本申請要求2008年1月30日提交的美國臨時申請第61/024,658號的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其內(nèi)容為所有目的通過引用整體并入本文。本發(fā)明涉及具有對人met受體酪氨酸激酶(c-met)或其結(jié)構(gòu)域或片段的可檢測的結(jié)合親和性的人淚脂質(zhì)運載蛋白(htlc)的突變蛋白。此類突變蛋白包含相應于htlc的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108的序列位置中的至少一個的氨基酸置換。本發(fā)明還涉及編碼此類突變蛋白的相應核酸分子和它們的產(chǎn)生方法。本發(fā)明進一步涉及產(chǎn)生此類突變蛋白的方法。最后，本發(fā)明涉及包含此類脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的藥物組合物以及所述突變蛋白的各種用途。met受體酪氨酸激酶(rtk)最初被鑒定為人原癌基因tpr-met的產(chǎn)物(park等人,proc.natl.acad.sci,usa,vol.84,第6379-6383頁,1987)。c-met的配體被鑒定為是肝細胞生長因子(hgf)。hgf初始地被鑒定為培養(yǎng)的肝細胞的絲裂原。hgf與散射因子(sf)相同，散射因子是促進上皮細胞片層分散、以及三維培養(yǎng)物中生長的上皮的分支小管發(fā)生(tubulogenesis)的成纖維細胞衍生因子。因此，hgf/sf是引發(fā)包括有絲分裂、細胞運動性和形態(tài)發(fā)生的多種細胞應答的獨特生長因子。hgf/sf和c-met在成年人的許多組織中表達。c-met蛋白最主要地在上皮細胞中表達，但也在內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞、肝細胞、造血細胞、黑素細胞中表達。c-met很可能是最重要的膜受體之一。其活化在細胞生理學中起關(guān)鍵作用：有絲分裂發(fā)生、運動發(fā)生(motogenesis)、形態(tài)發(fā)生。hgf/sf看起來基本上是由間質(zhì)起源的細胞產(chǎn)生的。當hgf/sf活化c-met時，下游被活化的第一種蛋白是grb2(生長因子受體結(jié)合蛋白2)和gab1(生長因子受體結(jié)合蛋白2相關(guān)結(jié)合蛋白1)。grb2又可能活化許多激酶途徑，包括從ras到raf到mek和到mapk(絲裂原活化的蛋白激酶)的途徑。gab1活化pi3k(磷酸肌醇3激酶)，pi3k活化stat3(信號傳導子及轉(zhuǎn)錄激活子)。c-met活化還誘導β連環(huán)蛋白的活化，β連環(huán)蛋白是wnt途徑的關(guān)鍵組分，其易位至核中并參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。hgf/c-met途徑在癌癥發(fā)展中起重要作用。第一通過關(guān)鍵致癌途徑的活化(ras、pi3k/stat3、β連環(huán)蛋白)，第二通過內(nèi)皮細胞增殖(新血管發(fā)生(neoangiogenesis))，第三通過增加的蛋白酶產(chǎn)生以及由此的導致轉(zhuǎn)移的細胞解離。許多新的治療方法是針對hgf/c-met途徑，其中一些處于i或ii期臨床試驗。這些方法包括抗hgf單克隆抗體，諸如aveo的人源化形式av299或來自amgen的命名為amb102的完全人抗體(amg102)。另一種方法是使用充當誘餌的c-met的截短的變體。一個此類實例是來自compugen的稱為cgen241的截短形式。另外，阻斷c-met誘導的途徑的蛋白激酶抑制劑(小分子)被用于治療目的。此類小分子蛋白激酶抑制劑的實例包括來自arqule的arq197、來自exelixis的xl880、來自sgxpharmaceuticals的sgx523、來自supergen的mp470、或來自pfizer的pf2341066。盡管如此，仍期望有結(jié)合c-met并可例如用于治療目的的其他可用的化合物。因此，本發(fā)明的目標是提供具有對給定靶標的高結(jié)合親和性的人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。這一目標通過例如具有對人met受體酪氨酸激酶(c-met)或其結(jié)構(gòu)域或片段的可檢測的結(jié)合親和性的人淚脂質(zhì)運載蛋白(htlc)突變蛋白實現(xiàn)，其中此類突變蛋白包含相應于htlc的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108的序列位置中的至少一個的氨基酸置換。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白的方法，其中所述突變蛋白以可檢測的結(jié)合親和性結(jié)合c-met。這一方法包括：(a)使編碼人淚脂質(zhì)運載蛋白的核酸分子經(jīng)受在天然的成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的線性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中的任何氨基酸序列位置的至少一個密碼子處的誘變，其中編碼成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的線性多肽序列的序列位置61和153處的半胱氨酸殘基的密碼子中的至少一個已被突變?yōu)榫幋a任何其他氨基酸殘基，從而獲得編碼人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白的多種核酸，(b)在表達系統(tǒng)中表達(a)中獲得的一種或多種突變蛋白核酸分子，從而獲得一種或多種突變蛋白，和(c)通過選擇和/或分離富集步驟(b)中獲得的并具有對met的可檢測的結(jié)合親和性的所述一種或多種突變蛋白。在此環(huán)境下，值得注意的是，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，除去由半胱氨酸殘基61和153形成的野生型淚脂質(zhì)運載蛋白的結(jié)構(gòu)性二硫鍵(在相應的天然核酸文庫水平)(參閱breustedt,等人(2005),thecrystalstructureofhumantearlipocalinrevealsanextendedbranchedcavitywithcapacityformultipleligands(人淚脂質(zhì)運載蛋白的晶體結(jié)構(gòu)揭示具有對多種配體的容量的延伸的分支洞穴).j.biol.chem.280,484-493)提供不僅穩(wěn)定折疊而且另外還能夠以低的皮摩范圍的親和性結(jié)合給定的非天然配體的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。如本文所用的術(shù)語“誘變”意指被選擇以使人淚脂質(zhì)運載蛋白(swiss-prot數(shù)據(jù)庫條目p31025)的給定的序列位置處天然存在的氨基酸可被相應天然多肽序列的此特定位置處不存在的至少一種氨基酸置換的實驗條件。術(shù)語“誘變”還包括通過缺失或插入一個或多個氨基酸對序列區(qū)段長度進行的(另外)修飾。因此，例如，所選的序列位置處的一個氨基酸被一串三個隨機突變置換，導致與野生型蛋白的相應區(qū)段的長度相比插入兩個氨基酸殘基，在本發(fā)明范圍內(nèi)?？稍谀軌蚪?jīng)受本發(fā)明所述誘變的任何肽區(qū)段彼此獨立地引入此類缺失的插入。在本發(fā)明的一個示例性實施方案中，多種突變的插入可被引入到所選的脂質(zhì)運載蛋白支架的環(huán)ab(參閱國際專利申請wo2005/019256，其通過引用整體并入本文)。術(shù)語“隨機誘變”意指在誘變過程中，某個序列位置處不存在預定的單一氨基酸(突變)，而是至少兩種氨基酸可以某種概率摻入預定的序列位置。人淚脂質(zhì)運載蛋白的編碼序列(redl,b.等人(1992)j.biol.chem.267,20282-20287)用作本發(fā)明選擇的肽區(qū)段誘變的起始點。對于所述氨基酸位置的誘變，本領(lǐng)域技術(shù)人員具有用于位點定向誘變的多種公認的標準方法可供支配(sambrook,j.等人(1989)，同上)。通常使用的技術(shù)是使用合成的寡核苷酸的混合物通過pcr(聚合酶鏈式反應)引入突變，所述混合物具有在期望的序列位置處的簡并堿基組成。例如，密碼子nnk或nns(其中n＝腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶；k＝鳥嘌呤或胸腺嘧啶；s＝腺嘌呤或胞嘧啶)的使用允許在誘變過程中摻入所有20種氨基酸以及琥珀終止密碼子，而密碼子vvs將可能摻入的氨基酸的數(shù)目限制為12，原因是它排除了氨基酸cys、ile、leu、met、phe、trp、tyr、val被摻入到多肽序列的選擇位置；在選擇的序列位置的密碼子nms(其中m＝腺嘌呤或胞嘧啶)的使用，例如，將可能的氨基酸數(shù)目限制為11，原因是它排除了氨基酸arg、cys、gly、ile、leu、met、phe、trp、val被摻入到選擇的序列位置。在這一方面，值得注意的是，其他氨基酸(不是常見的20種天然存在的氨基酸)諸如硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸的密碼子也可被摻入到突變蛋白的核酸。如wang,l.,等人(2001)science292,498-500，或wang,l.和schultz,p.g.(2002)chem.comm.1,1-11所述，使用通常被識別為終止密碼子的“人工”密碼子諸如uag來插入其他不常見的氨基酸例如o-甲基-l-酪氨酸或p-氨基苯丙氨酸也是可能的。使用具有降低的堿基對特異性的核苷酸建筑塊例如肌苷、8-氧-2'脫氧鳥苷或6(2-脫氧-β-d-呋喃核糖基)-3,4-二氫-8h-嘧啶-1,2-噁嗪-7-酮(zaccolo等人(1996)j.mol.biol.255,589-603)是向所選的序列區(qū)段引入突變的另一個選擇。另一種可能是所謂的三聯(lián)體誘變。此方法使用不同的核苷酸三聯(lián)體的混合物，每種核苷酸三聯(lián)體編碼要摻入編碼序列的一種氨基酸(b,gel,plückthuna,schneiderkc,wellnhoferg,moroneyse.1994trinucleotidephosphoramidites:idealreagentsforthesynthesisofmixedoligonucleotidesforrandommutagenesis(三核苷酸亞磷酰胺：合成用于隨機誘變的混合寡核苷酸的理想試劑).nucleicacidsres22,5600-5607)。在相應多肽的選擇區(qū)域引入突變的一種可能策略是基于使用四種寡核苷酸，每種寡核苷酸部分衍生自要突變的相應序列區(qū)段之一。當合成這些寡核苷酸時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用用于合成相應于要突變的氨基酸位置的那些核苷酸三聯(lián)體的核酸建筑塊的混合物，以便隨機產(chǎn)生編碼所有天然氨基酸的密碼子，這最終造成脂質(zhì)運載蛋白肽文庫的產(chǎn)生。例如，序列中遠離突變的位置的第一寡核苷酸相應于脂質(zhì)運載蛋白多肽的最n-末端位置處要突變的肽區(qū)段的編碼鏈。因此，第二寡核苷酸相應于多肽序列中接下來的第二序列區(qū)段的非編碼鏈。第三寡核苷酸依次相應于相應的第三序列區(qū)段的編碼鏈。最后，第四寡核苷酸相應于第四序列區(qū)段的非編碼鏈?？墒褂孟鄳牡谝缓偷诙押塑账嵋约叭绻枰瑔为毜厥褂孟鄳牡谌偷谒墓押塑账?，進行聚合酶鏈式反應。這兩種反應的擴增產(chǎn)物可通過多種已知的方法合并成包含從第一序列區(qū)段至第四序列區(qū)段的序列的單一核酸，其中已在選擇的位置引入突變。為此目的，例如，可使兩種產(chǎn)物都經(jīng)受使用貢獻第二序列區(qū)段和第三序列區(qū)段之間的序列的側(cè)翼寡核苷酸以及一種或多種中介(mediator)核酸分子的新的聚合酶鏈式反應。在選擇用于誘變的寡核苷酸序列內(nèi)的數(shù)目和排列時，本領(lǐng)域技術(shù)人員具有許多可選方案可供支配。上文定義的核酸分子可通過連接(ligation)編碼脂質(zhì)運載蛋白多肽和/或載體的核酸的缺乏5'和3'的序列連接，并可在已知的宿主生物體中克隆。有多種可得的用于連接和克隆的公認程序(sambrook,j.等人(1989)，同上)。例如，可將克隆載體序列中還存在的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列加工到合成的寡核苷酸的序列中。因此，在擴增相應的pcr產(chǎn)物和酶促切割之后，可使用相應的識別序列容易地克隆所得的片段。編碼選擇用于誘變的蛋白的基因內(nèi)的更長的序列區(qū)段也可通過已知方法經(jīng)受隨機誘變，例如通過使用具有增加的錯誤率的條件下的聚合酶鏈式反應、通過化學誘變或通過使用細菌突變基因菌株。此類方法還可用于脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的靶標親和性或特異性的進一步優(yōu)化?？赡馨l(fā)生在實驗誘變區(qū)段以外的突變通常是耐受的，或甚至可證明是有利的，例如如果它們有助于脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的改善的折疊效率或折疊穩(wěn)定性。如本文所用的術(shù)語“人淚脂質(zhì)運載蛋白”指成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白，其以登錄號p31025保藏于swiss-prot數(shù)據(jù)庫，并且其氨基酸序列在本文以seqidno:36表示。在本發(fā)明的一個實施方案中，用于產(chǎn)生人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白的方法包括突變成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的線性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108的任何位置的密碼子中的至少2、3、4、5、6、8、10、12、14、15、16或17個。在另一實施方案中，成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的線性多肽序列的氨基酸序列位置26、27、28、29、30、31、32、33、34、56、57、58、80、83、104、105、106和108的所有18個密碼子是突變的。因此，本發(fā)明的met結(jié)合突變蛋白可包含成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的線性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108的2、3、4、5、6、8、10、12、14、15、16、17或18個位置中任何位置處的突變。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，使序列位置經(jīng)受誘變并不一定意味著所選的可能氨基酸置換將確實發(fā)生于本發(fā)明的突變蛋白中。由于回復突變或結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，野生型淚脂質(zhì)運載蛋白序列的氨基酸殘基也可保留在本發(fā)明的突變蛋白中。在另一方面，本發(fā)明包括產(chǎn)生人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白的方法，其中所述突變蛋白以可檢測的結(jié)合親和性結(jié)合作為人淚脂質(zhì)運載蛋白的給定的非天然配體的c-met，包括：(a)使編碼人淚脂質(zhì)運載蛋白的核酸分子經(jīng)受成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的線性多肽序列的氨基酸序列位置34、80和104中任何位置的至少一個密碼子的誘變，從而獲得編碼人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白的多種核酸，(b)在表達系統(tǒng)中表達(a)中獲得的一種或多種突變蛋白核酸分子，從而獲得一種或多種突變蛋白，和(c)通過選擇和/或分離富集步驟(b)中獲得的并具有對作為人淚脂質(zhì)運載蛋白的給定的非天然配體的c-met的可檢測的結(jié)合親和性的所述一種或多種突變蛋白。在前述方法的一個實施方案中，成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的線性多肽序列的氨基酸序列位置26-33、56-58、83、105-106和108的任何位置的密碼子中的另外至少2、3、4、5、6、8、10、12、14或15個是突變的。在本發(fā)明的進一步實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括編碼成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的線性多肽序列中的位置61和153處的半胱氨酸的兩個密碼子的突變。兩個位置均可，例如，被突變?yōu)榫幋a絲氨酸殘基。在如本文所述的本發(fā)明的另一實施方案中，編碼成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的線性多肽序列的氨基酸序列位置111和/或114的密碼子被突變?yōu)榫幋a例如位置111處的脯氨酸和位置114處的色氨酸。本發(fā)明的方法的另一實施方案包括誘變編碼成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的線性多肽序列的位置101處的半胱氨酸的密碼子以使此密碼子編碼任何其他氨基酸。在一個實施方案中，編碼位置101的突變的密碼子編碼絲氨酸。因此，在一些實施方案中，位置61、101和153處的任兩個或所有三個半胱氨酸密碼子被另一氨基酸的密碼子置換。根據(jù)本發(fā)明的方法，以編碼人淚脂質(zhì)運載蛋白的核酸為起點獲得突變蛋白。此類核酸經(jīng)受誘變并通過重組dna技術(shù)被引入到合適的細菌或真核宿主生物體。獲得淚脂質(zhì)運載蛋白的核酸文庫可使用本領(lǐng)域已知的任何合適的技術(shù)進行，以產(chǎn)生具有抗體樣性質(zhì)的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，即具有對給定的靶標的親和性的突變蛋白。例如，此類組合方法的實例詳細地描述于國際專利申請wo99/16873、wo00/75308、wo03/029471、wo03/029462、wo03/029463、wo2005/019254、wo2005/019255、wo2005/019256、wo2006/56464或國際專利申請pct/ep2007/057971，其公開內(nèi)容通過引用完全并入本文。在適當?shù)乃拗髦斜磉_經(jīng)受誘變的核酸序列之后，可從獲得的文庫中選擇攜帶結(jié)合給定的靶標的多種相應脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的遺傳信息的克隆。例如，可采用公知的技術(shù)選擇這些克隆，諸如噬菌體展示(綜述參見：kay,b.k.等人(1996)同上；lowman,h.b.(1997)同上，或rodi,d.j.和makowski,l.(1999)同上)、菌落篩選(綜述參見pini,a.等人(2002)comb.chem.highthroughputscreen.5,503-510)、核糖體展示(綜述參見amstutz,p.等人(2001)curr.opin.biotechnol.12,400-405)或如wilson,d.s.等人(2001)proc.natl.acad.sci.usa98,3750-3755中報道的mrna展示或特別描述于wo99/16873、wo00/75308、wo03/029471、wo03/029462、wo03/029463、wo2005/019254、wo2005/019255、wo2005/019256、wo2006/56464或國際專利申請pct/ep2007/057971中的方法，其公開內(nèi)容通過引用完全并入本文。根據(jù)本公開內(nèi)容，獲得結(jié)合c-met的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的方法的步驟(c)在上述方法的另一實施方案中還包括：(i)提供c-met或其結(jié)構(gòu)域或片段作為給定的配體，(ii)使所述多種突變蛋白與所述配體接觸，以允許在所述配體和具有對所述配體的結(jié)合親和性的突變蛋白之間形成復合物，和(iii)除去沒有或基本上沒有結(jié)合親和性的突變蛋白。對于結(jié)合c-met的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的產(chǎn)生，可使人met受體酪氨酸激酶(c-met)的胞外結(jié)構(gòu)域的任何部分(例如，片段或單個結(jié)構(gòu)域)或完整的胞外結(jié)構(gòu)域(包含n-末端氨基酸殘基1甲硫氨酸-蘇氨酸932的成熟的完整受體(swissprot:p08581)與編碼這些突變蛋白的(天然)核酸文庫的表達獲得的(多種)突變蛋白接觸?？梢允褂蒙虡I(yè)可獲得的胞外結(jié)構(gòu)域，例如提供為經(jīng)由例如多肽連接體融合于人igg的fc區(qū)的殘基1-932(r&dsystems,usa,目錄號358-mt)?？捎糜讷@得本文描述的突變蛋白的c-met片段的進一步實例包括但不限于，如stamos等人,theembojournalvol.23,no.12,2004,第2325-2335頁所述的含有七個sema結(jié)構(gòu)域的由met的殘基25至567組成的片段，或包含殘基25至567的更大片段。如果猜測本發(fā)明的突變蛋白與hgf競爭結(jié)合sema結(jié)構(gòu)域，可使用結(jié)合sema結(jié)構(gòu)域的片段。此類突變蛋白可(但不一定必須具有，參見實施例)hgf的拮抗劑。如果要避免與sema結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，也可以使用片段，諸如包含殘基568至932的片段。也可以使用片段或其他結(jié)構(gòu)域諸如c-met的psi結(jié)構(gòu)域或igg-樣結(jié)構(gòu)域進行篩選。對于篩選目的，還可以使用，例如，黑猩猩同系物(黑猩猩(pantroglodytes)，與人c-met具有99％同一性)、獼猴屬同系物(獼猴(macacamulatta)，98％同一性)、犬直向同源物(家犬(canisfamiliaris)，88％同一性)、小鼠直向同源物(swissprot:a1a597，87％同一性)或大鼠直向同源物(大鼠(rattusnorvegicus)，86％同一性)代替人c-met(的胞外結(jié)構(gòu)域)。例如，如果期望突變蛋白在人和小鼠或大鼠直向同源物(或，例如胞外結(jié)構(gòu)域)之間具有交叉反應性，可采取此類方法。如從上文明顯的，可在本發(fā)明中產(chǎn)生可具有對hgf的拮抗劑作用的淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白?？蛇x地，突變蛋白可具有相應的非拮抗結(jié)合模式(參閱此方面的實施例)。在本發(fā)明方法的一個實施方案中，步驟(c)中的選擇在競爭條件下進行。如本文所用的競爭條件意指突變蛋白的選擇可包括至少一個以下步驟：其中突變蛋白和人淚脂質(zhì)運載蛋白的給定的非天然配體(靶標)的接觸是在存在與突變蛋白競爭結(jié)合靶標的另外配體諸如hgf下進行的。這一另外配體可以是c-met的生理配體諸如hgf，或c-met的任何其他非生理配體諸如抗-c-met抗體或小分子蛋白酪氨酸激酶抑制劑，所述抑制劑至少結(jié)合與本發(fā)明的突變蛋白識別的表位重疊或部分重疊的表位，并因此干擾所述突變蛋白的靶標結(jié)合?？蛇x地，這一另外配體可通過變構(gòu)效應通過復合不同于突變蛋白的c-met結(jié)合位點的表位來競爭突變蛋白的結(jié)合。使用溫和的m13噬菌體的噬菌體展示技術(shù)的實施方案(綜述參見kay,b.k.等人(1996)，同上；lowman,h.b.(1997)同上或rodi,d.j.和makowski,l.(1999)，同上)作為可用于本發(fā)明的選擇方法的實例給出。可用于本發(fā)明突變蛋白的選擇的噬菌體展示技術(shù)的另一實施方案(參見“實驗部分”)是由broders等人(broders等人(2003)“hyperphage.improvingantibodypresentationinphagedisplay(hyperphage，改善噬菌體展示中的抗體呈遞).”methodsmol.biol.205:295-302)描述的hyperphage噬菌體技術(shù)。也可使用其他溫和噬菌體諸如f1或裂解性噬菌體諸如t7。對于示例性選擇方法，產(chǎn)生了m13噬菌粒，其允許以與n-末端的信號序列優(yōu)選地ompa-信號序列的融合蛋白，以及與能夠在c-末端摻入噬菌體殼體的噬菌體m13殼體蛋白piii或其片段的融合蛋白形式表達突變的脂質(zhì)運載蛋白核酸序列。優(yōu)選地使用包含野生型序列的氨基酸217至406的噬菌體殼體蛋白的c-末端片段δpiii來產(chǎn)生融合蛋白。在一個實施方案中，特別優(yōu)選的是piii的c-末端片段，其中位置201處的半胱氨酸殘基缺失或被另一氨基酸置換。因此，本發(fā)明方法的進一步實施方案包括將編碼3'端誘變獲得的多種人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白的核酸與編碼m13-家族的絲狀噬菌體外殼蛋白piii或編碼此外殼蛋白的片段的基因可操作地融合，以選擇結(jié)合c-met的至少一種突變蛋白。所述融合蛋白可包含另外的組分，諸如親和性標簽，其允許固定、檢測和/或純化融合蛋白或其部分。此外，終止密碼子可位于編碼脂質(zhì)運載蛋白或其突變蛋白的序列區(qū)和噬菌體殼體基因或其片段之間，其中在合適的抑制菌株中，所述終止密碼子，優(yōu)選地琥珀終止密碼子，在翻譯過程中至少部分地被翻譯成氨基酸。例如，國際專利申請pct/ep2007/057971中描述的噬粒載體ptlpc27，現(xiàn)在也稱為ptlc27，可用于制備編碼人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的噬菌粒文庫。編碼淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的本發(fā)明核酸分子可使用兩個bstxi限制位點插入到載體中。連接后，用得到的核酸混合物轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株諸如大腸桿菌(e.coli)xl1-blue以產(chǎn)生大量獨立的克隆。如果需要，可產(chǎn)生相應的載體來制備hyperphagemid文庫?？蛇x地，任何其他合適的噬菌粒載體諸如，例如本申請的實施例中使用的載體ptlpc59(參見實施例1和圖1)也可用于制備噬菌粒文庫。除了用于噬菌體展示的文庫基因構(gòu)建體被置于lacp/o而不是tetp/o控制之下并遺傳融合于vcsm13噬菌體的全長基因iii之外，載體ptlpc59與載體ptlc27相同。得到的文庫可隨后在液體培養(yǎng)物中用適當?shù)膍13-輔助噬菌體或hyperphage重復感染(superinfected)以產(chǎn)生有功能的噬菌粒。重組噬菌粒在其表面將脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白展示為與外殼蛋白piii或其片段的融合，而融合蛋白的n-末端信號序列被正常地切割。在另一方面，它還帶有由輔助噬菌體提供的一個或多個拷貝的天然殼體蛋白piii，并因此能夠感染受者，通常是攜帶f-或f'-質(zhì)粒的細菌菌株。在hyperphage展示的情況下，hyperphagemid在它們的表面上將脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白展示為與感染性外殼蛋白piii而不是天然殼體蛋白的融合。在用輔助噬菌體或hyperphage感染過程中或之后，可誘導脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白和殼體蛋白piii之間的融合蛋白的基因表達，例如通過添加去水四環(huán)素。選擇誘導條件以使獲得的噬菌粒的顯著分數(shù)在它們的表面上展示至少一種脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。在hyperphage展示的情況下，誘導條件得到攜帶由脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白和殼體蛋白piii組成的三到五種融合蛋白的hyperphagemid群體。已知用于分離噬菌粒的多種方法，諸如用聚乙二醇沉淀。分離通常在6-8小時的孵育時間段之后發(fā)生。分離的噬粒然后可通過與所需的靶標(即c-met的胞外結(jié)構(gòu)域或其部分或片段)孵育而經(jīng)受選擇，其中所述靶標以至少允許暫時固定那些在其外殼中攜帶作為融合蛋白的具有所需的結(jié)合活性的突變蛋白的噬菌粒的形式呈遞。在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種實施方案中，靶標可以，例如，與載體蛋白諸如血清白蛋白軛合并經(jīng)由此載體蛋白結(jié)合于蛋白結(jié)合表面，例如聚苯乙烯。適于elisa技術(shù)或所謂的“免疫棒”(immuno-sticks)的微滴定板可優(yōu)選地用于靶標的此類固定?？蛇x地，可以使用靶標與其他結(jié)合基團諸如生物素的軛合物。然后可將靶標固定在選擇性結(jié)合此基團的表面上，例如用鏈霉親和素、中性鏈親和素或親和素包被的微滴定板或順磁顆粒。如果靶標融合于免疫球蛋白的fc部分，固定還可以用例如以蛋白a或蛋白g包被的微滴定板或順磁顆粒的表面實現(xiàn)。表面上存在的非特異性噬菌粒結(jié)合位點可用封閉溶液飽和，因為這是elisa方法已知的。然后通常使噬菌粒與表面上固定的靶標在生理緩沖液存在下接觸。通過多次洗滌除去未結(jié)合的噬菌粒。然后洗脫表面上剩余的噬菌粒顆粒。對于洗脫，若干種方法是可能的。例如，噬菌?？赏ㄟ^加入蛋白酶或在酸、堿、去污劑或離液鹽的存在下或在中等變性條件下洗脫。優(yōu)選的方法是使用ph2.2的緩沖液洗脫，其中洗脫物可隨后被中和?？蛇x地，可加入游離靶標(即c-met的胞外結(jié)構(gòu)域或其部分或片段)的溶液以與固定的靶標競爭結(jié)合噬菌粒，或靶標特異性噬菌?？赏ㄟ^與免疫球蛋白或特異性結(jié)合感興趣的靶標的天然配體蛋白競爭而洗脫。之后，用洗脫的噬菌粒感染大腸桿菌細胞?？蛇x地，可從洗脫的噬菌粒中提取核酸并將其用于序列分析、擴增或另一種方式的細胞轉(zhuǎn)化。這樣，從獲得的大腸桿菌克隆開始，根據(jù)上文所述方法，通過用m13輔助噬菌體或hyperphage重復感染再次產(chǎn)生了新鮮的噬菌?；騢yperphagemid，并且這樣擴增的噬菌粒再次經(jīng)受在固定的靶標上的選擇。通常需要多個選擇循環(huán)以獲得充分富集的形式的具有本發(fā)明突變蛋白的噬菌粒。選擇循環(huán)的次數(shù)優(yōu)選地選擇為使在隨后的功能分析中，至少0.1％的研究克隆產(chǎn)生具有對給定的靶標的可檢測的親和性的突變蛋白。為此，取決于所采用的文庫的大小，即復雜度，通常需要2至8個循環(huán)。對于選擇的突變蛋白的功能分析，然后可用從選擇循環(huán)中獲得的噬菌粒感染大腸桿菌菌株，并分離相應的雙鏈噬粒dna。從此噬粒dna或另外從提取自噬菌粒的單鏈dna開始，可通過本領(lǐng)域已知的方法確定選擇的本發(fā)明突變蛋白的核酸序列，并可由此推斷氨基酸序列。可將突變的區(qū)域或完整的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的序列亞克隆到另一表達載體上并在合適的宿主生物體中表達。例如，國際專利申請pct/ep2007/057971中描述的載體ptlc26可用于在大腸桿菌菌株諸如大腸桿菌tg1中進行表達。由此產(chǎn)生的淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白可通過多種生物化學方法純化。例如用ptlc26產(chǎn)生的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白在其c末端攜帶親和性肽ii(schmidt等人，同上)，并因此可優(yōu)選地通過鏈霉親和素親和層析純化。選擇還可借助其他方法進行。許多相應的實施方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或描述于參考文獻中。而且，可應用方法的組合。例如，通過“噬菌體展示”選擇或至少富集的克隆可另外經(jīng)受“克隆篩選”。這一程序具有可直接分離產(chǎn)生具有對c-met或例如c-met的胞外結(jié)構(gòu)域的可檢測的結(jié)合親和性的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的單個克隆的優(yōu)勢。在“噬菌體展示”技術(shù)或“菌落篩選”方法中，除了使用大腸桿菌作為宿主生物體之外，其他細菌菌株、酵母或昆蟲細胞或哺乳動物細胞也可用于此目的。繼如上所述的從隨機(天然)文庫中選擇淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白之外，也可應用包括限制誘變的進化方法，以在反復的篩選循環(huán)之后優(yōu)化已經(jīng)擁有對靶標的一定結(jié)合活性的突變蛋白對靶標的親和性或特異性。選擇具有對c-met或其結(jié)構(gòu)域或片段的親和性的突變蛋白之后，還可以使此類突變蛋白經(jīng)受另一誘變，以接著選擇具有甚至更高的親和性的變體或具有改善的性質(zhì)的變體，所述改善的性質(zhì)諸如更高的熱穩(wěn)定性、改善的血清穩(wěn)定性、熱動力學穩(wěn)定性、改善的溶解性、改善的單體行為、改善的對熱變性、化學變性、蛋白酶解或去污劑等的抗性。此進一步誘變，其在旨在更高親和性的情況下可被視為體外“親和性成熟”，可通過基于理性設(shè)計或隨機突變的位點特異性突變實現(xiàn)。獲得更高的親和性或改善的性質(zhì)的另一可能的方法是使用易錯pcr，其在脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的選擇范圍的序列位置上造成點突變。易錯pcr可根據(jù)任何已知的方案進行，諸如由zaccolo等人(1996)j.mol.biol.255,589-603描述的方案。適于此類目的的其他隨機誘變方法，包括murakami,h等人(2002)nat.biotechnol.20,76-81描述的隨機插入/缺失(rid)誘變或bittker,j.a等人(2002)nat.biotechnol.20,1024-1029描述的非同源隨機重組(nrr)。如果需要，親和性成熟也可根據(jù)wo00/75308或schlehuber,s.等人,(2000)j.mol.biol.297,1105-1120中描述的程序進行，其中獲得了具有對地高辛的高親和性的后膽色素結(jié)合蛋白的突變蛋白。改善親和性的進一步方法是進行位置飽和誘變。在此方法中，可產(chǎn)生“小”核酸文庫，其中僅在本文定義的四個環(huán)狀區(qū)段(參閱實施例21)中的任何區(qū)段內(nèi)的單一位置處引入氨基酸交換/突變。然后使這些文庫直接經(jīng)受選擇步驟(親和性篩選)，而無進一步的淘選輪次。此方法允許鑒定有助于所需靶標的改善的結(jié)合的殘基，并允許鑒定對于結(jié)合重要的“熱點”。使用此類方法，鑒定例如前兩個區(qū)段(序列位置24-36或56-58)內(nèi)的關(guān)鍵殘基是可能的。在進一步的方面，本發(fā)明涉及具有對c-met或其結(jié)構(gòu)域或部分的可檢測的結(jié)合親和性的人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白，其是通過上文詳述的本發(fā)明方法可獲得的或獲得的。在一個實施方案中，根據(jù)上文方法獲得的人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白包括序列位置61和153中的每個位置處存在的半胱氨酸殘基中的至少一個或兩個被另一氨基酸置換和成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的線性多肽序列的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中的任何一個位置處的至少一個氨基酸殘基的突變。位置24-36包含在淚脂質(zhì)運載蛋白的β-桶結(jié)構(gòu)的開口端處結(jié)合位點的ab環(huán)中，位置53-66包含在cd環(huán)中，位置69-77包含在ef環(huán)中，而位置103-110包含在gh環(huán)中。本文中使用的這四個環(huán)的定義是根據(jù)flower(flower,d.r.(1996)，同上和flower,d.r.等人(2000)，同上)。通常，此類突變蛋白包含在成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的線性多肽序列的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108處的至少2、3、4、5、6、8、10、12、14、15、16、17或18個突變的氨基酸殘基。在一個具體實施方案中，突變蛋白包含氨基酸置換cys61→ala、phe、lys、arg、thr、asn、tyr、met、ser、pro或trp和cys153→ser或ala。已證明此類置換可用于防止連接cys61和cys153的天然存在的二硫橋的形成，并因此促進突變蛋白的操縱。在又一實施方案中，突變蛋白包含選自arg111→pro和lys114→trp的至少一個另外的氨基酸置換。本發(fā)明的突變蛋白還可包含天然成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白序列的位置101處的半胱氨酸被另一氨基酸置換。這一置換可以例如是突變cys101→ser或cys101→thr。本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白可包含突變的氨基酸序列位置之外的野生型(天然)氨基酸序列。另一方面，本文公開的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白還可含有經(jīng)受誘變的序列位置之外的氨基酸突變，只要那些突變不干擾突變蛋白的結(jié)合活性和折疊。此類突變可使用公認的標準方法在dna水平上非常容易地完成(sambrook,j.等人(1989)molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆實驗室手冊),第二版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny)。氨基酸序列的可能改變是插入或缺失以及氨基酸置換。此類置換可以是保守的，即氨基酸殘基被化學上相似的氨基酸殘基置換。保守置換的實例是下列組的成員之間的置換：1)丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和賴氨酸；5)異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，也可在氨基酸序列中引入非保守變化。此外，除了取代單一氨基酸殘基，也可插入或缺失淚脂質(zhì)運載蛋白的一級結(jié)構(gòu)的一個或多個連續(xù)氨基酸，只要這些缺失或插入造成穩(wěn)定折疊的/有功能的突變蛋白(參見例如，實驗部分，其中產(chǎn)生了具有截短的n-和c-末端的突變蛋白)。氨基酸序列的此類修飾包括單一氨基酸位置的定向誘變，以通過摻入某些限制酶的切割位點來簡化突變的脂質(zhì)運載蛋白基因或其部分的亞克隆。此外，還可摻入這些突變以進一步改善脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白對給定的靶標的親和性。此外，可引入突變以調(diào)節(jié)突變蛋白的某些特性，諸如改善折疊穩(wěn)定性、血清穩(wěn)定性、蛋白抗性或水溶解性，或如果需要，降低聚集傾向。例如，天然存在的半胱氨酸殘基可被突變?yōu)槠渌被嵋苑乐苟驑蛐纬?。但是，也可以故意將其他氨基酸序列位置突變?yōu)榘腚装彼嵋砸胄碌姆磻鶊F，例如用于軛合至其他化合物，諸如聚乙二醇(peg)、羥乙基淀粉(hes)、生物素、肽或蛋白，或用于形成非天然存在的二硫橋。此類突變將半胱氨酸殘基引入人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的氨基酸序列的示例性可能情況包括以下置換：thr40→cys、glu73→cys、arg90→cys、asp95→cys、lys121→cys、asn123→cys和glu131→cys。在氨基酸位置40、73、90、95、121、123和/或131中的任何位置的側(cè)鏈處的產(chǎn)生的硫醇部分可用于使突變蛋白peg化或hes化，例如，用來增加相應淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的血清半衰期。其中在任何這些序列位置引入了半胱氨酸的突變蛋白s244.2-h08(參見實施例9)是本發(fā)明的此類突變蛋白的例證性實例。任何半胱氨酸殘基的側(cè)鏈不但可以理所當然地用于軛合增加血清半衰期的化合物，而且也可用于軛合任何需要的軛合配偶體，諸如有機分子、酶標記物、毒素、細胞抑制劑、藥學上合適的放射活性標記物、熒光標記物、生色標記物、發(fā)光標記物、半抗原、地高辛、生物素、金屬配合物、金屬或膠體金，僅舉幾個有共鳴的實例。可使用本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)偶聯(lián)方法進行軛合(參見例如實施例18，其中半胱氨酸殘基可被諸如三[2-羧基乙基]膦(tcep)或二硫蘇糖醇(dtt)的試劑活化，并且然后進一步與諸如3-n-馬來酰亞胺-6-肼吡啶鹽酸鹽(hynic)的試劑反應。本發(fā)明還包括如上文定義的截短的突變蛋白(即片段)，其中，例如，成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的序列的前四個n-末端氨基酸殘基(his-his-leu-leu；位置1-4)和/或成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的序列的最后兩個c-末端氨基酸殘基(ser-asp；位置157-158)已被缺失(另參閱實施例和所附的序列表)。本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白能夠以可檢測的親和性，即以至少200nm的解離常數(shù)，結(jié)合期望的靶標，即c-met受體酪氨酸激酶或其結(jié)構(gòu)域或片段。在一些實施方案中，本發(fā)明優(yōu)選地是以對給定的靶標的至少100、20、1nm或甚至更低的解離常數(shù)結(jié)合期望的靶標的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。突變蛋白對期望的靶標的結(jié)合親和性可通過多種方法測量，諸如熒光滴定、競爭elisa或表面等離子體共振(biacore)。技術(shù)人員非常清楚，復合物形成取決于許多因素，諸如結(jié)合配偶體的濃度、競爭物的存在、緩沖系統(tǒng)的離子強度等。選擇和富集通常在允許分離在與期望的靶標(c-met或其結(jié)構(gòu)域或片段)的復合物中具有至少200nm的解離常數(shù)的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的條件下進行。但是，洗滌和洗脫步驟可在不同嚴格性下進行。關(guān)于動力學特性的選擇也是可能的。例如，選擇可以在有利于靶標與突變蛋白形成復合物的條件下進行，突變蛋白顯示從靶標的緩慢解離，或換言之，低的k解離(koff)速率?？蛇x地，選擇可在有利于在突變蛋白和靶標之間快速形成復合物或換言之高的k結(jié)合(kon)速率的條件下進行。作為進一步的例證性可選方案，篩選可在為突變蛋白的改善的熱穩(wěn)定性(與野生型淚脂質(zhì)運載蛋白或已經(jīng)對預先選擇的靶標具有親和性的突變蛋白相比)或為突變蛋白的ph穩(wěn)定性而選擇的條件下進行。本發(fā)明的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白通常以單體蛋白存在。但是本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白能夠自發(fā)地二聚化或形成更高的寡聚體也是可能的。雖然對于一些應用，使用形成穩(wěn)定單體的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白可能是優(yōu)選的，如因為更快的擴散和更好的組織穿透，但是在其他情況下，使用自發(fā)地形成穩(wěn)定的同型二聚體或多聚體的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白可能是有利的，因為此類多聚體可提供對給定的靶標的(進一步)增加的親和性和/或親和力。此外，脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的寡聚體形式可具有更慢的解離速率或延長的血清半衰期。如果需要使形成穩(wěn)定單體的突變蛋白二聚化或多聚化，這可例如通過將相應的寡聚化結(jié)構(gòu)域諸如jun-fos結(jié)構(gòu)域或亮氨酸拉鏈融合至本發(fā)明的突變蛋白或通過使用“duocalins”(另參見下文)而實現(xiàn)。本發(fā)明的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白可用于與c-met或其結(jié)構(gòu)域或片段形成復合物，例如，在體外形成復合物以用于活體外診斷目的，或在體內(nèi)形成復合物以用于治療目的。一般而言，如本文所用的術(shù)語“片段”在關(guān)于c-met時涉及n-末端和/或c-末端縮短的蛋白或肽配體，其保留了全長配體被根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白識別和/或結(jié)合的能力。術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”在涉及c-met時應根據(jù)本領(lǐng)域使用的常規(guī)含義進行理解。例如，術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”包含由stamos等人,theembojournal,vol.23,第2325-2335頁,2004在結(jié)構(gòu)上限定的sema結(jié)構(gòu)域(參見例如stamos等人的圖3a或圖4)、psi結(jié)構(gòu)域、igg-樣結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域或另外的由schiering等人,proc.natl.acad.sciusa,vol.100,no.22,第12654-12659頁,2003)在結(jié)構(gòu)上限定的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”還包含由全長受體蛋白的殘基met1至thr932形成的完整的c-met胞外部分，或由例如全長受體的殘基2、3、4、5、6至殘基920、925、930或931形成的截短的片段。如上文提及的，通過使用例如完整的胞外結(jié)構(gòu)域或僅一些胞外結(jié)構(gòu)域例如sema結(jié)構(gòu)域，可以產(chǎn)生結(jié)合hgf結(jié)合位點(并且隨之可能具有對于hgf的拮抗劑結(jié)合模式)的突變蛋白或另外的具有關(guān)于hgf結(jié)合的非拮抗劑結(jié)合模式的突變蛋白。在本文中，還注意到相應的突變蛋白和c-met或其結(jié)構(gòu)域或片段之間的復合物形成受到許多不同因素的影響，諸如相應結(jié)合配偶體的濃度、競爭物的存在、使用的緩沖液系統(tǒng)的ph和離子強度以及用于確定解離常數(shù)kd的實驗方法(例如熒光滴定、競爭elisa或表面等離子體共振，僅舉幾個例子)或者甚至用于評估實驗數(shù)據(jù)的數(shù)學算法。因此，技術(shù)人員還清楚，取決于用于確定特定脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白對給定的配體的親和性的方法和實驗設(shè)置，本文給出的kd值(相應突變蛋白和其配體之間形成的復合物的解離常數(shù))可能在某些實驗范圍內(nèi)變化。這意味著，取決于，例如，kd是通過表面等離子體共振(biacore)或通過競爭elisa確定，測量的kd值或公差范圍可存在輕微的偏差。在本發(fā)明的具體實施方案中，相對于成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的氨基酸序列，淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白包含相對于成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的氨基酸序列的至少6、8、10、12、14、16或17個氨基酸置換，其選自由以下組成的組：arg26→thr、val、pro、ser、gly；glu27→gln、gly、val、ser；phe28→met、asp；pro29→leu、ile、ala、trp；glu30→leu、gly、arg、phe；met31→ser；asn32→leu、arg、val、gln；leu33→tyr、val、ile、thr、phe；glu34→val、arg、ala；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile、val；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly。在一個更具體的實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白還包含選自由以下組成的組的至少一個氨基酸置換：thr37→ser；met39→ile、leu；asn48→ser；lys52→thr、met；met55→leu；lys65→arg、leu；ala79→leu、ser；ala86→thr；和ile89→ser、gln、thr、his。在另一更具體的實施方案中，突變蛋白包含以下氨基酸置換：arg26→thr；glu27→gln；glu30→leu；met31→ser；asn32→leu；leu33→tyr；glu34→val；leu56→asn；ile57→gln；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly。在本發(fā)明的又一更具體的實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白包含以下氨基酸置換：met31→ser；leu56→asn；ile57→gln；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly。在其他實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白可包含下列氨基酸置換組之一：(1)arg26→thr；glu27→gln；phe28→met；glu30→leu；met31→ser；asn32→leu；leu33→tyr；glu34→val；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly；(2)arg26→thr；glu27→gln；phe28→asp；glu30→leu；met31→ser；asn32→leu；leu33→tyr；glu34→val；leu56→asn；ile57→gln；ser58→val；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly；(3)arg26→thr；glu27→gln；phe28→asp；glu30→leu；met31→ser；asn32→leu；leu33→tyr；glu34→val；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly；(4)arg26→val；glu27→gly；phe28→asp；pro29→leu；glu30→gly；met31→ser；asn32→arg；leu33→val；glu34→val；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly；(5)arg26→pro；glu27→gly；phe28→asp；pro29→ile；glu30→arg；met31→ser；asn32→leu；leu33→ile；glu34→val；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly；(6)arg26→ser；phe28→asp；pro29→ala；glu30→phe；met31→ser；asn32→val；leu33→thr；glu34→val；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly；(7)arg26→val；glu27→val；phe28→asp；pro29→trp；glu30→arg；met31→ser；asn32→gln；leu33→val；glu34→arg；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly；以及(8)arg26→gly；glu27→ser；phe28→asp；pro29→trp；met31→ser；asn32→val；leu33→phe；glu34→ala；leu56→asn；ile57→gln；ser58→ile；asp80→tyr；lys83→ala；glu104→asp；leu105→thr；his106→trp；和lys108→gly。結(jié)合c-met或其結(jié)構(gòu)域或片段的人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白可包含如seqidno.：1、seqidno：4-9、seqidno：22-26或seqidno：32-35和37-49中任一所列的氨基酸序列的任一種或其片段或變體，或基本上由所述氨基酸序列或其片段或變體組成，或由所述氨基酸序列或其片段或變體組成。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白包含如seqidno：1、4、5、6、7、8、9、22至26、32至35或42至49所列的氨基酸序列或其片段或變體，或基本上由所述氨基酸序列或其片段或變體組成，或由所述氨基酸序列或其片段或變體組成。在這點上，應注意，本文公開的所有突變蛋白均可n-或c-末端連接至親和性標簽，諸如五組氨酸標簽、六組氨酸標簽或(參閱seqidno：37至41，例如，其中六組氨酸標簽融合于突變蛋白的c-末端)。因此，本申請還包括配備有此類標簽的所有明確和一般描述的突變蛋白。如本發(fā)明中使用的術(shù)語“片段”在關(guān)于本發(fā)明的突變蛋白時涉及n-末端和/或c-末端縮短的，即缺乏至少一個n-末端和/或c-末端氨基酸的，衍生自全長成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的蛋白或肽。此類片段包含成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白一級序列的優(yōu)選地至少10、更優(yōu)選地20、最優(yōu)選地30或更多連續(xù)氨基酸，并且在成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的免疫測定中通常是可檢測的。如本發(fā)明中使用的術(shù)語“變體”涉及包含氨基酸序列的修飾的蛋白或肽的衍生物，例如通過置換、缺失、插入或化學修飾。優(yōu)選地，此類修飾不降低蛋白或肽的功能性。此類變體包括其中一個或多個氨基酸已被它們相應的d-立體異構(gòu)體或被天然存在的20種氨基酸以外的氨基酸諸如，例如鳥氨酸、羥脯氨酸、瓜氨酸、高絲氨酸、羥賴氨酸、正纈氨酸置換的蛋白。但是，此類置換也可以是保守的，即氨基酸殘基被化學上相似的氨基酸殘基取代。保守置換的實例是下列組的成員之間的置換：1)丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和賴氨酸；5)異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。在本文中，值得注意的是，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的突變蛋白在約ph2.5至約ph9.5的大ph范圍內(nèi)，例如在約ph3.0至約ph9.2的ph范圍內(nèi)穩(wěn)定。還包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是以上突變蛋白，其潛在免疫原性方面已被改變。細胞毒性t細胞識別與i類主要組織相容性復合物(mhc)分子締合的抗原呈遞細胞的細胞表面上的肽抗原。肽與mhc分子結(jié)合的能力是等位基因特異性的，并且與它們的免疫原性相關(guān)。為了降低給定的蛋白的免疫原性，預測蛋白中的哪些肽具有與給定的mhc分子結(jié)合的潛能的能力具有重大價值。先前已描述了采用計算線程方法(computationalthreadingapproach)鑒定潛在t細胞表位的方法來預測給定的肽序列與mhci類分子的結(jié)合(altuvia等人(1995)j.mol.biol.249:244-250)。此類方法還可用于鑒定本發(fā)明的突變蛋白中的潛在t細胞表位和根據(jù)預定用途基于其預測的免疫原性選擇特定的突變蛋白。還可以使已被預測含有t細胞表位的肽區(qū)域經(jīng)受另外的誘變以減少或消除這些t細胞表位并由此使免疫原性最小化。從遺傳工程抗體中除去兩親性表位已有描述(mateo等人(2000)hybridoma19(6):463-471)并可用于本發(fā)明的突變蛋白。由此獲得的突變蛋白可擁有最低的免疫原性，這是它們用于治療和診斷應用諸如下文描述的那些應用所需的。對于一些應用，采用本發(fā)明的突變蛋白的軛合形式也是有用的。因此，本發(fā)明還涉及軛合至軛合配偶體的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，所述軛合配偶體可選自由以下組成的組：酶標記物、著色的標記物、細胞抑制劑、可被光激活并適合用于光動力學療法的標記物、半抗原、地高辛、生物素、化療金屬、或化療金屬和膠體金。突變蛋白還可軛合至有機藥物分子。如本文所用的術(shù)語“有機分子”優(yōu)選地指包含至少兩個碳原子但優(yōu)選地不超過7或12個可旋轉(zhuǎn)的碳鍵，具有在100至2000道爾頓、優(yōu)選地100至1000道爾頓范圍的分子量，并任選地包括一個或兩個金屬原子的有機分子。一般而言，可以用任何適當?shù)幕瘜W物質(zhì)或酶標記本文所述的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，這直接或間接產(chǎn)生在化學、物理學、光學或酶促反應中可檢測的化合物或信號。物理學反應并且同時是光學反應/標志物的實例是照射后的熒光發(fā)射。堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶或β-半乳糖苷酶是酶標記物(并且同時是光學標記物)的實例，它們催化生色反應產(chǎn)物的形成。一般而言，通常用于抗體的所有標記物(除了專門用于免疫球蛋白的fc部分中的糖部分的那些)也可用于軛合至本發(fā)明的突變蛋白。本發(fā)明的突變蛋白還可與任何合適的治療活性劑軛合，如用于此類劑向給定的細胞、組織或器官的靶向遞送，或用于選擇性靶向細胞如腫瘤細胞而不影響周圍的正常細胞。此類治療活性劑的實例包括放射性核素、毒素、小有機分子和治療肽(諸如充當細胞表面受體的激動劑/拮抗劑的肽或競爭給定的細胞靶標上的蛋白結(jié)合位點的肽)。合適的毒素的實例包括但不限于百日咳毒素、白喉毒素、蓖麻毒蛋白、皂草素、假單胞菌外毒素、刺孢霉素或其衍生物、紫杉醇類化合物(taxoid)、美登木素類化合物(maytansinoid)、tubulysin或多拉司他汀類似物。多拉司他汀類似物可以是奧瑞司他汀(auristatin)e、單甲基奧瑞司他汀e、奧瑞司他汀pye和奧瑞司他汀phe。細胞抑制劑的實例包括但不限于順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶、紫杉特爾(多西他奇)、紫杉醇、蒽環(huán)類抗生素(多柔比星)、甲氨蝶呤、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱、達卡巴嗪、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、阿霉素、喜樹堿、combretatastina-4相關(guān)化合物、磺胺類藥物、噁二唑啉、苯并[b]噻吩、合成的螺酮縮醇吡喃、單四氫呋喃化合物、curacin和curacin衍生物、甲氧雌二醇衍生物和亞葉酸。本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白還可與治療活性的核酸諸如反義核酸分子、小干擾rna、微rna或核酶軛合。此類軛合物可通過本領(lǐng)域公知的方法產(chǎn)生。在一個實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白還可偶聯(lián)至靶向特定的身體區(qū)域的靶向部分，以將本發(fā)明的突變蛋白遞送至身體內(nèi)的期望區(qū)域或范圍。其中可能需要此類修飾的一個實例是跨越血腦屏障。為了跨越血腦屏障，本發(fā)明的突變蛋白可偶聯(lián)至促進跨越此屏障的主動轉(zhuǎn)運的部分(參見gaillardpj等人,diphtheria-toxinreceptor-targetedbraindrugdelivery(靶向白喉毒素受體的腦部藥物遞送).internationalcongressseries.20051277；185-198或gaillardpj等人targeteddeliveryacrosstheblood-brainbarrier(跨越血腦屏障的靶向遞送).expertopindrugdeliv.20052(2)：299-309。此類部分是例如以商標名2b-transtm(to-bbbtechnologiesbv,leiden,nl)可獲得的。如上所述，在一些實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白可軛合至延長所述突變蛋白的血清半衰期的部分(在這一點上，另參見國際專利申請pct/ep2007/057971或pct公布wo2006/56464，其中參考對ctla-4具有結(jié)合親和性的人嗜中性白細胞明膠酶相關(guān)的脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白描述了此類軛合策略)。延長血清半衰期的部分可以是聚亞烷基二醇分子、羥乙基淀粉、脂肪酸分子諸如棕櫚酸(vajo&duckworth2000,pharmacolrev.52,1-9)、免疫球蛋白的fc部分、免疫球蛋白的ch3結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的ch4結(jié)構(gòu)域、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合肽、白蛋白結(jié)合蛋白、igg-fc-結(jié)合蛋白或運鐵蛋白，僅舉幾個例子。白蛋白結(jié)合蛋白可以是細菌白蛋白結(jié)合蛋白、抗體、抗體片段包括結(jié)構(gòu)域抗體(參見例如美國專利6,696,245)、對白蛋白具有結(jié)合活性的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白或另一蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域。因此，用于延長本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的半衰期的合適的軛合配偶體包括白蛋白(osborn,b.l.等人(2002)pharmacokineticandpharmacodynamicstudiesofahumanserumalbumin-interferon-alphafusionproteinincynomolgusmonkeys(短尾猴中人血清白蛋白-干擾素α融合蛋白的藥物代謝動力學和藥效學研究)j.pharmacol.exp.ther.303,540-548)，或白蛋白結(jié)合蛋白，例如細菌白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，諸如鏈球菌蛋白g的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(t.和skerra,a.(1998)useofanalbumin-bindingdomainfortheselectiveimmobilisationofrecombinantcaptureantibodyfragmentsonelisaplates(白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于在elisa平板上選擇性固定重組捕獲抗體片段的用途).j.immunol.methods218,73-83)?？捎米鬈椇吓渑俭w的白蛋白結(jié)合肽的其他實例是，例如具有cys-xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-cys共有序列的那些，其中xaa1是asp、asn、ser、thr或trp；xaa2是asn、gln、his、ile、leu或lys；xaa3是ala、asp、phe、trp或tyr；和xaa4是asp、gly、leu、phe、ser或thr，如美國專利申請2003/0069395或dennis等人(dennis,m.s.,zhang,m.,meng,y.g.,kadkhodayan,m.,kirchhofer,d.,combs,d.&damico,l.a.(2002).“albuminbindingasageneralstrategyforimprovingthepharmacokineticsofproteins(白蛋白結(jié)合作為改善蛋白的藥物代謝動力學的通用策略).”jbiolchem277,35035-35043)所述。在其他實施方案中，白蛋白自身或白蛋白的生物活性片段可用作本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的軛合配偶體。術(shù)語“白蛋白”包括所有哺乳動物白蛋白，諸如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白。白蛋白或其片段可重組產(chǎn)生，如美國專利5,728,553或歐洲專利申請ep0330451和ep0361991所述。重組人白蛋白novozymesdeltaltd.(nottingham,uk)可軛合或融合至脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白以延長所述突變蛋白的半衰期。如果白蛋白結(jié)合蛋白是抗體片段，其可以是結(jié)構(gòu)域抗體。結(jié)構(gòu)域抗體(dab)被加工為允許精確地控制生物物理性質(zhì)和體內(nèi)半衰期，以產(chǎn)生最優(yōu)的安全性和有效的產(chǎn)物譜。結(jié)構(gòu)域抗體是例如從domantisltd.(cambridge,uk和ma,usa)商業(yè)可獲得的。使用運鐵蛋白作為延長本發(fā)明突變蛋白的血清半衰期的部分，所述突變蛋白可遺傳融合于非糖基化的運鐵蛋白的n或c末端或兩個末端。非糖基化的運鐵蛋白具有14-17天的半衰期，并且運鐵蛋白融合蛋白將相似地具有延長的半衰期。運鐵蛋白載體還提供高生物利用度、生物分布和循環(huán)穩(wěn)定性。此技術(shù)是從biorexis(biorexispharmaceuticalcorporation,pa,usa)商業(yè)可獲得的。用作蛋白穩(wěn)定劑/半衰期延長配偶體的重組人運鐵蛋白(deltaferrintm)也是從novozymesdeltaltd.(nottingham,uk)商業(yè)可獲得的。如果免疫球蛋白的fc部分被用于延長本發(fā)明的突變蛋白的血清半衰期目的，可使用從syntonixpharmaceuticals,inc(ma,usa)商業(yè)可獲得的synfusiontm技術(shù)。使用此fc-融合技術(shù)允許產(chǎn)生作用更長的生物藥物，并可例如由連接至抗體的fc區(qū)的兩個拷貝的突變蛋白組成，以改善藥物代謝動力學、溶解性和生產(chǎn)效率。延長本發(fā)明的突變蛋白的半衰期的又一可選方案是將本發(fā)明的突變蛋白的n-或c-末端融合于長的、無組織的、靈活的富含甘氨酸的序列(例如具有約20至80個連續(xù)甘氨酸殘基的聚甘氨酸)。在wo2007/038619中公開的此方法，例如，也可以是術(shù)語“rpeg”(重組peg)。如果使用聚亞烷基二醇作為軛合配偶體，則該聚亞烷基二醇可以是取代的、未取代的、線性的或分支的。其還可以是活化的聚亞烷基衍生物。合適的化合物的實例是聚乙二醇(peg)分子，如關(guān)于干擾素的wo99/64016、美國專利6,177,074或美國專利6,403,564中所述，或如為其他蛋白諸如peg修飾的天冬酰胺酶、peg-腺苷脫氨酶(peg-ada)或peg-超氧化物歧化酶所述(參見例如，fuertges等人(1990)theclinicalefficacyofpoly(ethyleneglycol)-modifiedproteins(聚乙二醇修飾的蛋白的臨床效力)j.control.release11,139-148)。此類聚合物優(yōu)選地為聚乙二醇的分子量可在約300至約70.000道爾頓范圍內(nèi)，包括，例如分子量為約10.000、為約20.000、為約30.000或為約40.000道爾頓的聚乙二醇。此外，如例如美國專利6,500,930或6,620,413中所述，糖類寡聚物和聚合物諸如淀粉或羥乙基淀粉(hes)可軛合至本發(fā)明的突變蛋白以用于延長血清半衰期目的。如果上述部分之一軛合至本發(fā)明的人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，那么軛合至氨基酸側(cè)鏈可以是有利的。合適的氨基酸側(cè)鏈可天然存在于人淚脂質(zhì)運載蛋白的氨基酸序列中，或可通過誘變引入。在合適的結(jié)合位點是經(jīng)由誘變引入的情況下，一種可能是用半胱氨酸殘基置換所述適當?shù)奈恢锰幍陌被?。在一個實施方案中，此類突變包括以下置換中的至少一個：thr40→cys、glu73→cys、arg90→cys、asp95→cys、lys121→cys、asn123→cys或glu131→cys。在這些位置中的任何位置處新產(chǎn)生的半胱氨酸殘基可接著用于將所述突變蛋白軛合至延長所述突變蛋白的血清半衰期的部分，諸如peg或其活化衍生物。在另一實施方案中，為了提供用于將上述部分之一軛合至本發(fā)明的突變蛋白的合適的氨基酸側(cè)鏈，可通過誘變引入人工氨基酸。一般而言，此類人工氨基酸被設(shè)計為反應性更強，并由此促進與所需的部分的軛合?？山?jīng)由人工trna引入的此類人工氨基酸的一個實例是對乙酰苯丙氨酸。對于本文公開的突變蛋白的幾種應用，使用其融合蛋白形式可能是有利的。在一些實施方案中，本發(fā)明的人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白在其n-末端或其c-末端融合于蛋白、蛋白結(jié)構(gòu)域或肽，諸如信號序列和/或親和性標簽。對于藥物應用，本發(fā)明的突變蛋白可融合于延長突變蛋白的體內(nèi)血清半衰期的融合配偶體(同樣參見pct公布wo2006/56464，其中參考對ctla-4具有結(jié)合親和性的人嗜中性白細胞明膠酶相關(guān)的脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白描述了合適的融合配偶體)。與上文描述的軛合物相似，融合配偶體可以是免疫球蛋白的fc部分、免疫球蛋白的ch3結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的ch4結(jié)構(gòu)域、白蛋白、白蛋白結(jié)合肽或白蛋白結(jié)合蛋白，僅舉幾個例子。同樣，白蛋白結(jié)合蛋白可以是細菌白蛋白結(jié)合蛋白或?qū)Π椎鞍拙哂薪Y(jié)合活性的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。因此，用于延長本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的半衰期的合適的融合配偶體包括白蛋白(osborn,b.l.等人(2002)同上j.pharmacol.exp.ther.303,540-548)，或白蛋白結(jié)合蛋白，例如細菌白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，諸如鏈球菌蛋白g的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(t.和skerra,a.(1998)同上j.immunol.methods218,73-83)。dennis等人，同上(2002)或美國專利申請2003/0069395中描述的具有cys-xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-cys共有序列，其中xaa1是asp、asn、ser、thr或trp；xaa2是asn、gln、his、ile、leu或lys；xaa3是ala、asp、phe、trp或tyr；和xaa4是asp、gly、leu、phe、ser或thr的白蛋白結(jié)合肽也可用作融合配偶體。還可以使用白蛋白自身或白蛋白的生物活性片段作為本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的融合配偶體。術(shù)語“白蛋白”包括所有哺乳動物白蛋白，諸如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠血清白蛋白。白蛋白或其片段的重組產(chǎn)生是本領(lǐng)域公知的，并且例如描述于美國專利5,728,553、歐洲專利申請ep0330451或ep0361991。融合配偶體可賦予本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白新的特性，諸如對其他分子的酶促活性或結(jié)合親和性。合適的融合蛋白的實例是堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、谷胱甘肽(gluthation)-s-轉(zhuǎn)移酶、蛋白g的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、蛋白a、抗體片段、寡聚化結(jié)構(gòu)域、具有相同或不同結(jié)合特異性(其造成“duocalins”的形成，參閱schlehuber,s.和skerra,a.(2001),duocalins,engineeredligand-bindingproteinswithdualspecificityderivedfromthelipocalinfold(duocalins，衍生自脂質(zhì)運載蛋白折疊的具有雙重特異性的工程設(shè)計的配體結(jié)合蛋白).biol.chem.382,1335-1342)的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白或毒素。特別地，可以將本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白與單獨的酶活性位點融合，以使得到的融合蛋白的兩個“組分”一起作用于給定的治療靶標。脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接于造成疾病的靶標，允許酶結(jié)構(gòu)域消除所述靶標的生物功能。親和性標簽諸如或ii(schmidt,t.g.m.等人(1996)j.mol.biol.255,753-766)、myc-標簽、flag-標簽、his6-標簽或ha-標簽或蛋白諸如谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶也允許容易地檢測和/或純化重組蛋白，是優(yōu)選的融合配偶體的進一步實例。最后，具有生色或熒光性質(zhì)的蛋白諸如綠色熒光蛋白(gfp)或黃色熒光蛋白(yfp)也是用于本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的合適的融合配偶體。如本文所用的術(shù)語“融合蛋白”還包括含有信號序列的根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。在多肽的n-末端的信號序列指導此多肽至特定的細胞區(qū)室，例如大腸桿菌的周質(zhì)或真核細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。許多信號序列是本領(lǐng)域已知的。用于將多肽分泌到大腸桿菌的周質(zhì)的優(yōu)選信號序列是ompa-信號序列。本發(fā)明還涉及包含編碼如本文所述的突變蛋白的核苷酸序列的核酸分子(dna和rna)。由于遺傳密碼的簡并性允許某些密碼子被指定相同氨基酸的其他密碼子置換，因此本發(fā)明并不限于編碼本發(fā)明的突變蛋白的特定核酸分子，而是包括包含編碼功能突變蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。因此，本發(fā)明還包括編碼根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白的核酸序列，所述突變蛋白包含天然成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的線性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中的任何位置的至少一種密碼子處的突變，其中編碼成熟的人淚脂質(zhì)運載蛋白的線性多肽序列的序列位置61和153處的半胱氨酸殘基的至少一個的密碼子已被突變?yōu)榫幋a任何其他氨基酸殘基。本文公開的發(fā)明還包括編碼淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的核酸分子，其包含指明的實驗誘變序列位置之外的其他突變。此類突變通常是耐受的，或者甚至可證明是有利的，例如如果它們有助于突變蛋白的改善的折疊效率、血清穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性或配體結(jié)合親和性。本申請中公開的核酸分子可被“可操作地連接”于調(diào)節(jié)序列(或多個調(diào)節(jié)序列)以允許此核酸分子的表達。如果核酸分子包含含有關(guān)于轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)的信息的序列元件并且此類序列“可操作地連接”于編碼多肽的核苷酸序列，則稱該核酸分子諸如dna，“能夠表達核酸分子”或能夠“允許核苷酸序列的表達”。可操作連接是其中調(diào)節(jié)序列元件和要表達的序列以允許基因表達的方式連接的連接?；虮磉_必需的調(diào)節(jié)區(qū)域的精確性質(zhì)可隨物種而不同，但是一般而言，這些區(qū)域包含啟動子，在原核生物中，啟動子既含有啟動子本身，即指導轉(zhuǎn)錄起始的dna元件，又含有在被轉(zhuǎn)錄成rna時將發(fā)出翻譯起始信號的dna元件。此類啟動子區(qū)域通常包括參與轉(zhuǎn)錄和翻譯起始的5'非編碼序列，諸如原核生物中的-35/-10盒和shine-dalgarno元件或真核生物中的tata盒、caat序列和5'-加帽元件。這些區(qū)域還可包括增強子或抑制子元件以及翻譯信號和用于將天然多肽靶向至宿主細胞的特定區(qū)室的先導序列。此外，3'非編碼序列可含有參與轉(zhuǎn)錄終止、聚腺苷酸化或類似事件的調(diào)節(jié)元件。但是，如果這些終止序列在特定的宿主細胞中沒有令人滿意的功能，則可將它們置換為在所述細胞中具有功能的信號。因此，本發(fā)明的核酸分子可包括調(diào)節(jié)序列，優(yōu)選地啟動子序列。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含啟動子序列和轉(zhuǎn)錄終止序列。合適的原核啟動子是，例如tet啟動子、lacuv5啟動子或t7啟動子。可用于真核細胞中的表達的啟動子的實例是sv40啟動子或cmv啟動子。本發(fā)明的核酸分子還可以是載體或任何其他類型的克隆媒介物(vehicle)諸如質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體、桿狀病毒、粘粒或人工染色體的部分。在一個實施方案中，所述核酸分子包含在噬粒中。噬粒載體指編碼溫和噬菌體諸如m13或f1的基因間區(qū)域或融合于感興趣的cdna的其功能部分的載體。用此類噬菌粒載體和適當?shù)妮o助噬菌體(如m13k07、vcs-m13或r408)重復感染細菌宿主細胞之后，產(chǎn)生完整的噬菌體顆粒，由此實現(xiàn)編碼的異源cdna與噬菌體表面上展示的其相應多肽的物理偶聯(lián)(綜述參見，如kay,b.k.等人(1996)phagedisplayofpeptidesandproteins-alaboratorymanual(肽和蛋白的噬菌體展示實驗手冊),第1版,academicpress,newyorkny；lowman,h.b.(1997)annu,rev.biophys,biomol.struct.26,401-424,或rodi,d.j.和makowski,l.(1999)curr.opin.biotechnol.10,87-93)。除了上文描述的調(diào)節(jié)序列和編碼本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的核酸序列之外，此類克隆媒介物可包括衍生自與用于表達的宿主細胞相容的物種的復制和控制序列，以及賦予轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的細胞可選擇的表型的選擇標志物。許多合適的克隆載體是本領(lǐng)域已知的，并且是商業(yè)可獲得的。編碼本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的dna分子并且特別是含有此類脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的編碼序列的克隆載體可被轉(zhuǎn)化到能夠表達該基因的宿主細胞中。轉(zhuǎn)化可使用標準技術(shù)進行(sambrook,j.等人(1989)，同上)。因此，本發(fā)明還涉及含有本文公開的核酸分子的宿主細胞。轉(zhuǎn)化的宿主細胞在適于表達編碼本發(fā)明的融合蛋白的核苷酸序列的條件下培養(yǎng)。合適的宿主細胞可以是原核的，諸如大腸埃希氏菌(escherichiacoli)(大腸桿菌)或枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)，或真核的，諸如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)、sf9或high5昆蟲細胞、永生化哺乳動物細胞系(如hela細胞或cho細胞)或原代哺乳動物細胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的突變蛋白的方法，其中所述突變蛋白、所述突變蛋白的片段或所述突變蛋白和另一多肽的融合蛋白是通過遺傳工程方法以編碼所述突變蛋白的核酸為起點產(chǎn)生的。所述方法可在體內(nèi)進行，所述突變蛋白可例如在細菌或真核宿主生物體中產(chǎn)生，然后從此宿主生物體或其培養(yǎng)物中分離。還可以體外產(chǎn)生蛋白，例如通過使用體外翻譯系統(tǒng)。當在體內(nèi)產(chǎn)生所述突變蛋白時，通過重組dna技術(shù)將編碼本發(fā)明的突變蛋白的核酸引入合適的細菌或真核宿主生物體(如上文已經(jīng)列舉的)。為此目的，首先使用公認的標準方法(sambrook,j.等人(1989)，同上)用包含編碼本發(fā)明的突變蛋白的核酸分子的克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細胞。然后在允許異源dna表達并由此合成相應多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞。隨后，從細胞或從培養(yǎng)基中回收多肽。在本發(fā)明的一些淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白中，cys61和cys153之間天然存在的二硫鍵被除去。因此，此類突變蛋白(或不包含分子內(nèi)二硫鍵的任何其他淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白)可在具有還原性氧化還原環(huán)境的細胞區(qū)室中產(chǎn)生，例如，在革蘭氏陰性細菌的細胞質(zhì)中。在本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白包含分子內(nèi)二硫鍵的情況下，可能優(yōu)選使用適當?shù)男盘栃蛄袑⑿律嚯囊龑е辆哂醒趸匝趸€原環(huán)境的細胞區(qū)室中。此類氧化性環(huán)境可由革蘭氏陰性細菌諸如大腸桿菌的周質(zhì)、在革蘭氏陽性細菌的胞外環(huán)境中或在真核細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中提供，并且通常有利于結(jié)構(gòu)性二硫鍵的形成。但是，也可以在宿主細胞優(yōu)選地大腸桿菌的胞質(zhì)溶膠中產(chǎn)生本發(fā)明的突變蛋白。在這種情況下，多肽可以可溶和折疊的狀態(tài)直接獲得，或可以包含體的形式回收，然后進行體外復性。進一步的選擇是使用具有氧化性胞內(nèi)環(huán)境的特定宿主菌株，其可因此允許在胞質(zhì)溶膠中形成二硫鍵(venturim,seifertc,huntec.(2002)“highlevelproductionoffunctionalantibodyfabfragmentsinanoxidizingbacterialcytoplasm(氧化性細菌細胞質(zhì)中功能性抗體fab片段的高水平產(chǎn)生).”j.mol.biol.315,1-8.)。然而，本發(fā)明的突變蛋白可不必通過僅使用遺傳工程產(chǎn)生或生產(chǎn)。相反，脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白還可通過化學合成諸如merrifield固相多肽合成或通過體外轉(zhuǎn)錄和翻譯獲得。例如，可以使用分子建模鑒定有希望的突變，然后體外合成想要的(設(shè)計的)多肽并研究對給定的靶標的結(jié)合活性。用于蛋白的固相和/或溶液相合成的方法是本領(lǐng)域公知的(綜述參見，如lloyd-williams,p.等人(1997)chemicalapproachestothesynthesisofpeptidesandproteins(合成肽和蛋白的化學方法).crcpress,bocaraton,fields,g.b.和colowick,s.p.(1997)solid-phasepeptidesynthesis(固相肽合成).academicpress,sandiego,或bruckdorfer,t.等人(2004)curr.pharm.biotechnol.5,29-43)。在另一實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的公認方法通過體外轉(zhuǎn)錄/翻譯產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及包含至少一種本發(fā)明的人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白或其融合蛋白或軛合物和藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白可經(jīng)由對蛋白藥物在治療上有效的任何腸胃外或非腸胃外(腸內(nèi))路徑施用。腸胃外應用方法包括，例如皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)或靜脈內(nèi)注射和輸注技術(shù)，如以注射溶液、輸注溶液或酊劑的形式，以及氣溶膠滴注(installation)和吸入，如以氣溶膠混合物、噴霧或粉劑的形式。關(guān)于肺部藥物遞送，即經(jīng)由氣溶膠吸入(其還可用于鼻內(nèi)施用)或氣管內(nèi)滴注(instiallation)，的綜述由例如j.s.patton等人thelungsasaportalofentryforsystemicdrugdelivery(肺作為全身藥物遞送的進入入口).proc.amer.thoracicsoc.2004vol.1第338-344頁)給出。非腸胃外遞送模式是，例如，口服，如以丸劑、片劑、膠囊劑、溶液劑或混懸劑的形式，或直腸遞送，如以栓劑的形式。本發(fā)明的突變蛋白可根據(jù)需要在含有常規(guī)的無毒的藥學上可接受的賦形劑或載體、添加劑和媒介物的制劑中全身或局部施用。在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物被腸胃外施用于哺乳動物，特別是人。相應的施用方法包括但不限于，例如皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、氣管內(nèi)或靜脈內(nèi)注射和輸注技術(shù)，如以注射溶液、輸注溶液或酊劑的形式，以及氣溶膠滴注和吸入，如以氣溶膠混合物、噴霧或粉劑的形式。在化合物具有相對短的血清半衰期的情況下，靜脈內(nèi)和皮下輸注和/或注射的組合可能是最方便的。藥物組合物可以是水溶液、水包油乳液或油包水乳液。在這一點上，值得注意的是，還可以使用透皮遞送技術(shù)，如離子電滲療法、超聲促滲或微針增強的遞送，如meidanvm和michniakbb2004am.j.ther.11(4):312-316中所述，進行本文描述的突變蛋白的透皮遞送。非腸胃外遞送模式是，例如，口服，如以丸劑、片劑、膠囊劑、溶液劑或混懸劑的形式，或直腸施用，如以栓劑的形式。本發(fā)明的突變蛋白可在含有多種常規(guī)的無毒的藥學上可接受的賦形劑或載體、添加劑和媒介物的制劑中全身或局部施用。應用的突變蛋白的劑量可在寬的限制內(nèi)變化以實現(xiàn)期望的預防效應或治療應答。它將，例如，取決于化合物對所選的配體的親和性以及突變蛋白和所述配體的復合物在體內(nèi)的半衰期。此外，最優(yōu)的劑量將取決于突變蛋白或其融合蛋白或其軛合物的生物分布、施用模式、所治療的疾病/疾患的嚴重度以及患者的醫(yī)療狀況。例如，當在用于局部應用的軟膏劑中使用時，可使用高濃度的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。但是，如果需要，突變蛋白還可以持續(xù)釋放制劑給出，例如脂質(zhì)體分散物或基于水凝膠的聚合物微球，像polyactivetm或octodextm(參閱bos等人,businessbriefing:pharmatech2003:1-6)?？色@得的其他持續(xù)釋放制劑有例如基于plga的聚合物(prpharmaceuticals)、基于pla-peg的水凝膠(medincell)和基于pea的聚合物(medivas)。因此，可使用藥學上可接受的成分以及公認的制備方法將本發(fā)明的突變蛋白配制成組合物(gennaro,a.l.和gennaro,a.r.(2000)remington:thescienceandpracticeofpharmacy(雷明頓：藥物科學與實踐),第20版.,lippincottwilliams&wilkins,philadelphia,pa)。為了制備藥物組合物，可使用藥學上惰性的無機或有機賦形劑。為了制備如丸劑、粉劑、明膠膠囊劑或栓劑，可以使用例如，乳糖、滑石、硬脂酸和其鹽、脂肪、蠟、固體或液體多元醇、天然和硬化的油。用于生產(chǎn)溶液劑、混懸劑、乳液、氣溶膠混合物或在使用前重構(gòu)成溶液劑或氣溶膠混合物的粉劑的合適的賦形劑包括水、醇類、甘油、多元醇和其合適的混合物以及植物油。藥物組合物還可含有添加劑，諸如，例如填充劑、粘合劑、濕潤劑、助流劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、乳化劑，以及另外，溶劑或助溶劑或?qū)崿F(xiàn)貯藏效應的劑。后者是可將融合蛋白摻入緩釋或持續(xù)釋放或靶向遞送系統(tǒng)，諸如脂質(zhì)體和微膠囊。制劑可通過許多手段滅菌，包括濾過阻留細菌的過濾器或通過在無菌固體組合物的形式中摻入滅菌劑，所述無菌固體組合物可在臨用前溶解或分散于無菌水或其他無菌介質(zhì)中。本發(fā)明的另一方面涉及治療有相應需要的受治療者中的疾病或疾患的方法。此疾病可牽涉或可不牽涉c-met受體酪氨酸激酶的結(jié)合/相互作用。所述疾病可以是其發(fā)展牽涉hgf/c-met途徑的疾病。此類疾病或疾患可以是細胞增殖性疾患。細胞增殖性疾病的實例是癌癥。治療的癌癥的實例包括但不限于，例如肝癌、結(jié)腸癌(例如，原發(fā)性結(jié)腸癌，參見例如clincancerres.2003,9(4),第1480-1488頁)、結(jié)腸直腸癌(參閱zeng等人,clin.exp.metastasis,200004,21(5),第409-417頁)、肝細胞癌、乳頭狀腎癌、頭頸鱗狀細胞癌(hnsc)、頭頸鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤(參見，例如schiering等人,pnas,vol.100,no.22,第12654-12559頁,2003或綜述trusolino&comoglio,(2002),nat.rev.cancer,289-300或maulik等人(2002)cytokinegrowthfaktorrev.13,41-59)。對于此類治療目的，可使用拮抗hgf/c-met途徑的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白、和/或淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的毒素融合體或軛合物、或淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白與上文所述的細胞抑制劑的軛合物。需要此類治療的受治療者可以是哺乳動物，諸如人、狗、小鼠、大鼠、豬、猿諸如短尾猴，僅舉幾個例證性實例。如從以上的公開內(nèi)容中明顯的，本發(fā)明的突變蛋白或其融合蛋白或軛合物可用于許多應用。一般而言，此類突變蛋白可用于所有使用抗體的應用，特異地依賴fc部分的糖基化的那些應用除外。因此，在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白可用于體外檢測給定的配體，即c-met受體或其結(jié)構(gòu)域或片段。此類用途可包括以下步驟：使突變蛋白與懷疑含有給定的配體的樣品在合適的條件下接觸，從而允許在所述突變蛋白和所述給定的配體之間形成復合物，并通過合適的信號檢測復合的突變蛋白?？蓹z測的信號可由標記物引起，如以上解釋的，或由結(jié)合即復合物形成本身造成的物理性質(zhì)的變化引起。一個實例是表面等離子體共振，其值在結(jié)合配偶體的結(jié)合過程中被改變，所述結(jié)合配偶體之一固定在表面諸如金箔上。本文公開的人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白還可用于體外分離人淚脂質(zhì)運載蛋白的給定的配體。此類用途可包括以下步驟：使所述突變蛋白與猜測含有所述配體的樣品在合適的條件下接觸，從而允許在所述突變蛋白和所述給定的配體之間形成復合物，并從樣品中分離突變蛋白/配體復合物。在突變蛋白用于檢測給定的配體以及分離給定的配體的兩種用途中，突變蛋白和/或靶標可固定在合適的固相上。本發(fā)明的人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白還可用于將化合物靶向至預先選擇的位點。在一個此類實施方案中，人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白用于將藥學活性化合物靶向至生物體或組織中預先選擇的位點，包括：a)使所述突變蛋白與所述化合物軛合，和b)將突變蛋白/化合物復合物遞送至預先選擇的位點。所述藥學活性化合物可選自由以下組成的組：毒素、細胞抑制劑或c-met拮抗劑。c-met拮抗劑的實例包括單克隆抗體(其通常結(jié)合c-met的胞外結(jié)構(gòu)域)或靶向胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(特別是酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域)的抑制劑。小分子抑制劑的實例包括但不限于，wo2004/031184中所述的1,3,5,三嗪-2,4-二胺衍生物、2-(2-,6-二氯苯基-咪唑衍生物、含氮的雙環(huán)衍生物、5-芐基磺酰基和磺胺取代的吡咯二氫吲哚(例如，由sugen開發(fā)的并由christensonj.g.aacr,abst4963和6200,2003或sattlerm等人,aacr,abst1005,2003描述的化合物pha-665752)。對于此類目的，使突變蛋白與c-met受體酪氨酸激酶或結(jié)構(gòu)域接觸以允許形成復合物。然后將包含突變蛋白和感興趣的化合物的復合物遞送至預先選擇的位點。此用途特別適合于，但不限于將藥物(選擇性地)遞送至生物體中預先選擇的位點，諸如猜測要用所述藥物治療的感染的身體部位、組織或器官。除了在突變蛋白和感興趣的化合物之間形成復合物之外，還可使突變蛋白與給定的化合物反應，以產(chǎn)生突變蛋白和化合物的軛合物。與上述復合物相似，此類軛合物可適于將所述化合物遞送至預先選擇的靶位點。突變蛋白和化合物的此類軛合物還可包括將突變蛋白和化合物共價連接至彼此的連接體。任選地，此類連接體在血流中是穩(wěn)定的，但在細胞環(huán)境中是可切割的。本文公開的突變蛋白和其衍生物因此可用于與抗體或其片段相似的許多領(lǐng)域。除了將給定的突變蛋白結(jié)合于支持物，以允許固定或分離該突變蛋白的靶標或此靶標的軛合物或融合蛋白的用途之外，所述突變蛋白還可用于使用酶、抗體、放射活性物質(zhì)或具有生物化學活性或指定的結(jié)合特性的任何其他基團進行標記。通過這樣做，可檢測它們的相應靶標或其軛合物或融合蛋白，或使之與它們接觸。例如，本發(fā)明的突變蛋白可用于通過公認的分析方法(如elisa或蛋白質(zhì)印跡)或通過顯微術(shù)或免疫傳感術(shù)(immunosensorics)檢測化學結(jié)構(gòu)。在這里，檢測信號可以是通過使用合適的突變蛋白軛合物或融合蛋白直接產(chǎn)生的，或是通過經(jīng)由抗體免疫化學檢測結(jié)合的突變蛋白間接產(chǎn)生。藥學中還存在本發(fā)明的突變蛋白的許多可能應用。除了它們用于體外診斷和藥物遞送的用途之外，還可產(chǎn)生結(jié)合，例如組織或腫瘤特異性細胞表面分子的本發(fā)明的突變體多肽。本發(fā)明通過下列非限制性實施例和附圖得到進一步例證，其中：圖1顯示噬粒載體ptlpc59的圖譜，圖1a顯示載體的調(diào)節(jié)元件的示意性圖示，圖1b代表用于表達天然文庫的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的基因構(gòu)建體的示意性放大，圖2顯示表達載體ptlpc10的圖譜，圖3顯示與野生型淚脂質(zhì)運載蛋白的多肽序列比對的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白s225.4-k24的多肽序列(seqidno：1)，圖4顯示經(jīng)由elisa的親和性篩選方法和獲得的突變蛋白對c-met的親和性的結(jié)果，圖5顯示淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白s225.4-k24(seqidno：1)和s244.2-h08、s244.2-l01、s244.4-n05、s244.5-j05、s244.8-i20、s244.8-i07(seqidno：4-9)的多肽序列的比對，圖6顯示本發(fā)明的人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白(s244.2-h08；seqidno:4)與c-met的結(jié)合的biacore測量結(jié)果，圖7顯示在ht-29細胞的細胞環(huán)境中對c-met結(jié)合突變蛋白s244.2-h08、s244.2-l01、s244.4-n05、s244.5-j05、s244.8-i20、s244.8-i07(seqidno：4-9)的親和性評估的結(jié)果，圖8顯示經(jīng)由elisa的親和性篩選方法和獲得的突變蛋白對c-met的親和性的結(jié)果，圖9顯示淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白s225.4-k24(seqidno：1)、s244.2-h08(seqidno：4)、s261.1-l12、s261.1-j01和s261.1-l17(seqidno：32-34)的多肽序列的比對。圖10顯示表達載體ptlpc47的圖譜，圖11顯示在ht-29細胞的細胞環(huán)境中對c-met結(jié)合突變蛋白s261.1-l12、s261.1-j01和s261.1-l17(seqidno:32-34)的親和性評估的結(jié)果，圖12顯示本發(fā)明的人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白(s261.1-l17；seqidno:34)對c-met的結(jié)合的競爭elisa測量結(jié)果，圖13顯示在ht-29細胞的細胞環(huán)境中對c-met結(jié)合突變蛋白s261.1-l12_c123(seqidno:35)的親和性評估的結(jié)果，圖14顯示對淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白s261.1-j01(seqidno：33)的ph穩(wěn)定性測試的結(jié)果，圖15顯示本發(fā)明的另外的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白(其中已引入了另外的單一突變)的多肽序列的比對以及它們與c-met結(jié)合的kd值，圖16顯示在ht-29細胞的細胞環(huán)境中對c-met結(jié)合突變蛋白s318.1-c10、s318.1-l13、s318.1-a16、s318.2-i24和s318.1-o12(seqidno：42、44、45、46和49)的親和性評估的結(jié)果。實施例除非另外指明，否則使用重組基因技術(shù)的公認方法，例如，如sambrook等人(同上)中所述。實施例1：具有1,6x1010個獨立tlc突變蛋白的文庫的產(chǎn)生具有高復雜性的淚脂質(zhì)運載蛋白(tlc)的隨機文庫基本按pct申請pct/ep2007/057971的實施例1中的描述制備，其公開內(nèi)容通過引用完全并入本文，例外是噬菌體展示ptlpc59的文庫基因構(gòu)建體(圖1a和1b)被置于lacp/o而不是tetp/o控制之下并遺傳融合于vcsm13噬菌體的全長基因iii。使用用于大腸桿菌感染的m13k07hyperphage(progen)在文獻中描述的標準方法下實現(xiàn)了多價噬菌體展示形式的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白噬菌體產(chǎn)生(m.kirsch等人/journalofimmunologicalmethods301(2005)173-185)。實施例2：對c-met受體具有親和性的tlc突變蛋白的噬菌粒展示和選擇噬菌粒展示和選擇采用實施例1中獲得的噬菌?；旧习磜o2005/019256實施例3中所述進行，具有以下修改：靶蛋白(c-met受體-fc,r&dsystems)以200nm的濃度使用，并且作為fc-融合蛋白呈遞于文庫，隨后使用蛋白g珠(dynal)捕獲噬菌體-靶標復合物。為了選擇非拮抗地作用于天然配體hgf的結(jié)合子(binder)，在c-met結(jié)合的文庫噬菌體于堿性條件下洗脫之前，引入了使用200nm可溶hgf(r&dsystems)的另外的洗滌步驟。進行了四輪選擇。實施例3：使用高通量elisa篩選的c-met受體特異性突變蛋白的鑒定根據(jù)實施例2選擇的突變蛋白的篩選基本上按wo2006/56464實施例3中的描述進行。對實驗方案的修改描述如下：表達載體為ptlpc10(圖2)。使用的靶蛋白為1μg/ml的c-met受體-fc(r&dsystems)，3％牛奶代替人血清白蛋白用作無關(guān)的對照靶標。按實施例2中的描述選擇的2880個克隆的篩選導致鑒定342個主要匹配克隆(hits)，表明從文庫中成功分離了突變蛋白。使用此方法鑒定了克隆s225.4-k24(seqidno：1)。s225.4-k24的序列還描繪于圖3。實施例4：使用易錯pcr的突變蛋白s225.4-k24的親和性成熟基于突變蛋白s225.4-k24(seqidno：1)的變體的文庫的產(chǎn)生基本上按照wo2006/56464實施例5中的描述進行，使用寡核苷酸t(yī)l50bio：tatctgaaggccatgacggtggac(seqidno：2)和tl51bio：tgcccacgagccacacccctggga(seqidno：3)，得到平均每個結(jié)構(gòu)基因具有5個置換的文庫。噬菌粒選擇按實施例2中的描述進行，但是采用限制的c-met受體-fc的靶標濃度(2nm、0.5nm和0.1nm)，并經(jīng)由固定在聚苯乙烯平板上的抗-人igg-fc特異性mab捕獲靶標和噬菌粒復合物。在相同的條件下但以組合的靶標限制(1nm)和短孵育時間(5分鐘)或靶標限制(5nm、0.5nm和0.1nm)與噬菌粒在ph3、60℃下孵育15分鐘或ph10、rt孵育30分鐘的組合進行另外的選擇。進行了四輪選擇。實施例5：使用高通量elisa篩選的c-met受體結(jié)合突變蛋白的親和性篩選按實施例3中的描述進行篩選，但進行以下修改：使用濃度為2.5μg/ml或0.6μg/ml的c-met受體-fc(r&dsystems)。總共篩選了2880個克隆，得到1510個匹配克隆，表明從文庫中成功地富集了成熟的突變蛋白。另外，在可選的篩選設(shè)置中，聚苯乙烯平板上包被了單克隆抗-t7抗體，并在與限制濃度的c-met受體-fc(60nm、15nm和2.5nm)孵育之前，經(jīng)由t7-標簽捕獲了表達的突變蛋白。使用針對人igg-fc結(jié)構(gòu)域的hrp-軛合的多克隆抗體檢測c-met受體-fc的結(jié)合。此類篩選的結(jié)果描繪于圖4。按實施例4和5中的描述選擇的大量突變蛋白被鑒定為與充當親和性成熟的基礎(chǔ)的突變蛋白s225.4-k24(seqidno：1)相比具有改善的對c-met受體的親和性。使用此方法，鑒定了突變蛋白s244.2-h08、s244.2-l01、s244.4-n05、s244.5-j05、s244.8-i20、s244.8-i07(seqidno：4-9)。s244.2-h08、s244.2-l01、s244.4-n05、s244.5-j05、s244.8-i20、s244.8-i07的序列也描繪于圖5。實施例6：c-met受體結(jié)合突變蛋白的生產(chǎn)對于c-met受體特異性突變蛋白的制備性生產(chǎn)，含有在表達載體ptlpc10上編碼的相應突變蛋白(圖2)的大腸桿菌k12菌株jm83在2l搖瓶培養(yǎng)中于lb-氨芐青霉素培養(yǎng)基中根據(jù)schlehuber,s.等人(jmol.biol.(2000),297,1105-1120)中描述的實驗方案培養(yǎng)。當需要更大量的蛋白時，使用含有相應表達載體的大腸桿菌菌株w3110，基于schiweck,w.和skerra,a,proteins(1995)23,561-565)中描述的實驗方案，進行經(jīng)由11或101容器中的臺式發(fā)酵罐培養(yǎng)的周質(zhì)產(chǎn)生。根據(jù)由skerra,a.&schmidt,t.g.m.(2000)(useofthestrep-tagandstreptavidinfordetectionandpurificationofrecombinantproteins(strep-標簽和鏈霉親和素用于檢測和純化重組蛋白的用途).methodsenzymol.326a,271-304)描述的程序，在單一步驟中經(jīng)由使用適當?shù)拇搀w積的柱的鏈霉親和素親和層析從周質(zhì)級分中純化突變蛋白。為了得到更高的純度并除去任何聚集的重組蛋白，最后在pbs緩沖液存在下在superdex75hr10/30柱(24-ml床體積,amershampharmaciabiotech)上進行突變蛋白的凝膠過濾。匯集單體蛋白級分，通過sds-page檢查純度并用于進一步的生化表征。實施例7：使用表面等離子體共振光譜(spr)的親和性測量親和性測量基本上按wo2006/56464實施例9中描述的進行，但有以下修改：將大約9000ru的c-met受體-fc(r&dsystems)直接固定在cm5芯片(而不是wo2006/56464中使用2000ru的人ctla-4或鼠ctla-4-fc作為靶標)的表面上，并注射80μl濃度為0.2-0.5μm的突變蛋白(而不是wo2006/56464中使用的40μl樣品純化的濃度為5-0.3μm的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白)。測量之間，通過注射5-10μl的50mmnaohph10、2.5mnacl再生芯片表面。流速保持恒定在10μl/min。采用s244.2-h08、s244.2-l01、s244.4-n05、s244.5-j05、s244.8-i20、s244.8-i07的親和性測量的結(jié)果概括于表i，s244.2-h08的示例性感應圖(sensorgram)的評估描繪于圖6。表i.通過spr確定的本發(fā)明的選擇的突變蛋白對c-met受體的親和性。平均值是從至少3次獨立測量結(jié)果計算的。實施例8：通過流式細胞術(shù)在完整的細胞上對脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白進行親和性評級在顯示hgfr/c-met內(nèi)源表達的ht-29細胞(atcc)上滴定脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。在30μl的總體積中從10μm濃度開始以24個1:2稀釋測試脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。對于每個結(jié)合反應，將100,000個細胞在含有2％胎牛血清(fcs)的pbs中在4℃下孵育2h。用pbs、2％fcs洗滌細胞兩次，并與每個反應375ng生物素化的、親和純化的山羊抗淚脂質(zhì)運載蛋白抗血清孵育30分鐘。洗滌后，檢測在與鏈霉親和素-藻紅蛋白孵育另外30分鐘后實現(xiàn)。洗滌細胞，并在facscalibur流式細胞儀上分析熒光。將平均熒光強度(mfi)針對脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的濃度作圖，并擬合為s形劑量響應曲線，使用graphpadprism軟件確定ec50值。從中確定s244.2-h08、s244.2-l01、s244.4-n05、s244.5-j05、s244.8-i20、s244.8-i07的ec50值的滴定曲線描繪于圖7，計算的ec50值概括于表ii?？寺c50[nm]stds244.2-h0813,21,3s244.2-l0116,81,7s244.4-n0518,218,2s244.8-i0744,85,9s244.8-i2028,14s244.8-j0537,85,5表ii.通過在ht-29細胞上的facs滴定確定的本發(fā)明的選擇的突變蛋白對c-met受體的ec50值和標準偏差。實施例9：脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白-cys變體的篩選為了提供用于與如活化的peg或藥學上相關(guān)的標記物位點定向偶聯(lián)的反應基團，通過位點定向誘變引入了未配對的半胱氨酸殘基。然后按實施例6中的描述在大腸桿菌中產(chǎn)生攜帶游離cys殘基的重組突變蛋白，確定表達產(chǎn)量，并基本按實施例7中描述的通過spr測量親和性。逐對采用以下寡核苷酸，分別引入替代氨基酸t(yī)hr40、asp95、arg90、lys121、asn123或val93的半胱氨酸：h08_t40c正向cgtctcggtaacacccatatgcctcacgaccctggaaggg(seqidno：10)和h08t40c反向cccttccagggtcgtgaggcatatgggtgttaccgagacg(seqidno：11)，或h08_d95c正向caggtcgcacgtgaagtgccactacatcttttactctgaggg(seqidno：12)和h08_d95c反向ccctcagagtaaaagatgtagtggcacttcacgtgcgacctg(seqidno：13)，或h08_r90c正向cgtggcatacatcagctgctcgcacgtgaaggatcac(seqidno：14)和h08_r90cgtgatccttcacgtgcgagcagctgatgtatgccacg(seqidno)：15，或a22_k121c正向ggcagagacccctgcaacaacctggaagccttg(seqidno：16)和a22_k121c反向caaggcttccaggttgttgcaggggtctctgcc(seqidno：17)，或a22_n123c正向ggcagagaccccaagaactgcctggaagccttggag(seqidno：18)和a22_n123c正向ggcagagaccccaagaactgcctggaagccttggag(seqidno：19)，或h08_v93c正向catcagcaggtcgcactgcaaggatcactacatcttttac(seqidno：20)和h08_v93c反向gtaaaagatgtagtgatccttgcagtgcgacctgctgatg(seqidno：21)。c-met受體-特異性突變蛋白s244.2-h08(seqidno：4)的cys-篩選的示例性結(jié)果在下面的表iii中給出?？寺‘a(chǎn)量[μg/l]親和性[nm]s244.2-h08_k121c318s244.2-h08_n123c5114s244.2-h08_d95c1511s244.2-h08_r90c5535s244.2-h08_t40c6340s244.2-h08_v93c3121s244.2-h082008表iii.突變蛋白s244.2-h08和包含以下氨基酸交換的其突變體對c-met受體的spr-親和性：thr40→cys(seqidno：22)、asn123→cys(seqidno：23)、asp95→cys(seqidno：24)、arg90→cys(seqidno：25)和lys121→cys(seqidno：26)。實施例10：使用位點定向隨機方法的突變蛋白s225.4-k24的親和性成熟基于突變蛋白s225.4-k24(seqidno：1)的變體的文庫通過殘基位置28、39、52、5、58、65和89的隨機化以允許所有20種氨基酸出現(xiàn)在這些位置上來設(shè)計。文庫基本按實施例1中的描述構(gòu)建，但有以下修改：三個隨機化的pcr片段是逐對采用以下脫氧核苷酸分別代替tl46、tl47、tl48和tl49產(chǎn)生的：k24_1：gccatgacggtggacacgcagnnsccgctgagcctctac(seqno.：27)(覆蓋位置28)和k24_2：cagggtcgtgagggtsnngggtgtcaccgagac(seqno.:28)(覆蓋位置39)、k24_3:gggggcaacctggaagccnnsgtcaccnnsaaccagnnsggccggtcccaggaggtg(seqno.：29)(覆蓋位置52、55和58)和k24_4:gtattttcccggctcatcagttttctccaggacggcsnncacctcctgggaccggcc(seqno.：30)(覆蓋位置65)、k24_5:gtgctcacgtggcatacatcnnsaggtcgcacgtgaaggac(seqno.：31)(覆蓋位置89)和tl51bio(seqno.：3)。噬菌粒展示和選擇采用噬菌?；旧习磳嵤├?中的描述進行，但有以下修改：靶蛋白是生物素化形式的無fc-部分的單體c-met受體(r&dsystems)，其允許經(jīng)由固定在聚苯乙烯平板上的中性鏈親和素(pierce)捕獲靶標：噬菌粒復合物。選擇使用以下進行：限制的靶標濃度(1.5nm和0.5nm和0.1nm生物素化的c-met受體)，或限制的靶標濃度(3μg/ml、1μg/ml和0.3μg/ml)與更短的孵育時間(10min)的組合，或使用高度過量的(10μm)從實施例5中描述的易錯成熟獲得的純化的c-met特異性突變蛋白s244.2-h08(seqnr.：4)的競爭方法。進行了三輪選擇。實施例11：使用高通量elisa篩選的c-met受體結(jié)合突變蛋白的親和性篩選篩選基本上按實施例5的描述以可選的篩選設(shè)置進行，并具有以下修改：i)在聚苯乙烯平板上包被單克隆抗-t7抗體，并在與限制濃度的單體c-met受體-生物素(50nm、10nm和2.5nm)孵育之前，經(jīng)由t7-標簽捕獲表達的突變蛋白。使用hrp(辣根過氧化物酶)-軛合的超級親和素(extravidin)檢測靶標的結(jié)合。ii)在中性鏈親和素平板上捕獲生物素化的c-met受體(1μg/ml)。在無限制的(60min)或限制的(5min)孵育時間之后，經(jīng)由hrp-軛合的抗-t7mab(novagen)檢測表達的c-met特異性突變蛋白的結(jié)合。iii)將含有c-met結(jié)合突變蛋白的提取物加熱至70℃1小時。iv)在中性鏈親和素平板上捕獲生物素化的c-met受體(r&dsystems，2.5μg/ml)。將突變蛋白提取物與作為靶標結(jié)合競爭物的來自實施例5的高度過量的(1μm)純化的c-met特異性突變蛋白s244.2-h08(seqno.：4)預孵育。經(jīng)由hrp-軛合的抗-t7mab(novagen)檢測表達的c-met特異性突變蛋白的結(jié)合。此類篩選的結(jié)果描繪于圖8。按實施例12和13的描述選擇的許多突變蛋白被鑒定為與充當親和性成熟的基礎(chǔ)的突變蛋白s225.4-k24(seqidno.：1)相比具有改善的對c-met受體的親和性。使用此方法，鑒定了突變蛋白s261.1-l12、s261.1-j01、s261.1-l17(seqidno:32-34)。s261.1-l12、s261.1-j01、s261.1-l17的序列還和s225.4-k24(seqno.：1)和從實施例5中描述的易錯成熟獲得的突變蛋白s244.2-h08(seqno.：4)的序列一起描繪于圖9。實施例12：加his-標簽形式的c-met受體結(jié)合突變蛋白的產(chǎn)生經(jīng)由0.75l生物反應器中的發(fā)酵罐培養(yǎng)的周質(zhì)產(chǎn)生基本上根據(jù)實施例6進行，但有以下修改：相應突變蛋白編碼于表達載體ptlpc47(圖10)而不是ptlpc10。ptlpc47的載體元件與ptlpc10的相同，但具有以下修改：ptlpc47編碼c-末端融合于六-his標簽的tlc突變蛋白，并除去了n-末端融合的t7-標簽。使用具有適當?shù)拇搀w積的柱和合適的設(shè)備根據(jù)生產(chǎn)商的建議，以單一步驟的ni-nta瓊脂糖(ge)層析方案從周質(zhì)級分中純化突變蛋白。為了得到更高的純度并除去任何聚集的重組蛋白，最后在pbs緩沖液存在下在superdex75hr10/30柱(24-ml床體積,amershampharmaciabiotech)上進行突變蛋白的凝膠過濾。匯集單體蛋白級分，通過sds-page檢查純度并用于進一步的生化表征。實施例13：使用表面等離子體共振光譜(spr)的親和性測量親和性測量基本上按實施例7的描述進行。采用s261.1-l12、s261.1-j01、s261.1-l17(seqidno：32-34)和從實施例4和5中描述的易錯成熟獲得的突變蛋白s244.2-h08(seqno.：4)的親和性測量的結(jié)果概括于表iv。表iv.通過spr確定的來自實施例10和11中描述的第二親和性成熟的選擇的突變蛋白與來自第一親和性成熟循環(huán)的突變蛋白s244.2-h08相比的親和性改善。實施例14：通過流式細胞術(shù)在完整的細胞上對脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白進行親和性評級基本上按實施例8中的描述在ht-29細胞(atcc)上滴定脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。從中確定s261.1-l12、s261.1-j01、s261.1-l17(seqidno:32-34)的ec50值的滴定曲線描繪于圖11，計算的ec50值概括于表v?？寺c50[nm]s261.1-l122,3s261.1-j018,5s261.1-l172,8表v.通過在ht-29細胞上的facs滴定確定的本發(fā)明的選擇的突變蛋白對c-met受體的ec50值。實施例15：使用hgf競爭elisa鑒定c-met受體特異性突變蛋白的非拮抗結(jié)合模式在競爭elisa中通過選擇的c-met特異性突變蛋白評估了hgf(肝細胞生長因子,r&dsystems)和c-met受體之間相互作用的模式。因此，經(jīng)由之前固定在聚苯乙烯平板的表面上的抗-人igg-fc特異性mab(jacksonimmunoresearch)捕獲了恒定濃度的2.5μg/mlc-met受體-fc(r&dsystems)。接下來，將靶標與兩步稀釋系列中從100nm開始的c-met-特異性突變蛋白的稀釋系列在室溫下孵育1小時，結(jié)合在存在或不存在300nmhgf作為競爭物下發(fā)生。使用多克隆生物素化的抗-脂質(zhì)運載蛋白1抗體(r&dsystems)檢測結(jié)合的c-met受體特異性突變蛋白，使用多克隆抗-hgf-生物素抗體(r&dsystems)檢測結(jié)合的hgf。在兩種情況下，均采用hrp-軛合的超級親和素(sigma)作為二級檢測試劑。采用突變蛋白s261.1-l7(seqno.:34)的測量的結(jié)果充當實例并描繪于圖12。從突變蛋白滴定曲線確定的kd值概括于表vi。表vi.通過競爭elisa確定的本發(fā)明的選擇的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白s261.1-l17對c-met受體的非拮抗能力和親和性。實施例16：通過使用cd光譜確定c-met結(jié)合突變蛋白的熱變性圓二色性測量基本上按國際專利申請wo2006/056464實施例14中的描述進行，但有以下修改：使用的波長為230nm，并且突變蛋白濃度為250μg/ml。淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白s261.1-l12、s261.1-j01、s261.1-l17(seqidno:32-34)和s244.2-h08(seqidno.：4)的熔化溫度tm概括于表vi。表vi.通過圓二色性測量確定的本發(fā)明的選擇的突變蛋白對c-met受體的熔化溫度。實施例17：在位置123處具有未配對的半胱氨酸的c-met-特異性突變蛋白s261.1-l12c123的生產(chǎn)c-met-特異性突變蛋白s261.1-l12_c123(seqno.：35)的制備性生產(chǎn)基本上按實施例6中的描述進行，但有以下修改：氨基酸asn123被改變?yōu)榘腚装彼嵋砸胛磁鋵Φ陌腚装彼嵊糜陔S后的位點定向軛合。半胱氨酸123是根據(jù)轉(zhuǎn)換實施例9中描述的半胱氨酸篩選的結(jié)果選擇的，與沒有未配對的半胱氨酸的原始突變蛋白s261.1-l12(seqno.：32)相比，其展現(xiàn)良好的表達產(chǎn)量和親和性。實施例18：hynic向c-met-特異性突變蛋白s261.1-l12c123的位點定向軛合來自實施例17的純化的突變蛋白s262.1-112_c123(seqnr.：35)以在pbs緩沖液ph7.4中的0.8mg/ml的濃度使用，并通過加入100mmtcep(sigma)至終濃度1mm活化未配對的半胱氨酸。在室溫下孵育2小時后，通過采用nap-5柱(ge)的凝膠過濾根據(jù)生產(chǎn)商的建議除去未反應的過量tcep。加入10倍摩爾過量的hynic(3-n-馬來酰亞胺-6-肼吡啶鹽酸鹽，購自solulink)并在室溫下孵育2h。為了除去軛合的突變蛋白中未反應的hynic，在ultracentricon(amicon)中濃縮反應混合物，并使用適當體積的pbs緩沖液洗滌至少5次。實施例19：通過流式細胞術(shù)在完整的細胞上對hynic-軛合的c-met-特異性突變蛋白s261.1-l12c123進行親和性測量基本上按實施例8中的描述在ht-29細胞(atcc)上滴定含和不含軛合的hynic的c-met-特異性突變蛋白s261.1-l12_c123(seqno.：35)。從中確定ec50值的滴定曲線描繪于圖13，計算的ec50值概括于表vii?？寺c50[nm]s261.1-l12_c1238,6s261.1-l12_c123_hynic8,3表vii.通過在ht-29細胞上的facs滴定確定的本發(fā)明的選擇的突變蛋白對c-met受體的ec50值和標準偏差。實施例20：c-met-特異性突變蛋白的ph穩(wěn)定性來自實施例12的純化的突變蛋白s261.1-j01在ph3至ph9.2的范圍中的不同ph下孵育60min。中和至ph7.4以后，經(jīng)由尺寸排阻層析通過采用分析型superdex75柱(ge)根據(jù)生產(chǎn)商的建議分析突變蛋白。如通過hplc-sec判斷的，未能在孵育時間段內(nèi)檢測到突變蛋白的變化，在突變蛋白的pi附近的范圍ph5-6除外，發(fā)生了一定程度的二聚化，如圖14所描繪的。實施例21：位置飽和誘變在親和性成熟的淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白l17、o24、m02、k22、a22、k15、l03、o07和k06的序列位置26、27和29處進行位點特異性誘變，以評估是否可顯著影響結(jié)合親和性。如圖15所示，所有生成的突變體顯示基本相同的親和性。實施例22：使用位點定向隨機方法的突變蛋白s261.1-l17的親和性成熟基于突變蛋白s261.1-l17(seqidno：34)的8x108個變體的文庫通過位置26、27、29、30、32、33、34和79的隨機化以允許所有20種氨基酸出現(xiàn)在這些位置上來設(shè)計。文庫基本上按國際專利申請pct/ep2007/057971、公布為wo2008/015239的實施例1中的描述構(gòu)建，但有以下修改：對于隨機化，使用脫氧核苷酸l12-1：gaaggccatgacggtggacnnknnkgacnnknnkagcnnknnknnktcggtgacacccatcacc(seqidno：50)；l12-2：cacgtgagcacctccgtamnncgtgtattttcccggctc(seqidno：51)；和l12-3：acggaggtgctcacgtggcatacatccagagg(seqidno：52)代替pct/ep2007/057971中公開的那些。噬菌粒展示和選擇采用噬菌粒基本上按國際專利公布wo2005/019256的實施例3中的描述進行，但有以下修改：靶蛋白(c-met受體fc,r&dsystems)以限制濃度(40pm和6pm和1pm)使用并作為fc-融合蛋白呈遞至文庫，隨后使用蛋白g珠(dynal)捕獲噬菌體-靶標復合物，或在將靶標-珠復合物呈遞至文庫噬菌粒之前，首先以限制濃度(50ng/ml和10ng/ml和1ng/ml)將靶標捕獲至蛋白g珠。在酸性條件并隨后在堿性條件下洗脫c-met結(jié)合的文庫噬菌體。進行三輪選擇。實施例23：使用高通量elisa篩選的c-met受體結(jié)合突變蛋白的親和性篩選篩選基本上按實施例5中的描述以可選的篩選設(shè)置進行，并具有以下修改：i)在聚苯乙烯平板上以5μg/ml的濃度包被單克隆抗-t7抗體，并在與限制濃度的c-met受體-fc(1nm、0.2nm和0.1nm)孵育之前，經(jīng)由t7-標簽捕獲表達的突變蛋白。使用hrp(辣根過氧化物酶)-軛合的山羊-抗人igg-fc特異性抗體檢測靶標的結(jié)合。ii)在與c-met受體-fc靶標形成復合物之前，將含有c-met結(jié)合突變蛋白的提取物加熱至70℃1小時。在此設(shè)置中，經(jīng)由以5μg/ml濃度固定在聚苯乙烯平板上的小鼠抗人igg-fc特異性單克隆抗體捕獲c-met受體-fc。按以上描述選擇的許多突變蛋白被鑒定為與充當親和性成熟的基礎(chǔ)的突變蛋白s261.1-l17(seqidno:34)相比具有改善的對c-met受體的親和性。使用此方法，鑒定了突變蛋白s318.1-c10、s318.1-n21、s318.1-l13、s318.1-a16、s318.2-i24、s318.4-m11、s318.1-g18和s318.1-o12(seqidno:42-49)。實施例24：通過流式細胞術(shù)在完整的細胞上對c-met-特異性突變蛋白進行親和性測量在表達并使用融合于相應突變蛋白的c-末端的strep-標簽的親和層析純化突變蛋白(參閱實施例6)之后，基本上按實施例8中的描述在ht-29細胞(atcc)上滴定c-met-特異性突變蛋白s318.1-c10、s318.1-l13、s318.1-a16、s318.2-i24和s318.1-o12(seqidno：42、44、45、46和49)，并將它們的結(jié)合親和性與在c-末端攜帶his6-標簽的突變蛋白s261.1-l17(seqidno：34)的親和性進行比較。從中確定ec50值的滴定曲線描繪于圖13，計算的ec50值概括于表viii。表viii.通過在ht-29細胞上的facs滴定確定的本發(fā)明的選擇的突變蛋白對c-met受體的ec50值和標準偏差。實施例25：通過使用cd光譜確定c-met結(jié)合突變蛋白的熱變性圓二色性測量基本上按國際專利申請wo2006/056464實施例14中的描述進行，但有以下修改：使用的波長為230nm，并且突變蛋白濃度為250μg/ml。淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白s318.1-c10(seqidno：42)和s318.1-o12(seqidno：49)的熔化溫度tm概括于表ix，并與它們所衍生自的突變蛋白s261.1-l17(seqidno：34)(配備有his6-標簽)的熔化溫度進行了比較。表ix.通過圓二色性測量確定的本發(fā)明的選擇的突變蛋白對c-met受體的熔化溫度。實施例24和25的結(jié)果顯示，突變蛋白s318.1-c10與充當其產(chǎn)生基礎(chǔ)的突變蛋白s261.1-l17具有大致相同的結(jié)合親和性，但同時突變蛋白s138.1-c10具有比突變蛋白s261.1-l17更高的穩(wěn)定性。本文例證性地描述的發(fā)明可在缺乏未在本文具體公開的任何一個或多個要素、一個或多個限制下適當?shù)貙嵤Ｒ虼?，應廣闊而不是限制性地理解例如，術(shù)語“包含”、“包括”、“含有”等。另外，本文采用的術(shù)語和表達用作描述性術(shù)語而不是限制性術(shù)語，并且此類術(shù)語和表達的使用不意欲排除所顯示和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是應認識到，可在所要求保護的發(fā)明的范圍內(nèi)進行多種修改。因此，應理解，雖然已通過優(yōu)選的實施方案和可選的特征具體地公開了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可借助本文公開的其中實施的發(fā)明的修改和變化，并且此類修改和變化視為在本發(fā)明范圍內(nèi)。本文廣泛地并且在屬別上描述了本發(fā)明。落入屬別公開內(nèi)容的更窄的物種和亞屬分組中的每一種也形成本發(fā)明的部分。這包括附帶條件或否定限制的對本發(fā)明的屬別描述，即，從該屬移除任何主題，而無論是否在本文具體地提及所移除的材料。此外，當以馬庫什組的方式描述本發(fā)明的特征或方面時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明還因此以馬庫什組的任何個體成員或成員的亞組的方式描述。本發(fā)明的進一步的實施方案將從下列權(quán)利要求中變得明顯。序列表<110>皮里斯股份公司<120>具有對人c-met受體酪氨酸激酶的親和性的淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白及其獲得方法<130>lc12310013p-d<160>52<170>patentin版本3.3<210>1<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s225.4-k24)<400>1alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrprometthrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualalys354045valthrmetasnglnileglyargserglngluvallysalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileileargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>2<211>24<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物tl50bio(5'組裝)<400>2tatctgaaggccatgacggtggac24<210>3<211>24<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物tl51bio(3'組裝)<400>3tgcccacgagccacacccctggga24<210>4<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s244.2-h08)<400>4alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyserleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileserargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>5<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的突變蛋白(s244.2-l01)<400>5alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnthrproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualaglu354045valthrleuasnglnvalglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileileargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>6<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的突變蛋白(s244.4-n05)<400>6alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspproglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrprometthrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualaglu354045valthrleuasnglnvalglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilethrargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>7<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的突變蛋白(s244.5-j05)<400>7alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrprometthrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualaglu354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglyargtyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilethrargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>8<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的突變蛋白(s244.8-i20)<400>8alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthralaleugluglyglyasnleuglualaglu354045valthrleuasnglnvalglyargserglngluvallysalavalleu505560glulysthraspgluproglyargtyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilethrargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly<210>9<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的突變蛋白(s244.8-i07)<400>9alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnvalproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualaglu354045valthrmetasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglyargtyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilethrargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>10<211>40<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物h08_t40c正向<400>10cgtctcggtaacacccatatgcctcacgaccctggaaggg<210>11<211>40<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物h08_t40c反向<400>11cccttccagggtcgtgaggcatatgggtgttaccgagacg<210>12<211>42<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物h08_d95c正向<400>12caggtcgcacgtgaagtgccactacatcttttactctgaggg<210>13<211>42<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物h08_d95c反向<400>13ccctcagagtaaaagatgtagtggcacttcacgtgcgacctg<210>14<211>37<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物h08_r90c正向<400>14cgtggcatacatcagctgctcgcacgtgaaggatcac<210>15<211>40<212>dna<213>人工<220>37<223>寡核苷酸引物h08_r90c反向<400>15gtgatccttcacgtgcgagcagctgatgtatgccacg<210>16<211>40<212>dna<213>人工<220>33<223>寡核苷酸引物a22_k121c正向<400>16ggcagagacccctgcaacaacctggaagccttg<210>17<211>33<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物a22_k121c反向<400>17caaggcttccaggttgttgcaggggtctctgcc<210>18<211>36<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物a22_n123c正向<400>18ggcagagaccccaagaactgcctggaagccttggag<210>19<211>36<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物a22_n123c反向<400>19ctccaaggcttccaggcagttcttggggtctctgcc<210>20<211>40<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物h08_v93c正向<400>20catcagcaggtcgcactgcaaggatcactacatcttttac<210>21<211>40<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物h08_v93c反向<400>21gtaaaagatgtagtgatccttgcagtgcgacctgctgatg<210>22<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s244.2-h08_c40)<400>22alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrproilecysleuthrthrleugluglyglyserleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileserargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>23<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s244.2-h08_c123)<400>23alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyserleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileserargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasncysleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>24<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s244.2-h08_c95)<400>24alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyserleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileserargserhisvallyscyshistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>25<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s244.2-h08_c90)<400>25alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyserleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilesercysserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>26<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s244.2-h08_c121)<400>26alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyserleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileserargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprocysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>27<211>39<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物k24_1<400>26gccatgacggtggacacgcagnnsccgctgagcctctac<210>28<211>33<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物k24_2<400>28cagggtcgtgagggtsnngggtgtcaccgagac<210>29<211>57<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物k24_3<400>29gggggcaacctggaagccnnsgtcaccnnsaaccagnnsggccggtcccaggaggtg<210>30<211>57<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物k24_4<400>30gtattttcccggctcatcagttttctccaggacggcsnncacctcctgggaccggcc<210>31<211>41<212>dna<213>人工<220><223>寡核苷酸引物k24_5<400>31gtgctcacgtggcatacatcnnsaggtcgcacgtgaaggac<210>32<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s261.1-l12)<400>32alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualamet354045valthrleuasnglnvalglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileglnargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>33<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s261.1-j01)<400>33alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530thrproleuthrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualamet354045valthrleuasnglnvalglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilethrargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>34<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s261.1-l17)<400>34alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530serproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilehisargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>35<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s261.1-l12_c123)<400>35alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualamet354045valthrleuasnglnvalglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileglnargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasncysleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>36<211>158<212>prt<213>人類<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白<400>36hishisleuleualaseraspglugluileglnaspvalserglythr151015trptyrleulysalametthrvalaspargglupheproglumetasn202530leugluservalthrprometthrleuthrthrleugluglyglyasn354045leuglualalysvalthrmetleuileserglyargcysglngluval505560lysalavalleuglulysthraspgluproglylystyrthralaasp65707580glyglylyshisvalalatyrileileargserhisvallysasphis859095tyrilephetyrcysgluglygluleuhisglylysprovalarggly100105110vallysleuvalglyargaspprolysasnasnleuglualaleuglu115120125asppheglulysalaalaglyalaargglyleuserthrgluserile130135140leuileproargglnsergluthrcysserproglyserasp145150155<210>37<211>158<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的突變蛋白(s244.2-l01，具有his6標簽)<400>37alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnthrproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualaglu354045valthrleuasnglnvalglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileileargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserproglyhishishishishishis145150155<210>38<211>158<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s244.2-h08，具有his6標簽)<400>38alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnmetproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyserleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalargalavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileserargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserproglyhishishishishishis145150155<210>39<211>158<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s261.1-l12，具有his6標簽)<400>39alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530thrproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualamet354045valthrleuasnglnvalglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrileglnargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserproglyhishishishishishis145150155<210>40<211>158<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s261.1-j01，具有his6標簽)<400>41alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530thrproleuthrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualamet354045valthrleuasnglnvalglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilethrargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserproglyhishishishishishis145150155<210>41<211>158<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s261.1-l17，具有his6標簽)<400>41alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530serproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthralatyrglyglyalahis65707580valalatyrilehisargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserproglyhishishishishishis145150155<210>42<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s318.1-c10)<400>42alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530serproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthrleutyrglyglyalahis65707580valalatyrileglnargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>43<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s318.1-n21)<400>43alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530serproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualathr354045valthrleuasnglnileglyargserglngluvalleualavalleu505560glulysthraspgluproglylystyrthrleutyrglyglyalahis65707580valthrtyrileglnargserhisvallysasphistyrilephetyr859095sergluglyaspthrtrpglyglyprovalproglyvaltrpleuval100105110glyargaspprolysasnasnleuglualaleugluasppheglulys115120125alaalaglyalaargglyleuserthrgluserileleuileproarg130135140glnsergluthrserserprogly145150<210>44<211>152<212>prt<213>人工<220><223>人淚脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白(s318.1-l13)<400>44alaseraspglugluileglnaspvalserglythrtrptyrleulys151015alametthrvalaspthrglnaspproleuserleutyrvalserval202530serproilethrleuthrthrleugluglyglyasnleuglualathr35404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