均未見(jiàn)異常變化，無(wú)動(dòng)物死亡，大鼠體重增長(zhǎng)給藥組和賦形劑組與未處理組相似。體重增長(zhǎng)情況列入下表表六、陰道用乳酸桿菌泡騰片對(duì)大鼠體重的影響
10、結(jié)果評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)用泡騰片，所含的細(xì)菌為臨床用量10或1000倍。因大鼠體積比人小得多，故泡騰片的大小也相應(yīng)縮小，相對(duì)來(lái)說(shuō)含菌密度較人用泡騰片要高。從制片技術(shù)上來(lái)說(shuō)已經(jīng)達(dá)到極限了。大鼠陰道給于乳酸桿菌泡騰片1.7×107、6.9×109CFU/片/只，連續(xù)觀(guān)察14天，給藥后大鼠活動(dòng)正常，無(wú)明顯異常變化，無(wú)動(dòng)物死亡。給藥組和賦形劑組大鼠體重增長(zhǎng)與示處理組相似。大鼠陰道用乳酸桿菌泡騰片的最大耐受量大于6.9×109CFU/只。五、嗜酸乳桿菌SL9404株穩(wěn)定性試驗(yàn)(由中國(guó)藥品生物制品檢定所測(cè)定)1、目的觀(guān)察嗜酸乳桿菌SL9404株連續(xù)傳代30代后的穩(wěn)定性。2、材料與方法(1)菌株嗜酸乳桿菌SL9404株由上海信誼藥業(yè)公司提供。(2)培養(yǎng)基①M(fèi)RS液體培養(yǎng)基-傳代用②MRS瓊脂培養(yǎng)基-特征檢查用③糖生化反應(yīng)培養(yǎng)基-觀(guān)察生化反應(yīng)用④PYG液體培養(yǎng)基-測(cè)代謝產(chǎn)物用(3)方法菌種通過(guò)MRS液體培養(yǎng)基連續(xù)傳代30代后，將原代株與30代株進(jìn)行生物學(xué)表型特征(包括生長(zhǎng)特性、菌落形態(tài)、染色鏡檢、生化反應(yīng)、藥敏試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)及代謝產(chǎn)物中乳酸含量測(cè)定)和遺傳學(xué)特征(G+C Mol％測(cè)定)的比較。3、結(jié)果原代株與30代株特性檢查見(jiàn)表7所列。
表7嗜酸乳桿菌9404原代株與30代特征穩(wěn)定性比較
結(jié)論9404菌種連續(xù)傳代30代，生物學(xué)和遺傳學(xué)特性穩(wěn)定。
9403，9405菌種生物學(xué)、遺傳學(xué)特征比較
結(jié)論(1)兩株菌生長(zhǎng)特征、菌落形態(tài)及染色鏡檢符合乳桿菌特征。(2)兩株菌均能產(chǎn)生乳酸。(3)9403株核糖、松三糖、甘露醇、山梨醇生化反應(yīng)不符合伯杰氏手冊(cè)規(guī)定的嗜酸乳桿菌特征。
9405株阿拉伯糖、核糖、松三糖、甘露醇生化反應(yīng)不符合伯杰氏手冊(cè)規(guī)定的嗜酸乳桿菌特征。(4)兩株菌的DNA的G+C Mol％測(cè)定值高于伯杰氏手冊(cè)規(guī)定的哮酸乳桿菌的G+C Mol％含量。
婦女陰道感染是婦女常見(jiàn)的疾病，是婦女陰道中微生態(tài)平衡失調(diào)所引起疾病，主要與性激素水平、性生活過(guò)度、安宮內(nèi)節(jié)育器、以及抗菌治療擾亂陰道正常菌群等有關(guān)。婦女陰道感染的發(fā)病率占婦女疾病中的比率較高，通過(guò)給予補(bǔ)充陰道益生菌，使益生菌在陰道中定植，從而阻止陰道中細(xì)菌的繁衍，起到治療陰道炎的效果和作用，減輕和解脫婦女的疾苦。本發(fā)明具有極大的經(jīng)濟(jì)效益潛力和極高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。
實(shí)例一 嗜酸乳桿菌對(duì)人體陰道上皮細(xì)胞(VEC)的明顯粘附通過(guò)這個(gè)試驗(yàn)，測(cè)試了嗜酸乳桿菌SL9404對(duì)人體陰道上皮細(xì)胞的粘附能力。
取人體陰道上皮細(xì)胞懸液及菌懸液各1ml，混合，37℃，2小時(shí)培養(yǎng)；涂片，室溫干燥，甲醇固定10min，革蘭氏染色，鏡下觀(guān)察細(xì)菌在人體陰道上皮細(xì)胞上粘附情況并計(jì)數(shù)。
得到的結(jié)果在表一中表示，表明嗜酸乳桿菌SL9404對(duì)人體陰道上皮細(xì)胞有很強(qiáng)的粘附能力，適于制備本發(fā)明的制劑。
表一 嗜酸乳桿菌SL9404株對(duì)VEC的粘附作用
實(shí)例二 嗜酸乳桿菌的抗大腸桿菌和白色念珠菌效應(yīng)嗜酸乳桿菌SL9404以競(jìng)爭(zhēng)方式干擾大腸桿菌和白色念珠菌在人體陰道上皮細(xì)胞的粘附的能力得到檢驗(yàn)。
先取1ml大腸桿菌菌液或1ml白色念珠菌菌液與1ml VEC懸液混勻，37℃預(yù)培養(yǎng)30min后，再加入1ml乳桿菌菌液，混勻，繼續(xù)37℃，2小時(shí)，按上述實(shí)例一試驗(yàn)方法鏡下觀(guān)察并計(jì)數(shù)。
得到的結(jié)果在表二中表示，表明嗜酸乳桿菌SL9404減少了大腸桿菌和白色念珠菌在人體陰道上皮細(xì)胞的粘附。
表二 嗜酸乳桿菌SL9404株對(duì)大腸桿菌44113或白色念珠菌10231在VEC粘附作用影響
實(shí)例三 嗜酸乳桿菌在體外對(duì)淋病奈瑟氏菌、大腸桿菌、白色念珠菌生長(zhǎng)的抑制嗜酸乳桿菌菌液分別與三種致病菌菌液等量混合于三角瓶(9ml+9ml)構(gòu)成試驗(yàn)組。同時(shí)每種菌液與等量2％小牛血清TPY培養(yǎng)液(9ml+9ml)混合構(gòu)成對(duì)照組。試驗(yàn)組與對(duì)照組均置于37℃水浴培養(yǎng)至72小時(shí)或96小時(shí)。各試驗(yàn)組、對(duì)照組在培養(yǎng)起始(0小時(shí))、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)各取樣，分別測(cè)定試驗(yàn)組三角瓶中的嗜酸乳桿菌和三種致病菌的細(xì)菌生長(zhǎng)濃度。同時(shí)也測(cè)定各對(duì)照組的菌量。
得到的結(jié)果在表三中表示，表明嗜酸乳桿菌SL9404在體外對(duì)淋病奈瑟氏菌的生長(zhǎng)可較快抑制，亦可抑制致病性大腸桿菌的生長(zhǎng)，對(duì)白色念珠菌也有一定作用。
表三 嗜酸乳桿菌SL9404株拮抗試驗(yàn)結(jié)果
實(shí)例四 嗜酸乳桿菌凍干菌粉經(jīng)與賦形劑組合，制劑而成片劑的處方。
壓片前上述物料需過(guò)40目篩，并充分混合后，在旋轉(zhuǎn)壓片機(jī)中，用橢圓形沖模壓制成片劑，片重為1000mg的陰道用片劑。本片在數(shù)分鐘之內(nèi)即能軟化。實(shí)例五 嗜酸乳桿菌凍干菌粉經(jīng)與弱酸和碳酸鹽配方，制劑成陰道泡騰片的處方。
制備上述片劑時(shí)，碳酸氫鈉和碳酸鈣需預(yù)先制成顆粒，在旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī)中，用橢圓形沖模壓制成陰道用片劑，片重為1000mg。經(jīng)發(fā)泡量檢查，結(jié)果在2ml水中20分鐘發(fā)泡量大于6ml，小于10ml。實(shí)例六
將凍干菌粉裝于鋁箔小袋中，另將無(wú)菌生理鹽水裝于塑料小瓶中。使用時(shí)將凍干菌粉倒入上述塑料小瓶中，混勻后使用實(shí)例七 陰道軟膏(5g管)
將羊毛脂、凡士靈預(yù)熱到35-42℃，使全部融化，再加入膠態(tài)化二氧化硅和凍干菌粉攪拌，使均勻，裝入軟管內(nèi)。實(shí)例八 乳桿菌噴霉劑(10g)的制備
制備上述噴霧劑時(shí)，先將凍干菌粉，PVP和無(wú)菌生理鹽水配制成混懸液，灌入噴霧劑專(zhuān)用瓶中，將噴霧劑專(zhuān)用噴頭密閉后，灌入二氧化碳。
權(quán)利要求
1.一種含嗜酸乳桿菌的藥物制劑，其特征在于該制劑是由嗜酸乳桿菌與藥用賦形劑組成的。
2.一種如權(quán)利要求1所述的一種含嗜酸乳桿菌的藥物制劑的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)制備嗜酸乳桿菌菌粉將陰道中分泌物進(jìn)行分離、純化后獲得的嗜酸乳桿菌SL9404菌株于MRS瓊脂斜面上劃線(xiàn)傳代，經(jīng)37±1℃培養(yǎng)48h。選取飽滿(mǎn)、色澤均勻、中等偏大的菌落，再次劃線(xiàn)接種于茄子瓶?jī)?nèi)的MRS瓊脂斜面上，經(jīng)37±1℃培養(yǎng)48h。轉(zhuǎn)種接入牛肉皰肉管，37±1℃培養(yǎng)20-50h。取1-4支皰肉管轉(zhuǎn)入300ml牛奶發(fā)酵培養(yǎng)基或5-20％西紅柿汁發(fā)酵培養(yǎng)基或牛奶+西紅柿汁發(fā)酵培養(yǎng)基，37±1℃培養(yǎng)8-48h發(fā)酵培養(yǎng)，逐步放大至大罐發(fā)酵，離心，冷凍干燥后制得菌粉；(2)制備藥劑按處方量稱(chēng)取嗜酸乳桿菌和藥用賦形劑，按常規(guī)藥物制劑方法制成各種制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含嗜酸乳桿菌或其菌群的藥物制劑，其特征在于其中所述的藥用賦型劑為玉米淀粉、預(yù)膠化淀粉、羧甲基淀粉鈉、糊精、乳糖、異乳糖、甘露醇、葡萄糖、維生素C、檸檬酸、檸檬酸一鈉、檸檬酸二鈉、酒石酸、富馬酸、硼酸或酸性氨基酸類(lèi)谷氨酸、天冬氨酸弱酸；微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉(鈣)、羥丙甲纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、碳酸鈣、碳酸氫鈉、硬脂酸鎂、羊毛脂、聚乙二醇；添加劑是指食用脫脂奶粉、維生素C或谷氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含嗜酸乳桿菌的藥物制劑，其特征在于該制劑為液體形式、膏體形式或固體形式，片劑、膠囊劑、散劑、霜?jiǎng)?、乳膏劑、栓劑或噴霧劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了含嗜酸乳桿菌的藥物制劑。該制劑是由嗜酸乳桿菌和藥用賦形劑組成的。本發(fā)明的制劑為液體、固體、霜?jiǎng)?、乳膏劑、栓劑或噴霧劑?？捎糜谥委熀皖A(yù)防陰道疾病和感染及淋病等。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1345589SQ00125469
公開(kāi)日2002年4月24日 申請(qǐng)日期2000年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月28日
發(fā)明者吳剛, 劉京, 夏凌云, 高原, 杜育華 申請(qǐng)人:上海信誼藥業(yè)有限公司