本發(fā)明屬于遺傳檢測領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測肝癌易感性的試劑盒及其SNP標志物。
背景技術(shù)：
肝癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，其中，慢性乙肝和慢性丙肝是肝癌的主要風險因子，而中國是世界上的乙肝大國，乙肝發(fā)展成為肝癌的風險因素有很多，其中遺傳因素是乙肝發(fā)展成為肝癌的重要風險因素，而造成個體之間差異的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)之一是單核苷酸多態(tài)性。
采用單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphsm，SNP)作為基因組標志的關(guān)聯(lián)分析方法是目前最常用的疾病的遺傳易感基因檢測方法之一。SNP是指基因組水平上由單核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的發(fā)生頻率大于1％，它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。SNP遺傳穩(wěn)定性強，易于檢測，位于基因內(nèi)部的SNP能直接影響到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達水平，進而影響到組織、器官乃至生理功能。
對常見疾病相關(guān)多種遺傳標識進行早期檢測和系統(tǒng)評估將有助于對疾病的早期預防、診斷和治療。目前，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量與各種常見疾病相關(guān)的遺傳學標識，然而，由于缺乏有足夠的靈敏度和可以對多種疾病相關(guān)標識進行廣泛(高通量檢測位點、高通量檢測樣本)篩查和檢驗的方法，使得這些常見疾病的遺傳學標識無法廣泛應用。此外，目前常見疾病遺傳標識缺乏系統(tǒng)、有效的整合，大大制約了常見疾病早期預防、診斷和治療方面的發(fā)展?，F(xiàn)有檢測只有單一種疾病或一類疾病的遺傳標識檢測，檢測范圍有限，且某些常見疾病尚無早期檢測的方法。
目前，一些傳統(tǒng)醫(yī)學手段，如組織細胞檢測存在著其固有的缺陷，取材位置不當、組織細胞標本材料不足或認為經(jīng)驗不足等都將導致鼻咽癌誤診。其他技術(shù)例如影像學雖然已被廣泛應用于肝癌的檢查和診斷，但其在疾病鼻咽癌程度的定性上仍存在著很大的局限性。
綜上所述，研發(fā)一種用于通過多個易感位點檢測肝癌易感性的試劑盒對肝癌發(fā)病風險的預測、預防、診斷提供依據(jù)具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提出一種用于檢測肝癌易感性的SNP標志物、SNP標志物的PCR擴增引物和單堿基延伸引物及其試劑盒，本發(fā)明的14個SNP位點為肝癌的患病風險評估、診斷參考提供重要依據(jù)。
本發(fā)明的目的將通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)：
一種用于檢測肝癌易感性的SNP標志物，所述SNP標志物包括14個SNP位點，所述14個SNP位點為rs9267673、rs4678680、rs12100561、rs4444903、rs455804、rs1800562、rs2596542、rs9275319、rs9275572、rs17401966、rs28362491、rs230496、rs7574865和rs1800629。
上述的SNP標志物的PCR擴增引物和單堿基延伸引物，
所述檢測rs9267673的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：3；
所述檢測rs4678680的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：6；
所述檢測rs12100561的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：9；
所述檢測rs4444903的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：12；
所述檢測rs455804的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：15；
所述檢測rs1800562的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：18；
所述檢測rs2596542的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：21；
所述檢測rs9275319的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：24；
所述檢測rs9275572的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：27；
所述檢測rs17401966的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：30；
所述檢測rs28362491的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：33；
所述檢測rs230496的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：36；
所述檢測rs7574865的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：39；
所述檢測rs1800629的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：42。
一種用于檢測肝癌易感性的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求2所述SNP標志物的PCR擴增引物和單堿基延伸引物，用于檢測外周血DNA中14個SNP位點為rs9267673、rs4678680、rs12100561、rs4444903、rs455804、rs1800562、rs2596542、rs9275319、rs9275572、rs17401966、rs28362491、rs230496、rs7574865和rs1800629。
上述的一種用于檢測肝癌易感性的試劑盒，所述試劑盒還包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反應緩沖液、酶切反應緩沖液、去離子水。
本發(fā)明所述的試劑盒是以本發(fā)明人基于多個國際和國內(nèi)大樣本量的肝癌人群和正常人群肝癌易感基因篩查結(jié)果的前期研究為基礎(chǔ)，通過本發(fā)明人自主設計的肝癌SNP篩選流程，從NCBI-pubmed數(shù)據(jù)庫中篩選符合條件的SNP位點：1)查找與肝癌相關(guān)的文獻，通過影響因子和發(fā)表年限進行過濾；2)查看候選文獻的摘要，進一步排除與肝癌SNP研究無關(guān)的文獻；3)閱讀文獻，找到肝癌對應的SNP位點；4)以選取的SNP位點和肝癌為關(guān)鍵詞再一次查閱文獻；5)判斷選取的SNP位點是否與肝癌密切相關(guān)，選取與肝癌最密切相關(guān)的SNP位點、對應OR值以及突變堿基；6)將上一步驟獲得的SNP位點，通過Sequenom公司軟件Typer 4.0進行在線評估，獲得最終的14個SNP位點列表。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種用于檢測肝癌易感性的檢測方法與試劑盒，還達到了以下效果：本發(fā)明的14個SNP位點經(jīng)過文獻論證，具有較高的實用性，可用于肝癌的早期評估和大規(guī)模篩查，并且該14個位點檢出成功率高、技術(shù)重現(xiàn)性好、性價比高，為肝癌的患病風險評估、診斷參考提供重要依據(jù)，以實現(xiàn)對肝癌疾病的早期評估。
以下便結(jié)合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步的詳述，以使技術(shù)方案更易于理解、掌握。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得，下面實施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明所為的等效實施或變更，均應包含于本專利保護范圍中。
實施例1用于檢測肝癌易感性相關(guān)的SNP位點
其中，rs9267673位于基因C2區(qū)域，rs4678680位于基因CCR4區(qū)域，rs12100561位于基因EFCAB11區(qū)域，rs4444903位于基因EGF區(qū)域，rs455804位于基因GRIK1區(qū)域，rs1800562位于基因HFE區(qū)域，rs2596542、rs9275319和rs9275572位于基因HLA區(qū)域，rs17401966位于基因KIF1B區(qū)域，rs28362491位于基因NFKB1區(qū)域，rs230496位于基因NFKBIA區(qū)域，rs7574865位于基因STAT4區(qū)域，rs1800629位于基因TNF區(qū)域。
實施例2檢測肝癌易感性的試劑盒
一、試劑盒的制備：
1、設計和合成所述14個SNP位點的PCR擴增引物和單堿基延伸引物。待測SNP位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物詳見表1
表1待測SNP位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物
2、試劑盒還包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反應緩沖液、酶切反應緩沖液、去離子水。
二、試劑盒的檢測方法：
1、DNA的提取
1.1口腔拭子DNA提取
1)將口腔拭子放在2ml離心管中，加入400μl PBS。
2)加入20μl QIAGEN Protease和400μlBuffer AL。立即渦旋15s混勻。為了保證有效的裂解，樣品和Buffer AL必須立即并充分混合。
3)56℃孵育10min。短暫離心。
4)加入400μl乙醇(96-100％)到樣品中，渦旋混勻。短暫離心以使管蓋上無液體。
5)將液體轉(zhuǎn)移至離心柱，8000rpm(6000×g)離心1min。
6)柱子放入新的2ml EP管，加500μl Buffer AW1，8000rpm離心1min，棄EP管和廢液。
7)柱子放入新的2mlEP管，加500μl Buffer AW2，14000rpm(20,000×g)離心3min，丟棄EP管和廢液。
8)將柱子放入新的2mlEP管，14000rpm空管離心1min，丟棄EP管。
9)將柱子放入新的1.5mlEP管，加120μl Buffer AE，室溫孵育5min，8000rpm離心1min，-20℃保存。
1.2全血DNA提取
1)向1.5ml EP管中加入20μl QIAGEN Protease。
2)向管中加200μl全血樣品。注：先加入酶的目的是保證酶與血液的混勻。
3)加200μl Buffer AL，渦旋混勻15s。
4)56℃孵育10min，短暫離心。注：延長孵育時間不能增加產(chǎn)量或提高質(zhì)量。
5)加入200μl無水乙醇，渦旋15s后，短暫離心以使管蓋上無液體。
6)繼續(xù)口腔拭子5～10步驟。
2、PCR擴增
2.1在一個新的1.5mlEP管中配制PCR擴增反應體系，見表2
表2PCR擴增反應體系
以上試劑混勻后每孔各加2μl。
2.2每孔依次加入DNA 10ng/ul 1μl，0.25uM Primer Mix 2μl，總體積5μl。
2.3在兼容96孔板的PCR儀上設定PCR反應條件為：94℃ 4min，94℃ 20s，56℃ 30min，72℃ 1min，45個循環(huán)；72℃ 3min；4℃保持。將96孔PCR反應板放置于PCR儀上，啟動PCR反應。
3、PCR產(chǎn)物堿性磷酸酶處理
3.1在PCR反應結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，蝦堿性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dNTPs。
3.2配制堿性磷酸酶處理反應體系，見表3
表3堿性磷酸酶處理反應體系
以上試劑混勻后每孔加2μl。
3.3在兼容96孔板的PCR儀上，設定PCR反應條件：37℃ 40min；85℃ 5min；4℃保持，啟動PCR儀進行堿性磷酸酶處理。
4單堿基延伸
4.1在堿性磷酸酶處理結(jié)束后，進行單堿基延伸反應。
4.2配制單堿基延伸反應體系，見表4
表4單堿基延伸反應體系
以上試劑混勻后每孔加1.06μl
4.3每孔加入iPLEX Extend Primer Mix 0.94μl，總體積9μl。
4.4在兼容96孔板的PCR儀上，設定PCR反應條件：94℃ 30s，94℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s；52℃ 5s，80℃ 5s 4個循環(huán)；94℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s 39個循環(huán)；72℃ 3min；4℃維持。啟動PCR儀進行單堿基延伸反應。
5、樹脂純化
5.1將Clean Resin樹脂平鋪到6mg的樹脂板中；
5.2加16μl水到延伸產(chǎn)物的對應孔內(nèi)；
5.3將干燥后的樹脂倒入延伸產(chǎn)物板中，封膜，低速垂直旋轉(zhuǎn)15min，使樹脂與反應物充分接觸；
5.4 3000rpm 5min離心使樹脂沉入孔底部。
6、芯片點樣
啟動MassARRAY NanodispenserRS1000點樣儀，將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至96孔固體支持物上，制作出芯片。
7、質(zhì)譜檢測
將芯片使用MALDI-TOF(matrix-assistedlaser desorption/ionization-time offlight)，基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜)分析，檢測結(jié)果使用TYPER4.0軟件(Sequenom)分型并輸出結(jié)果，分析受試者肝癌發(fā)生風險，以實現(xiàn)對疾病的早期評估。
實施例3與肝癌密切相關(guān)的14個SNP位點引用的文獻，見表5
表5與肝癌密切相關(guān)的14個SNP位點引用的文獻
實施例4根據(jù)實施例3中引用的文獻得出14個SNP位點與肝癌的關(guān)聯(lián)，見表6
表6 14個SNP位點與肝癌的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
實施例5 14個SNP位點的驗證
采用上述實施例2中試劑盒的質(zhì)譜檢測方法分析14個SNP位點，檢測結(jié)果使用TYPER4.0軟件(Sequenom)分型并輸出結(jié)果，其OR值與實施例4中表6的14個SNP位點與肝癌的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果相同，說明該14個位點具有較高的實用性，可用于肝癌的早期評估和大規(guī)模篩查，由于質(zhì)譜分析技術(shù)具有檢出成功率高、技術(shù)重現(xiàn)性好、性價比高，因此本發(fā)明采用的是質(zhì)譜檢測分析該14個位點檢出成功率高、技術(shù)重現(xiàn)性好、性價比高，為肝癌的患病風險評估、診斷參考提供重要依據(jù)，以實現(xiàn)對肝癌疾病的早期評估。
上述說明示出并描述了本發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應當理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市核子基因科技有限公司
<120> 一種用于檢測肝癌易感性的試劑盒及其SNP標志物
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