用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒及檢測方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于畜牧獸醫(yī)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒及檢測方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國動(dòng)物飼料中抗生素的禁用，新型的綠色添加劑的開發(fā)成為熱點(diǎn)。目前益生菌制劑不斷發(fā)展，但是在其定性、定量檢測的方法還不夠科學(xué)和快速，這在一定程度上限制了益生菌制劑的發(fā)展。通常采用生理生化反應(yīng)和選擇性培養(yǎng)基純培養(yǎng)分離計(jì)數(shù)的傳統(tǒng)方法，極易因?yàn)榫N差異導(dǎo)致的檢測效率受限、檢測結(jié)果不穩(wěn)定，除此之外，傳統(tǒng)方法也會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間和資源。相對(duì)于PCR技術(shù)來說，是定性到定量的飛躍，因其特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確和高效的特點(diǎn)成為分子生物學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域非常重要的定量檢測方法。通過種屬特異性PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，建立豬飼料中嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測方法，可以提高檢測效率、簡化檢測程序，并促進(jìn)飼料行業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，為益生菌和飼料產(chǎn)業(yè)的快速和長遠(yuǎn)發(fā)展提供技術(shù)保障。
[0003]目前飼料中益生菌檢測存在的主要問題之一是飼料樣本的處理，飼料均是顆粒飼料，不同于含益生菌的液體產(chǎn)品，如益生菌發(fā)酵奶，采用什么方法可以使飼料中的益生菌釋放出來，而數(shù)量不會(huì)改變這是對(duì)飼料中益生菌檢測的難題之一，本課題組對(duì)經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)如果采用常規(guī)的粉碎、稀釋的方法，無法使飼料中的益生菌充分釋放；如果對(duì)飼料先進(jìn)行粉碎，然后再溶于一定量的液體中進(jìn)行振蕩，使益生菌充分釋放的話，振蕩時(shí)間過長，溫度過高，則飼料中的營養(yǎng)成份會(huì)使得益生菌大量的擴(kuò)增，振蕩時(shí)間過短則菌液無法溶于液體中。鑒于此本發(fā)明將粉碎的飼料溶于一定量的溶液中，低溫(4°C )下振蕩1個(gè)小時(shí)后，對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋后，作為后續(xù)定性、定量檢測的樣本，誤差比較小。因?yàn)榈蜏氐臈l件下振蕩一個(gè)小時(shí)，飼料中的益生菌既可以充分釋放，又不會(huì)大量擴(kuò)增，所測得的益生菌的數(shù)目能否真實(shí)反應(yīng)飼料中益生菌的添加量。飼料中益生菌進(jìn)行定性、定量檢測是存在的另一個(gè)難題是目的基因的選擇，目前對(duì)微生物進(jìn)行定性、定量檢測時(shí)大多數(shù)都是選擇高度保守的16sRNA基因作為目的基因，但是對(duì)已經(jīng)報(bào)道的同一種微生物的基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，同一種微生物含有的的16sRNA基因的拷貝數(shù)并不一致，如以大腸桿菌為例，目前報(bào)道的大腸桿菌的基因組中16sR ΝΑ基因的拷貝數(shù)從4到8不等，因此以16sRNA基因作為目的基因進(jìn)行定量檢測時(shí)，16s RNA基因的拷貝數(shù)并不能真正的反應(yīng)出微生物的菌落數(shù)，鑒于此本發(fā)明對(duì)目前已經(jīng)報(bào)道的益生菌基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)的分析比對(duì)，選擇了序列保守的單拷貝基因作為目的基因來進(jìn)行益生菌的檢測，這樣目的基因的拷貝數(shù)就可以真實(shí)的反應(yīng)出微生物的菌落數(shù)。
[0004]本申請(qǐng)針對(duì)飼料中含有的嗜酸乳桿菌，通過對(duì)已經(jīng)報(bào)道的嗜酸乳桿菌基因組序列的比對(duì)分析，選取嗜酸乳桿菌的保守基因作為目的基因，自行設(shè)計(jì)嗜酸乳桿菌的基因序列的種屬特異性引物，利用該引物進(jìn)行種屬特異性PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR圖譜分析，建立了豬飼料中嗜酸乳桿菌的快速定性和定量測定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供了用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒，該試劑盒包括引物 5’ -CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA-3’、5’ -CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC-3，。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒的檢測方法，方法簡單，重復(fù)性高，結(jié)果準(zhǔn)確。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒的應(yīng)用。
[0008]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施:
[0009]用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒，該試劑盒包括引物5’ -CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA-3’ 和 5’ -CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC-3’。
[0010]用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒的檢測方法，包括飼料樣品預(yù)處理的方法，該方法包括:
[0011 ] 經(jīng)過充分粉碎混勻的飼料25g與225mL的滅菌生理鹽水混合，在4°C以100轉(zhuǎn)/分的速度震蕩l_2h，配成10%的均勻稀釋液。對(duì)均勻稀釋液進(jìn)行10倍遞增稀釋，選擇2個(gè)以上適宜的稀釋度，根據(jù)需要，提取細(xì)菌基因組DNA或RNA。
[0012]用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒的應(yīng)用，其應(yīng)用包括利用該試劑盒制備成用于嗜酸乳桿菌的檢測試劑，或利用該試劑盒進(jìn)行嗜酸乳桿菌的定性檢測，或利用該試劑盒進(jìn)行嗜酸乳桿菌的定量檢測，或利用該試劑盒同時(shí)進(jìn)行嗜酸乳桿菌的定性和定量的檢測。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0014](1)本發(fā)明所采用的飼料樣本的處理方法使得在益生菌的提取過程中，益生菌的擴(kuò)增有限，同時(shí)飼料中的益生菌又可以充分釋放，這樣所測得值才能真實(shí)的反應(yīng)出飼料中的益生菌數(shù)目，為一種特異的適用于飼料中嗜酸乳桿菌提取方法，為本發(fā)明首創(chuàng)。
[0015](2)本發(fā)明對(duì)目前已經(jīng)報(bào)道的嗜酸乳桿菌及飼料中可能添加的如干酪乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、雙歧桿菌等其他益生菌所有的基因組序列進(jìn)行了比對(duì)分析，選擇了保守的單拷貝基因作為目的基因，并以該基因的保守序列設(shè)計(jì)了特異性的引物，以該引物對(duì)飼料中的嗜酸乳桿菌進(jìn)行定性、定量檢測，所得到數(shù)據(jù)才能真實(shí)的反應(yīng)出飼料中添加的嗜酸乳桿菌的數(shù)量。
[0016](3)本發(fā)明可以在不進(jìn)行益生菌純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，簡便、快速、準(zhǔn)確地定性、定量檢測豬飼料中嗜酸乳桿菌，整個(gè)過程對(duì)飼料中嗜酸乳桿菌的檢測程序簡單、檢測效率高、準(zhǔn)確性好，靈敏度高，最低檢測標(biāo)準(zhǔn)要比傳統(tǒng)的方法低的多，而且重復(fù)性好。
【附圖說明】
[0017]圖1為嗜酸乳桿菌的定性檢測示意圖。
[0018]其中泳道M:DL2000marker ；1:干酪乳桿菌；2:植物乳桿菌；3:保加利亞乳桿菌；4:屎腸球菌；
[0019]5:糞腸球菌；6:兩歧雙歧桿菌；7:動(dòng)物雙歧桿菌；8:大腸桿菌；9:陽性對(duì)照(含有目的基因的質(zhì)粒為模版)；10:嗜酸乳桿菌；11:添加有嗜酸乳桿菌的飼料；12陰性對(duì)照。
[0020]圖2為Real-time PCR對(duì)嗜酸乳桿菌引物特異性的驗(yàn)證示意圖。
[0021]其中A.嗜酸乳桿菌B.植物乳桿菌C.保加利亞乳桿菌D.干酪乳桿菌E.糞腸球菌F.屎腸球菌G.雙歧桿菌H.青春雙歧桿菌。
[0022]圖3為不同濃度嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌種LA-14的擴(kuò)增曲線示意圖。
[0023]其中A.10 1稀釋；B.10 2稀釋；C.10 3稀釋；D.10 4稀釋；E.10 5稀釋；F.10 6稀釋；G.10 7稀釋;Η.10 8稀釋。
[0024]圖4為嗜酸乳桿菌定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]本發(fā)明實(shí)施例所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。所用試劑或材料，均已公開。
[0026]pMD18-T克隆載體核DH5 α感受態(tài)細(xì)胞均購自Takara生物科技有限公司，Trizol試劑是由Invitrogen公司專供提取的RNA的產(chǎn)品；DNase I是TaKaRa公司產(chǎn)品；此過程中使用的氯仿、異丙醇、無水乙醇等試劑是天津市化學(xué)試劑三廠生產(chǎn)的產(chǎn)品。嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌種購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。
[0027]實(shí)施例1:
[0028]嗜酸乳桿菌目的檢測基因的選取:
[0029]本發(fā)明對(duì)目前已經(jīng)報(bào)道的嗜酸乳桿菌及飼料中可能添加的如干酪乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、雙歧桿菌等其他益生菌所有的基因組序列進(jìn)行了大量比對(duì)分析，選擇定性、定量檢測的目的基因，該目的基因在嗜酸乳桿菌基因組中是保守的看家基因，而且是單拷貝基因，以該基因的保守序列設(shè)計(jì)了特異性的引物，對(duì)飼料中的嗜酸乳桿菌進(jìn)行定性、定量檢測，所得到數(shù)據(jù)才能真實(shí)的反應(yīng)出飼料中添加的嗜酸乳桿菌的數(shù)量。針對(duì)該目的基因設(shè)計(jì)的引物為:5 ’ -CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA-3 ’和5 ’ -CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC-3 ’