本發(fā)明涉及一種鑒別酸漿Physalis alkekengi var.franchetii的核苷酸序列、特異性標(biāo)記引物，以及一種利用該特異性引物對(duì)酸漿進(jìn)行快速鑒別的方法。

背景技術(shù)：

酸漿Physalis alkekengi var.franchetii是茄科(Solanaceae)酸漿屬(Physalis)一年生草本植物，又名錦燈籠、掛金燈。其原產(chǎn)于我國(guó)，在我國(guó)南北地區(qū)均有分布，多生長(zhǎng)于田邊、路旁、林緣、荒地，等。酸漿果實(shí)含有豐富的β－胡蘿卜素、維生素C、Ca等多種礦物質(zhì)和人體所需的18種氨基酸，可以生吃，也可以加工成果汁、罐頭等。酸漿是我國(guó)重要的傳統(tǒng)中藥材，最早記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》，現(xiàn)被《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版)收錄。酸漿宿萼含有甾體類、甾醇、黃酮及酸漿苦味素等重要化學(xué)成分，其具有清熱解毒、利咽化痰、利尿通淋之功效，可以用于咽喉音啞、痰熱咳嗽、小便不利、熱淋澀痛、濕疹、天皰瘡等治療。酸漿與小酸漿P.minima、苦蘵P.angulata及毛酸漿Physalis pubescens的葉、花及果實(shí)形狀相似度非常高，利用形態(tài)學(xué)鑒別方法很難將酸漿與其它三種酸漿屬植物區(qū)分開。因而，經(jīng)常會(huì)發(fā)生將小酸漿、苦蘵及毛酸漿錯(cuò)誤鑒定為酸漿的情況，這為酸漿資源的安全使用和保護(hù)帶來(lái)了很大困難。

對(duì)酸漿屬植物的鑒別主要依據(jù)表觀特征，但是酸漿屬植物的表型特征十分相似，且形狀特征易受生境、氣候、生理狀況等的影響而常常導(dǎo)致主觀辨別上的偏差，因此，僅靠細(xì)微表型差異難以準(zhǔn)確鑒定酸漿屬植物種類。DNA分子標(biāo)記尤其是特異性分子標(biāo)記技術(shù)彌補(bǔ)和克服了傳統(tǒng)分類方法的一些缺陷和難題，可以通過(guò)基因序列差異比較分析為植物鑒別、系統(tǒng)分類提供直接的證據(jù)。本專利首先運(yùn)用SCoT標(biāo)記方法，采用PCR技術(shù)獲得酸漿屬植物SCoT指紋圖譜。經(jīng)過(guò)大量篩選實(shí)驗(yàn)，獲得酸漿特異性條帶，通過(guò)切膠回收、TA克隆、測(cè)序等方法，開發(fā)獲得酸漿特異性標(biāo)記引物，對(duì)有效的鑒別和保護(hù)酸漿種質(zhì)資源具有非常重要的意義。該方法具有快速、簡(jiǎn)便、成本低、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，迄今為止，尚未有特異性分子標(biāo)記應(yīng)用于酸漿鑒別的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種鑒別酸漿的特征性核苷酸序列。

本發(fā)明采用PCR技術(shù)，利用SCoT標(biāo)記，經(jīng)過(guò)大量篩選實(shí)驗(yàn)，獲得酸漿特異性DNA片段，通過(guò)切膠回收、TA克隆、測(cè)序，獲得該DNA序列。具體序列為：

CAACAATGGCTACCACGAGACACAAAAGGGTGTGGGGCTTCTTTAGGGGATTAGTTTTTCCGCTCTATATGATAACCATACATTTGGTAGTAGCAGGACATACCCTCGAATAGATCTTTGGACAATTGGTAGCCTTTGAAGAGGCTTATCATGAAACTTATGGTATGGGTGGTCAGGGAGTTCACCAGACGACGAGGACTGGTAGTGATCCATCTCGGGGTCGGAAAGATGAGGATCCCACGAGTTGTTTCATATGTGGTAGGTTTGGACACAAGGCCATGGAATGTTCCCTCCATGGGACTTTTTTATTGCAGCGACTTGAGCTGAGTAGTCAAGATTCAGGACAGATTCATCCAATTTTGCCTTCGGGTTCTCAAAACCTTTCTAATGATATCCGATCAGTAAGTAGAGGATGTGATAGACAGACTTATCAACCGCTGAGATTTCAACATCACGATCGATTGGGTCAGTACAGAGGCCAGAGCAGCCAGGGTAGCCAACTTGTTAGGGGTGCATCTTCGGGTTCAAGAGGTCGTGGTAGCCATTGTTG，如SEQ ID NO.1所示；

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供基于上述酸漿特征性核苷酸序列設(shè)計(jì)的鑒別酸漿的特異性標(biāo)記引物(ST5SJF/ST5SJR)，該引物序列如下：

ST5SJF:5’-AGGGTGTGGGGCTTCTTTA-3’，如SEQ ID NO.2所示；

ST5SJR:5’-GGCTGCTCTGGCCTCTGTA-3’，如SEQ ID NO.3所示；

上述特異性引物(ST5SJF/ST5SJR)，具有非常高的特異性，以該引物對(duì)酸漿屬植物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只與酸漿樣本DNA發(fā)生反應(yīng)，獲得463bp大小的特異性片段，而不與其他酸漿屬植物樣品反應(yīng)。運(yùn)用該特異性引物，通過(guò)常規(guī)PCR反應(yīng)即可以快速鑒別出酸漿樣品。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種利用上述特異性標(biāo)記引物對(duì)酸漿進(jìn)行快速鑒別的方法。

本發(fā)明采用上述引物組合(ST5SJF/ST5SJR)作為特異性擴(kuò)增引物，以待測(cè)酸漿屬植物基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若電泳結(jié)果出現(xiàn)463bp大小的特異性片段，則待測(cè)酸漿屬植物樣品為酸漿，反之則不是。

本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)為：ST5SJF/ST5SJR酸漿特異性標(biāo)記引物，若為其他酸漿屬植物樣品，為陰性反應(yīng)，能夠?qū)崿F(xiàn)酸漿樣品的快速準(zhǔn)確鑒別。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，且耗時(shí)短，半日即可完成。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明所述的酸漿的特征性核苷酸序列及對(duì)酸漿特異性引物ST5SJF和ST5SJR的位置圖，左側(cè)為5’端，右側(cè)為3’端，其中黑色部分為特異性引物ST5SJF/ST5SJR擴(kuò)增的序列片段大小及位置；

圖2是按照常規(guī)PCR方法，運(yùn)用SCoT標(biāo)記對(duì)酸漿屬植物樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)大量篩選實(shí)驗(yàn)，獲得的具有酸漿特征性條帶的電泳圖(箭頭所指的條帶是酸漿特有的條帶，分子量為550bp)，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)marker DL2000；通道1～4：小酸漿P.minima；5～13：苦蘵P.angulata；14～17：酸漿P.alkekengi var.franchetii；18～20：毛酸漿P.pubescens。

圖3是運(yùn)用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性標(biāo)記引物ST5SJF/ST5SJR對(duì)酸漿屬植物樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的電泳圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)marker DL2000；通道1～4：小酸漿P.minima；5～13：苦蘵P.angulata；14～17：酸漿P.alkekengi var.franchetii；18～20：毛酸漿P.pubescens。電泳圖顯示只有酸漿樣品擴(kuò)增出分子量為463bp的特異性DNA條帶。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明可以從分子水平上較為快速準(zhǔn)確的鑒別酸漿植物，通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：酸漿特征性核苷酸序列的制備

1.基因組DNA的提取

剪取酸漿屬植物樣品(包括小酸漿4個(gè)樣品、苦蘵9個(gè)樣品、酸漿4個(gè)樣品、以及毛酸漿3個(gè)樣品)新鮮葉片100mg放入研缽，立即加入液氮研磨至粉末，然后使用UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(購(gòu)于上海生工生物工程有限公司)提取基因組DNA，所得DNA用0.8％瓊脂糖膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，稀釋至50ng/μl。

2.SCoT–PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)

運(yùn)用SCoT標(biāo)記對(duì)酸漿屬植物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程有限公司合成，反應(yīng)體系(總體積20μl)：2μl 10×Buffer，2μl MgCl₂(25mM)，0.8μl dNTPs(10mM)，1μl引物(10μM)，0.5μl Taq酶(2U/μl)，1μl模板DNA(50ng/μl)，12.7μl ddH₂O。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；35個(gè)循環(huán)(94℃變性50s，55℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

經(jīng)過(guò)大量篩選實(shí)驗(yàn)，獲得具有酸漿特征性條帶的指紋圖譜(見圖2)，箭頭標(biāo)記的條帶(分子量為550bp，通道14～17)，是篩選出的酸漿特異性DNA條帶。如圖2(圖中，通道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)marker DL2000；通道1～20為4種不同酸漿屬植物樣品，具體編號(hào)見附圖說(shuō)明)所示，只有酸漿(通道13～17)在分子量550bp位置有條帶出現(xiàn)，而其他酸漿屬植物在分子量550bp位置沒有條帶出現(xiàn)。因此，此條帶為酸漿的特征性核苷酸序列。

3.序列測(cè)定

對(duì)上述篩選獲得的酸漿特異性DNA片段(圖2中箭頭所指片段)進(jìn)行切膠，采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工)回收純化所切DNA片段。然后將所純化的DNA片段連接到PUCm-T載體(上海生工)上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，然后送生物公司測(cè)序(上海生工)，得到如SEQ ID NO.1所示的核苷酸組成和排列。

實(shí)施例2：酸漿特異性標(biāo)記引物的制備，PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)

在測(cè)序獲得酸漿特異性DNA序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)獲得ST5SJF/ST5SJR引物序列(分別為SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。然后利用引物組合ST5SJF/ST5SJR對(duì)不同酸漿屬植物樣品(具體見附圖說(shuō)明)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系(總體積20μl)：2μl 10×Buffer，2μl MgCl₂(25mM)，0.8μl dNTPs(10mM)，1μl引物ST5SJF(10μM)，1μl引物ST5SJR(10μM)，1μl模板DNA(50ng/μl)，0.5μl Taq酶(2U/μl)，11.7μl ddH₂O。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；35個(gè)循環(huán)(94℃變性50s，61℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

利用1.5﹪瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳圖如圖3所示(圖中，通道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)marker DL2000；通道1～20為4種不同酸漿屬植物的樣品，具體見附圖說(shuō)明)，從圖3可以看出，只有酸漿(通道14～17)能擴(kuò)增出分子量為463bp大小的特異性片段，而其他酸漿屬植物樣品沒有擴(kuò)增出任何條帶，這表明本發(fā)明的特異性引物具有極高的專一性，因此可以用于酸漿樣品的快速鑒別。將酸漿的特異性片段送去測(cè)序，其序列如SEQ ID NO.1的27～489位堿基所示，其長(zhǎng)度為463bp.具體序列信息見圖1黑色標(biāo)記部分。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州師范大學(xué)

<120> 一種鑒別酸漿的核苷酸序列、特異性標(biāo)記引物和方法

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 550

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

caacaatggc taccacgaga cacaaaaggg tgtggggctt ctttagggga ttagtttttc 60

cgctctatat gataaccata catttggtag tagcaggaca taccctcgaa tagatctttg 120

gacaattggt agcctttgaa gaggcttatc atgaaactta tggtatgggt ggtcagggag 180

ttcaccagac gacgaggact ggtagtgatc catctcgggg tcggaaagat gaggatccca 240

cgagttgttt catatgtggt aggtttggac acaaggccat ggaatgttcc ctccatggga 300

cttttttatt gcagcgactt gagctgagta gtcaagattc aggacagatt catccaattt 360

tgccttcggg ttctcaaaac ctttctaatg atatccgatc agtaagtaga ggatgtgata 420

gacagactta tcaaccgctg agatttcaac atcacgatcg attgggtcag tacagaggcc 480

agagcagcca gggtagccaa cttgttaggg gtgcatcttc gggttcaaga ggtcgtggta 540

gccattgttg 550

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

agggtgtggg gcttcttta 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggctgctctg gcctctgta 19