專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種具有高水平三肽生產(chǎn)能力的瑞士乳桿菌、發(fā)酵奶制品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新型乳酸菌瑞士乳桿菌，該菌種用動(dòng)物奶培養(yǎng)基培養(yǎng)可高效率地產(chǎn)生一種獨(dú)特的三肽，并且具有高的胞外蛋白酶活性；含有該乳酸菌的發(fā)酵奶制品；該奶制品的制備方法。
背景技術(shù)：
：瑞士乳桿菌長(zhǎng)期用作奶制品的典型乳酸菌引酵物生產(chǎn)發(fā)酵奶。瑞士乳桿菌具有高的蛋白水解活性，尤其是其高活性的胞外蛋白酶在動(dòng)物奶發(fā)酵中起重要作用，即胞外蛋白酶消化動(dòng)物奶蛋白質(zhì)產(chǎn)生各種肽片段。所產(chǎn)生的肽片段經(jīng)肽酶的作用進(jìn)一步生成低分子量的肽。眾所周知由于蛋白酶的作用，在培養(yǎng)液中產(chǎn)生的一部分肽進(jìn)入乳酸菌細(xì)胞內(nèi)，作為一種氮源。亦有報(bào)道在培養(yǎng)液中產(chǎn)生的某些肽對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)有抑制活性，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶可導(dǎo)致高血壓(奶業(yè)科學(xué)雜志78777-783(1995))。已有報(bào)道各種有活性的肽可抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、抑制血壓增高，如從奶蛋白質(zhì)、黃豆蛋白質(zhì)和魚(yú)肉蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物分離得到的一些肽。如Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro(以下分別縮寫(xiě)為VPP和IPP，這類(lèi)肽在下文中統(tǒng)稱(chēng)為乳三肽)是存在于瑞士乳桿菌發(fā)酵奶中具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的肽。采用原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些乳三肽具有很強(qiáng)的降壓作用(奶業(yè)科學(xué)雜志781253-1257(1995))。然而，由于普通的瑞士乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量的乳酸，酸性較大，因此以該菌種發(fā)酵的動(dòng)物奶產(chǎn)生的含乳三肽發(fā)酵奶很難得到。稀釋此發(fā)酵奶將導(dǎo)致乳三肽含量極度減少。因此，需要生產(chǎn)有與發(fā)酵奶中乳酸含量相比更高的乳三肽含量的發(fā)酵奶。在不同食品和飲料中添加少量該發(fā)酵奶，可以方便地生產(chǎn)具有乳三肽功效的產(chǎn)品，并以消費(fèi)者樂(lè)于接受的形式提供給消費(fèi)者。但是目前已知的乳酸菌菌種沒(méi)有一種能產(chǎn)生高效的乳三肽。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一是提供一種新型乳酸菌菌種，該菌種能高效產(chǎn)生相對(duì)于產(chǎn)生的乳酸更大量的乳三肽。本發(fā)明的另一目的是提供了一種發(fā)酵乳制品該發(fā)酵乳制品的制備方法，在該發(fā)酵乳制品中含有具有降血壓活性以及預(yù)期有應(yīng)激活物作用的的乳三肽和大量產(chǎn)生該乳三肽的乳酸菌并容易供作飲食。根據(jù)本發(fā)明，所提供的乳酸菌瑞士乳桿菌具有下述細(xì)菌學(xué)特點(diǎn)，當(dāng)所述的該菌種用含9％(重量百分比)非脂肪乳固形物動(dòng)物奶培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生的三肽Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro含量每毫升培養(yǎng)基不低于以Val-Pro-Pro計(jì)60μg，該菌種表現(xiàn)出的胞外蛋白質(zhì)活性不低于400U／OD590。形態(tài)學(xué)特點(diǎn)1)細(xì)胞形狀桿狀2)運(yùn)動(dòng)性無(wú)3)孢子形成無(wú)4)革蘭氏染色陽(yáng)性生理學(xué)特點(diǎn)1)過(guò)氧化氫酶產(chǎn)生陰性2)吲哚產(chǎn)生陰性3)硝酸鹽還原陰性4)需氧生長(zhǎng)兼性壓氧5)不產(chǎn)氣乳清乳酸發(fā)酵葡萄糖生成DL-乳酸6)碳水化合物降解葡萄糖+乳糖+甘露糖+果糖+半乳糖+蔗糖-麥芽糖-木糖-鼠李糖-纖維二糖-海藻糖-蜜二糖-蜜三糖-水蘇四糖-甘露醇-山梨醇-七葉苷-水楊苷-根據(jù)本發(fā)明，提供了乳酸菌瑞士乳桿菌，其中該乳酸菌是瑞士乳桿菌CM4菌種(1997年8月15日保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)和人體技術(shù)研究所，菌種保藏號(hào)FERMBP-6060)。根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步提供的乳酸菌瑞士乳桿菌的染色DNA用限制性酶PstⅠ和EcoRⅠ消化后可產(chǎn)生15-17kb的DNA片段。根據(jù)本發(fā)明還提供一種發(fā)酵的奶制品，該制品包含前文提及的乳酸菌和選自Val-Pro-Pro、Ile-Pro-Pro及其混合物的三肽。根據(jù)本發(fā)明，還提供一種用該乳酸菌生產(chǎn)發(fā)酵奶制品的方法，該方法包括用含有選自具有Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro序列的肽、蛋白質(zhì)及其混合物的食品原料的培養(yǎng)基發(fā)酵該乳酸菌。附圖簡(jiǎn)述圖1是實(shí)施例2中不同的瑞士乳桿菌種中染色體DNA片段瓊脂糖凝膠電泳帶型的照片。發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明的乳酸菌屬瑞士乳桿菌，其特征在于用含9％(重量百分比)非脂肪乳固形物的動(dòng)物奶培養(yǎng)基培養(yǎng)的乳酸菌產(chǎn)生Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro三肽，其產(chǎn)量每mL培養(yǎng)基不低于60μg，優(yōu)選地以Val-Pro-Pro的量計(jì)不低于70μg，胞外蛋白酶活性不低于400U／OD590，優(yōu)選地不低于430U／OD590。所定義的乳三肽生產(chǎn)能力是區(qū)分本發(fā)明的乳酸菌瑞士乳桿菌與傳統(tǒng)乳酸菌的指標(biāo)。例如，用含9％(重量百分比)非脂肪乳固形物動(dòng)物奶培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明的乳酸菌，產(chǎn)生的乳三肽量以VPP計(jì)不低于每mL培養(yǎng)基60μg，該指標(biāo)用傳統(tǒng)的乳酸菌不能達(dá)到。通常，用于細(xì)菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基中非脂肪乳固形物含量越低，產(chǎn)生的乳三肽數(shù)量越少。非脂肪乳固形物含量越高，產(chǎn)生的乳三肽數(shù)量也越大。作為指標(biāo)的乳三肽的生產(chǎn)能力通過(guò)下列步驟測(cè)定接種乳酸菌于含9％(重量百分比)非脂肪乳固形物的動(dòng)物奶如牛奶、山羊奶、馬奶及其脫脂乳，37℃24小時(shí)培養(yǎng)制得發(fā)酵奶，15，000rpm離心1mL發(fā)酵奶10min，分離上清測(cè)定VPP和IPP含量并換算成VPP含量。由于IPP每單位重量的ACE抑制活性是VPP的1．7倍，所以可根據(jù)下式計(jì)算換算過(guò)的以VPP計(jì)的乳三肽含量換算后的乳三肽含量(每mLVPPμg)=IPP量(μg／mL)×1．7+VPP量(μg／mL)乳三肽最大生產(chǎn)能力并沒(méi)有具體限定，但當(dāng)取出培養(yǎng)基中包含Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro序列的蛋白質(zhì)時(shí)可以達(dá)到。以Yamamoto等(YamamotoN．etal．生物化學(xué)雜志(1993)114，740)改進(jìn)的TWining等(TWiningS，分析生物化學(xué)1433410(1984))人的方法測(cè)定胞外蛋白酶活性，表示為抑制1％熒光強(qiáng)度的酶量定義為1U／OD590。胞外蛋白酶活性的上限亦沒(méi)有具體限定，但通常為800U／OD590。本發(fā)明的乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生較乳酸含量為大的乳三肽。因此，采用本發(fā)明的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵奶含有大量的乳三肽，而用傳統(tǒng)的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵奶含有的乳三肽量與乳酸含量相近。如此發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸是DL-乳酸。用本發(fā)明的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳三肽量以VPP計(jì)優(yōu)選地不低于每mL30μg，DL-乳酸量每mL0．01g。乳三肽量的上限沒(méi)有具體限定，但對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)有可能產(chǎn)生以VPP計(jì)每mL發(fā)酵奶約50μg，含0．01g的DL-乳酸。DL-乳酸的量大致上與乳三肽的量成比例關(guān)系。故當(dāng)1mL發(fā)酵奶產(chǎn)生0．02gDL-乳酸時(shí)，乳三肽的產(chǎn)量以VPP計(jì)優(yōu)選地一般不會(huì)低于60μg。與此相反，采用傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵，以VPP計(jì)，在1mL發(fā)酵奶中乳三肽的產(chǎn)量最高也不超過(guò)30μg，DL-乳酸為0．01g。作為本發(fā)明乳酸菌的實(shí)例，瑞士乳桿菌CM4菌種保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)和人體技術(shù)研究所，編號(hào)FERMBP-6060(1997年8月15日)。瑞士乳桿菌CM4菌種的細(xì)菌學(xué)特點(diǎn)如下1．形態(tài)學(xué)特點(diǎn)1)細(xì)胞形狀桿狀2)運(yùn)動(dòng)性無(wú)3)孢子形成無(wú)4)革蘭氏染色陽(yáng)性2．生理學(xué)特點(diǎn)1)過(guò)氧化氫酶產(chǎn)生陰性2)吲哚產(chǎn)生陰性3)硝酸鹽還原陰性4)需氧生長(zhǎng)兼性壓氧5)不產(chǎn)氣乳清乳酸發(fā)酵葡萄糖生成DL-乳酸6)碳水化合物降解葡萄糖+乳糖+甘露糖+果糖+半乳糖+蔗糖+麥芽糖-木糖-鼠李糖-纖維二糖-海藻糖-蜜二糖-蜜三糖-水蘇四糖-甘露醇-山梨醇-七葉苷-水楊苷-上述提及的CM4菌種的細(xì)菌學(xué)特點(diǎn)與已知的瑞士乳桿菌NCDO-99菌種用Mitsuoka等人(臨床檢查18，1163(1974))的方法檢查時(shí)基本一致。但是CM4的下列特點(diǎn)可清楚地與NCDO-99菌種區(qū)分開(kāi)，這些特點(diǎn)Mitsuoka等人的方法中沒(méi)有描述。7)胞外蛋白酶活性不低于400U／OD590。8)乳三肽生產(chǎn)能力用含9％(重量百分比)脫脂乳37℃培養(yǎng)24小時(shí)產(chǎn)生二種三肽(VPP和IPP)，以VPP計(jì)含量每mL發(fā)酵液中60Pμg或更多。在8)中乳三肽生產(chǎn)能力用脫脂乳作為非脂肪乳固形物測(cè)量。本發(fā)明的乳酸菌菌種可根據(jù)下述篩選步驟和胞外蛋白酶活性測(cè)定得到。(1)初步篩選(ACE抑制活性高的發(fā)酵乳的篩選)待篩選的菌種以含9％(重量百分比)脫脂乳培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定乳酸菌數(shù)量、乳酸酸度、ACE抑制活性。選出產(chǎn)生1×108細(xì)胞／mL或更多的乳酸菌、乳酸酸度1．65％(重量百分比)或以上、ACE抑制活性40單位／mL或以上的菌種。ACE抑制活性參照Cushman和Cheung＇s方法測(cè)定(Cushman，DWandCheungHS，藥理學(xué)，20，1637(1971))。(2)第二次篩選(選擇高乳三肽產(chǎn)生能力的菌種)初篩過(guò)的菌種培養(yǎng)液15，000rpm離心10分鐘，所得上清經(jīng)HPLC進(jìn)行乳三肽定量。選出產(chǎn)生以VPP計(jì)每mL不低于50μg的菌株。(3)胞外蛋白酶活性的測(cè)定由第二次篩選選出的每種菌株用9％(重量百分比)脫脂乳培養(yǎng)，pH保持在6。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期采樣，以1％(重量百分比)檸檬酸鈉混和，5，000rpm離心10分鐘收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞以50mMβ-磷酸甘油洗滌，以50mMTris-HCl(pH7．8)緩沖液懸浮，調(diào)節(jié)濁度(OD590)至1。接著測(cè)定細(xì)胞表面的蛋白酶活性。必須保證結(jié)果與第二次篩選中菌株乳三肽生產(chǎn)能力的相關(guān)。根據(jù)上述方法選出的乳酸菌瑞士乳桿菌株可以加以鑒定并跟其他乳酸菌菌株通過(guò)前述乳三肽生產(chǎn)能力和胞外蛋白酶活性的測(cè)定相區(qū)分。優(yōu)選的本發(fā)明的乳酸菌除上述乳三肽生產(chǎn)能力及胞外蛋白酶活性外，其染色體DNA以限制性酶PstⅠ和EcoRⅠ消化產(chǎn)生15-17kb的DNA片段。因此，通過(guò)檢查菌株是否具有可產(chǎn)生上述DNA片段的染色體DNA可將本發(fā)明的乳酸菌與同屬其他菌株清楚地區(qū)分開(kāi)。根據(jù)Leenhouts等(LeenhoutsK，(1990)應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，562726)人的方法可證實(shí)是否存在15-17kbDNA片段，方法如下提取乳酸菌中的染色體DNA、以EcoRⅠ和PstⅠ消化染色體DNA、0．8％瓊脂糖凝膠電泳、分析產(chǎn)生的電泳帶型。在電泳中，通過(guò)以限制性酶HindⅢ消化λ噬菌體DNA作分子大小標(biāo)記同時(shí)電泳而證實(shí)DNA片段的存在。本發(fā)明中的發(fā)酵奶制品作為必須成分必須含有上述的乳酸菌和選自VPP、IPP及其混合物的三肽。即本發(fā)明的發(fā)酵奶制品是含有乳三肽和乳酸菌的發(fā)酵奶，經(jīng)含有包含VPP和／或IPP序列的肽和／或蛋白質(zhì)的食品原料的培養(yǎng)基用本發(fā)明的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生。故乳酸菌和三肽的量可根據(jù)待制備的發(fā)酵奶制品的種類(lèi)適當(dāng)選擇。本發(fā)酵奶制品可包含發(fā)酵產(chǎn)品本身，經(jīng)稀釋過(guò)的發(fā)酵產(chǎn)品和純化的發(fā)酵產(chǎn)品。本發(fā)明的發(fā)酵奶制品包含發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的DL-乳酸。本發(fā)明的發(fā)酵奶制品優(yōu)選地含有乳三肽以VPP計(jì)數(shù)量為30-50μg，而DL-乳酸來(lái)說(shuō)為0．01g。DL-乳酸的含量與乳三肽的含量大致相關(guān)。因此，如果發(fā)酵奶制品含有濃發(fā)酵奶及0．02gDL-乳酸，乳三肽的含量以VPP計(jì)優(yōu)選地為60-100μg。如果發(fā)酵奶制品含有稀發(fā)酵奶及0．005gDL-乳酸，乳三肽的含量以VPP計(jì)優(yōu)選地為15-25μg。盡管本發(fā)明的發(fā)酵奶制品可能含有L-乳酸，L-乳酸是一種調(diào)節(jié)酸度的食品添加劑，可與在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的DL-乳酸相區(qū)分。本發(fā)明發(fā)酵奶制品中的乳酸菌在發(fā)酵后可以滅活也可不滅菌而存活。本發(fā)明發(fā)酵奶制品可以是酸奶酪、乳清乳酸菌飲料、乳酪、含發(fā)酵酸奶的加工食品、含發(fā)酵酸奶的保健食品。因此，本發(fā)明的發(fā)酵奶制品可包括除必須成分的發(fā)酵奶之外通常用于添加以產(chǎn)生不同產(chǎn)品的各種不同材料。本發(fā)明的發(fā)酵奶制品可以以顆粒、膠囊、片劑等固體或以糊狀、膠狀、液體等流體外形存在。生產(chǎn)本發(fā)明發(fā)酵奶制品的方法，包括采用所述的乳酸菌在下列培養(yǎng)基中發(fā)酵該培養(yǎng)基含有選自以VPP和IPP作為構(gòu)成單位的肽、蛋白質(zhì)及其混合物的食品原料。培養(yǎng)基中的食品原料可以含有以VPP和IPP為構(gòu)成單位的肽和／或蛋白質(zhì)，例如，這類(lèi)食品材料可以是動(dòng)物奶、奶酪蛋白、谷物、谷物蛋白質(zhì)、小麥、小麥蛋白質(zhì)、黃豆、黃豆奶、脫脂黃豆、黃豆蛋白質(zhì)及其混合物。具體而言含有動(dòng)物奶的食品材料，如牛奶、羊奶、馬奶或其脫脂乳的食品材料是優(yōu)選的。動(dòng)物奶中非脂肪乳固形成分沒(méi)有特別要求，但一般為5％-20％(重量百分比)。在培養(yǎng)基中接種乳酸菌的數(shù)量沒(méi)有什么特別的限制。一般為培養(yǎng)基中1克某-特定的食品原料接種乳酸菌大約105-107個(gè)細(xì)胞。發(fā)酵溫度25-50℃，優(yōu)選地在30-45℃，發(fā)酵時(shí)間6-30小時(shí)，優(yōu)選地10-24小時(shí)，pH范圍最好在3．0-4．0，優(yōu)選地在3．0-3．5。發(fā)酵最好進(jìn)行到以VPP計(jì)每毫升發(fā)酵奶中乳三肽含量不低于60μg。具體地說(shuō)，當(dāng)用含非脂肪乳固形物9％(重量百分比)的牛奶做培養(yǎng)基時(shí)，25-40℃發(fā)酵12-48小時(shí)，得到的發(fā)酵奶含乳三肽的量以VPP計(jì)每毫升不低于70μg。培養(yǎng)基中非脂肪乳固形物的含量與產(chǎn)生的乳三肽含量大致相關(guān)。例如，如果食品材料含5％(重量百分比)非脂肪乳固形物，則以上述發(fā)酵條件發(fā)酵產(chǎn)生的乳三肽量以VPP計(jì)每mL約為33．3μg。以上述發(fā)酵條件獲得的發(fā)酵奶可以與其產(chǎn)物相混合，必要時(shí)在混合前稀釋或純化發(fā)酵奶。發(fā)酵奶可以在5℃冷凍貯藏，之后與其他成分混合生產(chǎn)如冷凍食品之類(lèi)的產(chǎn)品。發(fā)酵奶也可以加熱滅菌，必要時(shí)噴霧干燥制成粉末狀產(chǎn)品以便于常溫下分裝。由于本發(fā)明的發(fā)酵奶制品含有用乳酸菌發(fā)酵而得到的發(fā)酵奶，因此可以用來(lái)簡(jiǎn)便生產(chǎn)相對(duì)于乳酸含量有較高的乳三肽含量的產(chǎn)品，并以樂(lè)于接受的外形存在。發(fā)酵奶制品應(yīng)用于人體時(shí)預(yù)期具有乳三肽的降血壓功效和抗應(yīng)激功效。由于本發(fā)明的乳酸菌通過(guò)與特定的食品材料培養(yǎng)可產(chǎn)生大量的乳三肽，因此在各種發(fā)酵奶制品、功能食品、保健食品、用于某種特定健康用途的食品、老年人專(zhuān)用食品及其原料中用途很廣，這些食品都具有乳三肽的降血壓功效和抗應(yīng)激功效。實(shí)施例以下通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)介紹本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。在實(shí)施例采用的瑞士乳桿菌菌株中，CM4菌株保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)和人體技術(shù)研究所，編號(hào)FERMBP-6060。ATCC15009、NCDO-099、JCM1006、ATCC10797、JCM1062、JCM1103、JCM1120和JCM1004是公開(kāi)的有供應(yīng)的菌株。實(shí)施例中上述菌株之外的菌株來(lái)自申請(qǐng)人的菌種保藏。實(shí)施例1(能產(chǎn)生高ACE抑制活性的發(fā)酵奶的菌株的選擇)篩選從不同奶制品中分離得到的36株瑞士乳桿菌。每種菌株發(fā)酵后奶中的ACE抑制活性參照下述方法測(cè)定。每種瑞士乳桿菌以9％(重量百分比)非脂肪乳固形物培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。將培養(yǎng)過(guò)的培養(yǎng)基加到同一類(lèi)型的新鮮培養(yǎng)基中，新培養(yǎng)基含已培養(yǎng)的培養(yǎng)基3％(重量百分比)。在37℃進(jìn)一步發(fā)酵24小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定乳酸酸度(重量百分比)、乳清中肽含量(μg／mL)、細(xì)胞數(shù)目和ACE抑制活性(U／mL)。結(jié)果見(jiàn)表1。36種菌株中有7株發(fā)酵能力極弱。15株產(chǎn)生的發(fā)酵奶中乳酸酸度不低于1．6％(重量百分比)。在這15株中有8株發(fā)酵奶中乳清的ACE抑制活性不低于400U／mL。(發(fā)酵奶ACE抑制活性的測(cè)定)根據(jù)Cushman和Cheung方法(CushmanDW，CheungHS，藥理學(xué)，201637(1971))測(cè)定ACE抑制活性。即在15，000rpm離心每一種發(fā)酵液5分鐘獲得上清(乳清)。將乳清作適當(dāng)稀釋待測(cè)。取80μL稀釋的乳清于試管中，與含5mM馬尿酸組氨酸亮氨酸(Hip-His-Leu)(Sigma化學(xué)公司出品)作底物的0．1M硼酸緩沖液(含0．3MNaCl，pH7．3)相混合，再與20μL酶液(0．1U／mL，Sigma化學(xué)公司出品)混合。將混合液在37℃反應(yīng)30分鐘，加入250μL1N鹽酸終止反應(yīng)。再加入1．7mL乙酸乙酯，振蕩20秒，3000rpm離心10分鐘，分離上層1．4mL乙酸乙酯層。將該層在120℃加熱40分鐘以揮去溶劑，加1mL蒸餾水，振蕩約20秒。提取出的馬尿酸在228nm測(cè)其吸收值。酶活性以下列公式計(jì)算，50％ACE活性抑制定義為1個(gè)單位。酶量(單位)=((A-B)／(A-C))×100×1／50A228nm空白對(duì)照品吸收值B228nm待測(cè)樣品吸收值C228nm既無(wú)酶又無(wú)樣品吸收值(發(fā)酵奶中肽含量的定量分析)肽的定量分析根據(jù)OPA法(CharchFC，etal．奶業(yè)科學(xué)雜志661219(1883))進(jìn)行。采用胰酶消化的酪蛋白作為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。表1(具有高乳三肽產(chǎn)生能力的菌株的選擇)測(cè)定前述選出的8株能產(chǎn)生具有高ACE抑制活性的發(fā)酵奶的菌株發(fā)酵奶中的VPP和IPP。1mL發(fā)酵奶15,000rpm離心10分鐘。收集上清即乳清。以Sep-PakCartridge(Waters公司出品)吸附0．3mL乳清、蒸餾水洗滌、用5mL甲醇洗脫。在離心低壓下干燥洗脫液。將干燥產(chǎn)物溶解于0．3mL0．05％三氟乙酸水溶液，在下述條件下進(jìn)行HPLC(高效液相色譜)分析。結(jié)果見(jiàn)表2。采用的儀器日立L4000UV檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)215nm)L6200智能性泵L5030柱箱(柱溫35℃)洗脫條件流速0．5mL／min洗脫液含0．3MNaCl和0．05％三氟乙酸水溶液色譜柱AsahipakGS320(φ．9×600mm)因每單位重量IPP的ACE抑制活性是VPP的1．7倍，以VPP計(jì)乳三肽的含量可根據(jù)下式計(jì)算出IPP和VPP的量。結(jié)果見(jiàn)表2。轉(zhuǎn)換后乳三肽量(以VPP計(jì)每毫升μg)=IPP量(μg／ml)×1．7+VPP量(μg／ml)表2CM4發(fā)酵奶中乳三肽含量最大，以IPP計(jì)達(dá)78．5μg／mL乳清。另7種菌株乳三肽含量平均為34．2μg／mL乳清。(胞外蛋白酶的測(cè)定)對(duì)表116株具有良好發(fā)酵能力的菌株進(jìn)行胞外蛋白酶活性測(cè)定。參照Yamamoto等(YamamotoN，etal．生物化學(xué)雜志(1993)114，740)在TWining方法(TWining．S．分析生物化學(xué)143，3410(1984))基礎(chǔ)上改進(jìn)的方法進(jìn)行。即以9％(重量百分比)脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)各種菌株，pH保持在6．0。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中間采樣與檸檬酸鈉混和，終濃度為1％(重量百分比)，以澄清奶培養(yǎng)基。將混合物在5，000rpm離心10min收集細(xì)胞。用50mMβ-磷酸甘油洗滌，再用50mMTris-HCl緩沖液(pH7．8)混懸，調(diào)整濁度(OD590，即測(cè)定590nm吸收值)為1。取30μL混懸液與20μL0．4％熒光素酪蛋白(Sigma化學(xué)公司出品)混勻，42℃溫育l小時(shí)?；旌弦哼M(jìn)一步與120μL5％三氯乙酸混和，放量20分鐘，15，000rpm離心10分鐘。取60μL上清加入3mL500mMTris-HCl緩沖液(pH8．3)，通過(guò)檢查在525nm產(chǎn)生的熒光測(cè)定其熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)490nm。胞外蛋白酶活性單位以上述條件下1％熒光強(qiáng)度的酶量定義為1個(gè)單位加以計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表3。表3<tablesid="t02"num="003"><table>菌株U／OD590分離株17分離株18分離株19分離株20分離株21分離株22分離株23分離株24分離株25分離株26JCM1006JCM1062JCM1103ATCC15009ATCC10797NCDO-099CM4136．7102．8103．289．980．1243．3116．6116．6192．6108．4185．796．5176．3168．1106．5229．7452．6</table></tables>瑞士乳桿菌CM4具有最高的活性，達(dá)450U／OD590。其余16株平均活性為141U／OD590，約為CM4菌株的三分之一。實(shí)施例2從實(shí)施例l中36株瑞士乳桿菌中選出11株，參照Leenhouts等方法(LeenhoutsK(1990)應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)562726)提取染色體DNA，以幾種限制性酶消化，在0．8％瓊脂糖凝膠電泳上分析電泳帶型。結(jié)果，以EcoRⅠ和PsⅡ消化的CM4菌株染色體DNA片段中可觀(guān)察到特征性的DNA片段(見(jiàn)圖1箭頭1)。在其余菌株的染色體片段中沒(méi)有觀(guān)察到，但在大多數(shù)菌株中可觀(guān)察到比CM4特征性片段較短的片段(見(jiàn)圖1箭頭2)。以λ噬菌體DNAHindⅢ消化后產(chǎn)物作為分子大小標(biāo)記(23．1kb，9．4kb，6．6kb，4．4kb，2．3kb，2．0kb，泳動(dòng)性依次加快)比較電泳結(jié)果，特征性片段的分子量約為16kb。由此，以EcoRⅠ和PstⅠ酶切，可證實(shí)CM4菌株染色體DNA可產(chǎn)生分子量約為16kb的DNA片段，同時(shí)也證實(shí)CM4之外的其它菌株染色體DNA可產(chǎn)生分子量約13kb的常見(jiàn)的DNA片段。實(shí)施例3以實(shí)施例1選出的瑞士乳桿菌CM4生產(chǎn)發(fā)酵奶。CM4菌株在100g9％(重量百分比)脫脂乳中37℃培養(yǎng)12h，之后與3kg的新鮮培養(yǎng)基相混合在37℃繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。發(fā)酵之后，全部發(fā)酵奶(CM4細(xì)胞數(shù)目6．3×108／mL)作100kg9％(重量百分比)脫脂乳的促酵物在32℃培養(yǎng)20小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵奶中含有74．8μg／mL乳三肽，乳酸含量為1．9％(重量百分比)。取43kg已制得的發(fā)酵奶與4kg顆粒蔗糖、3kg水、0．15kg高甲氧基果膠勻漿制得50kg酸奶酪飲品。酸奶酪飲料有較好的適口感，pH3．6，活CM4細(xì)胞數(shù)為4．6×108／mL。實(shí)施例4從實(shí)施例3中得到的發(fā)酵奶26．5kg與45．0kg顆粒蔗糖、4．7kg濃麥芽糖漿和13．8kg水混合，邊攪拌邊加入10kg3％高甲氧基果膠溶液。所得混合物以實(shí)驗(yàn)室勻漿器(ATVGAULIN公司出品，型號(hào)15M-8BA)在150kg／cm2處理壓力下、流速2500mL／min勻漿。所得勻漿液與香草香精混和，加熱至85℃滅菌。滅菌過(guò)的發(fā)酵奶趁熱灌裝到200mL玻璃瓶中。測(cè)定滅過(guò)菌的發(fā)酵奶中乳三肽含量，可發(fā)現(xiàn)乳三肽含量與滅菌前發(fā)酵奶中乳三肽含量相當(dāng)。同時(shí)也測(cè)得乳酸含量為0．5％(重量百分比)。權(quán)利要求1．具有下列細(xì)菌學(xué)特點(diǎn)的乳酸菌瑞士乳桿菌種，該細(xì)菌在用含9％(重量百分比)脫脂乳固形物的動(dòng)物奶培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro三肽，以Val-Pro-Pro計(jì)在培養(yǎng)基中不低于60μg／ml，該細(xì)菌具有不低于400U／OD590的胞外蛋白酶活性形態(tài)學(xué)特點(diǎn)1)細(xì)胞形狀桿狀2)運(yùn)動(dòng)性無(wú)3)孢子形成無(wú)4)革蘭氏染色陽(yáng)性生理學(xué)特性1)過(guò)氧化氫酶產(chǎn)生陰性2)吲哚產(chǎn)生陰性3)硝酸鹽還原陰性4)需氧生長(zhǎng)兼性厭氧5)乳清乳酸發(fā)酵萄萄糖生成DL-乳酸而不產(chǎn)氣6)碳水化合物降解葡萄糖+乳糖+甘露糖+果糖+半乳糖+蔗糖-麥芽糖-木糖-鼠李糖-纖維二糖-海藻糖-蜜二糖-蜜三糖-水蘇四糖-甘露醇-山梨醇-七葉苷-水楊苷-2．權(quán)利要求1的乳酸菌瑞士乳桿菌，所述的乳酸菌是瑞士乳桿菌CM4菌株(保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)和人體技術(shù)研究所，保藏號(hào)FERMBP-6060)。3．權(quán)利要求1的乳酸菌瑞士乳桿菌，其中所述的乳酸菌染色體DNA以限制性酶PstⅠ和EcoRⅠ消化時(shí)，可得到15-17kb的DNA片段。4．一種發(fā)酵奶制品，包括權(quán)利要求1的乳酸菌和一種選自Val-Pro-Pro、Ile-Pro-Pro及其混合物的三肽。5．權(quán)利要求4的發(fā)酵奶制品，進(jìn)一步包括DL-乳酸，其中該奶制品中每0．01gDL-乳酸含有以Val-Pro-Pro計(jì)30-50μg的三肽。6．權(quán)利要求4的發(fā)酵奶制品，其中權(quán)利要求1的乳酸菌為活菌。7．權(quán)利要求4的發(fā)酵奶制品，其中所述的發(fā)酵奶制品選自酸奶酪、乳清乳酸菌飲料、干奶酪、含發(fā)酵酸奶的加工食品、含發(fā)酵酸奶的保健食品。8．權(quán)利要求4的發(fā)酵奶制品的制備方法，包括用下述培養(yǎng)基發(fā)酵權(quán)利要求1的乳酸菌，其中該培養(yǎng)基含有選自以Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro為構(gòu)成單位的肽，蛋白質(zhì)及其混合物的食品原料。9．權(quán)利要求8的方法，其中所述的食品原料選自動(dòng)物奶、奶酪蛋白、谷物、谷物蛋白質(zhì)、小麥、小麥蛋白質(zhì)、大豆、大豆乳、脫脂大豆、大豆蛋白質(zhì)及其混合物。10．權(quán)利要求8的方法，其中發(fā)酵方法為在25-50℃進(jìn)行6-60小時(shí)。11．權(quán)利要求8的方法，其中發(fā)酵在這種條件下進(jìn)行，結(jié)果在發(fā)酵奶中產(chǎn)生的三肽Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro量以Val-Pro-Pro計(jì)每mL不低于60μg。全文摘要本發(fā)明涉及能產(chǎn)生大量乳三肽的乳酸菌;以及發(fā)酵奶制品,該發(fā)酵奶制品含有多種具有降壓和應(yīng)激舒緩活性的成份并且該發(fā)酵奶容易吃和吞咽。更具體地說(shuō),本發(fā)明涉及瑞士乳桿菌,即瑞士乳桿菌CM4株(以保藏號(hào)FERMBP－6060保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)和人體技術(shù)研究所)其特征在于:該菌株有特定的細(xì)菌學(xué)特征,產(chǎn)三肽Val－Pro－Pro和/或Ile－Pro－Pro,當(dāng)以含不少于9%重量(固體含量)的非脂肪乳動(dòng)物乳為培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí),Val－Pro－Pro的產(chǎn)量不少于60μg/ml,并且細(xì)胞外蛋白酶活性不少于400U/OD文檔編號(hào)C12P21/02GK1279712SQ98811530公開(kāi)日2001年1月10日申請(qǐng)日期1998年2月5日優(yōu)先權(quán)日1997年9月26日發(fā)明者山本直之,河上夏江,石田優(yōu),屋田裕一申請(qǐng)人:卡爾皮斯株式會(huì)社被以下專(zhuān)利引用(2),