本發(fā)明涉及一種自組裝雙親短肽及其應(yīng)用，屬于基因工程及酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

自組裝雙親短肽是具有親水和親油能力的小分子肽，廣泛存在于膜蛋白及脂肪代謝相關(guān)酶類(lèi)的結(jié)構(gòu)中。其雙親的特點(diǎn)能夠幫助酶分子與疏水性底物結(jié)合、實(shí)現(xiàn)酶分子的定位等。

生物活性酶在工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用，酶的分離純化是工業(yè)酶的成本計(jì)算的重點(diǎn)考量結(jié)果之一。在所有酶的分離純化方法中，親和層析是相對(duì)簡(jiǎn)單和節(jié)約成本的方法，其中最常用的就是組氨酸標(biāo)簽親和層析方法。但當(dāng)酶蛋白分子的末端被包埋在分子內(nèi)部，組氨酸標(biāo)簽不能暴漏在酶分子表面，該方法就不能用于酶的純化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種替代組氨酸標(biāo)簽無(wú)法用于某些蛋白質(zhì)分離純化的雙親短肽，能夠在提高蛋白質(zhì)分離純化效率的同時(shí)，改善酶熱穩(wěn)定性等方面的特性。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種自組裝雙親短肽，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼所述自組裝雙親短肽的核苷酸序列。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述自組裝雙親短肽的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供融合所述自組裝雙親短肽的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供攜帶所述自組裝雙親短肽的載體或表達(dá)宿主。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種制備蛋白的方法，所述方法是在蛋白的n端或c端融合表達(dá)seqidno.1所示自組裝雙親短肽。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述蛋白為具有生物活性的酶。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述蛋白包括氧化酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、聚合酶、異構(gòu)酶、或連接酶。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述融合是用pt-linker進(jìn)行融合。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述pt-linker的氨基酸序列為ptppttptppttptpt。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法步驟如下：

(1)合成編碼seqidno.1所示自組裝雙親短肽的核苷酸序列，并將其克隆至表達(dá)載體上；

(2)將編碼目的蛋白的基因克隆至步驟(1)構(gòu)建的表達(dá)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體；

(3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主中。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)宿主包括e.colibl21、e.colibl21(de3)、e.colijm109、e.colidh5α、e.colitop10和rosetta(de3)中的任意一種。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法具體步驟包括：

(1)合成編碼seqidno.1所示自組裝雙親短肽的核苷酸序列，并將其克隆至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pet-22b(+)的ndei和ncoi酶切位點(diǎn)之間上，構(gòu)建pet-22b(+)/s1v1質(zhì)粒。

(2)將編碼目的蛋白的基因克隆至pet-22b(+)/s1v1質(zhì)粒的ncoi和hindiii位點(diǎn)之間，構(gòu)建成為表達(dá)融合自組裝雙親短肽的重組酶表達(dá)質(zhì)粒pet-22b(+)/s1v1-enzyme；

(3)將重組質(zhì)粒pet-22b(+)/s1v1-enzyme轉(zhuǎn)化至宿主中，構(gòu)建高效表達(dá)目的酶的誘導(dǎo)型大腸桿菌基因工程菌。

本發(fā)明還提供所述方法在食品、生物、醫(yī)藥、化工領(lǐng)域制備含蛋白質(zhì)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明中所提及的自組裝雙親短肽aeaeahahaeaeahah作為一種新型的蛋白質(zhì)純化標(biāo)簽，與目的蛋白融合后，進(jìn)行一步鎳柱親和層析即可將蛋白質(zhì)純化至電泳純，并可在不同程度上提高酶蛋白的分泌表達(dá)和熱穩(wěn)定性提高。本發(fā)明分別在堿性果膠酶、脂肪氧合酶和常用標(biāo)記蛋白綠色熒光蛋白的n端以pt-linker為連接肽連接aeaeahahaeaeahah自組裝雙親短肽，分別用鎳柱進(jìn)行純化，回收率分別達(dá)47.01％，39.01％和56.1％，并使堿性果膠酶胞外粗酶活由由原來(lái)的279.14±8.96u/mg提高到587.39±1.14u/mg，60℃下半衰期由原來(lái)的5.2提高到11.85min，脂肪氧合酶50℃下半衰期由原來(lái)的10min提高到38min，兼具提高表達(dá)量、提高蛋白熱穩(wěn)定性的效果。

附圖說(shuō)明

圖1為pgl-s1v1蛋白質(zhì)純化過(guò)程和sds-page電泳分析圖；a,蛋白純化峰圖；b，sds-page電泳圖；m，marker；1，2，均為pgl-s1v1；

圖2為pgl酶活衰減曲線(xiàn)，■，wild-type；▽?zhuān)琾gl-s1v1；

圖3為lox-s1v1蛋白質(zhì)純化過(guò)程和sds-page電泳分析圖，a，蛋白純化峰圖；b，sds-page電泳圖；m，marker；1，lox-s1v1胞內(nèi)可溶部分(5od菌液)；2，lox胞內(nèi)可溶部分(5od菌液)；3，4：lox-s1v1純酶液。

圖4為lox酶活衰減曲線(xiàn)，■，wild-type；▽?zhuān)琹ox-s1v1；

圖5為gfp-s1v1蛋白質(zhì)純化過(guò)程和sds-page電泳分析圖，m，marker，1，gfp-s1v1純酶液；2，gfp純酶液；3，gfp-s1v1胞內(nèi)可溶部分(5od菌液)；4，gfp胞內(nèi)可溶部分(5od菌液)；

圖6為不同溫度下熒光強(qiáng)度衰減曲線(xiàn)，■，wild-type；▽?zhuān)琯fp-s1v1。

具體實(shí)施方式

培養(yǎng)基組成：

種子培養(yǎng)基(g/l)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉5；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：將下列組分溶解在0.9l水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4ml。

各組分溶解后高壓滅菌；冷卻到60℃，再加100ml滅菌的含0.17mol/lkh2po4、0.72mol/lk2hpo4的溶液(2.31g的kh2po4和12.54gk2hpo4同時(shí)溶解在足量的水中，使終體積為100ml；0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌)；

培養(yǎng)方法：種子培養(yǎng)，挑取工程菌單菌落接入裝液量為25ml的三角瓶(250ml)中，培養(yǎng)溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)12h；發(fā)酵培養(yǎng)，按3％的接種量接入裝液量為25ml的三角瓶(250ml)中，培養(yǎng)溫度37℃，當(dāng)od600達(dá)到0.6時(shí)，加入iptg誘導(dǎo)，并同時(shí)調(diào)整溫度到該酶最適宜的誘導(dǎo)溫度下培養(yǎng)配置蛋白純化液體：

a液：20mm磷酸鹽緩沖液，500mmnacl，20mm咪唑。

b液：20mm磷酸鹽緩沖液，500mmnacl，500mm咪唑。

20mm的ph7.4的磷酸鹽緩沖液配制方法：190ml20mmnah2po4與810ml20mmna2hpo4均勻混合。

目的酶分離純化方法：采用鎳柱親和層析對(duì)三種酶蛋白進(jìn)行分離純化

堿性果膠酶酶活測(cè)定方法：?jiǎn)挝幻富疃x：?jiǎn)挝粫r(shí)間裂解聚半乳糖醛酸產(chǎn)生1μmol的不飽和聚半乳糖醛酸所用酶量。pgl反應(yīng)體系：含0.2％聚半乳糖醛酸(底物)的甘氨酸-naoh緩沖液(0.2mol·l^-1，0.44mmol·l^-1的cacl2，ph9.4)2ml，待測(cè)樣品20μl，無(wú)活性的酶液為空白對(duì)照。pgl反應(yīng)條件為：將反應(yīng)體系置于45℃下水浴15min，用3ml磷酸溶液(0.03mol·l^-1)終止反應(yīng)，用分光光度計(jì)在235nm處測(cè)定吸光度值。

堿性果膠酶熱穩(wěn)定性測(cè)定方法：將稀釋好的酶液分裝并置于60℃金屬浴中，每隔3min取樣進(jìn)行殘余酶活測(cè)定，計(jì)算半衰期。

脂肪氧合酶酶活測(cè)定方法：?jiǎn)挝幻富疃x：采用分光光度法測(cè)定lox酶活。1個(gè)單位lox酶活定義為：25℃下每分鐘催化底物亞油酸形成1μmol亞油酸氫過(guò)氧化物(hpod,ε＝25000l/(mol×cm))所需的酶量。酶活測(cè)定條件：以亞油酸為底物，在25℃下利用shimadzuuv-2450分光光度計(jì)在線(xiàn)測(cè)定234nm下吸光值的變化，以吸光值變化曲線(xiàn)初始部分的斜率計(jì)算酶活。

脂肪氧合酶熱穩(wěn)定性測(cè)定方法：將純化后的酶用buffera稀釋到蛋白濃度為100μg/ml并在50℃保溫，間隔測(cè)定殘余酶活，計(jì)算半衰期。

綠色熒光蛋白熒光強(qiáng)度測(cè)定方法：在避光條件下將酶液進(jìn)行一定的稀釋?zhuān)捎枚喙δ苊笜?biāo)儀((biotek,winooski,vt,usa)進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)，buffera作為空白對(duì)照。

綠色熒光蛋白熱穩(wěn)定性測(cè)定方法：在避光條件下將酶液進(jìn)行一定的稀釋?zhuān)謩e在70、75、80和85℃下保溫5min后測(cè)定熒光強(qiáng)度。在避光條件下將酶液進(jìn)行一定的稀釋?zhuān)?5℃下保溫，每隔5min測(cè)定熒光強(qiáng)度。

實(shí)施例1堿性果膠酶的分離純化及熱穩(wěn)定性測(cè)定

(1)合成編碼seqidno.1所示雙親短肽的核苷酸序列(如seqidno.2所示)，并將其克隆至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pet-22b(+)的ndei和ncoi酶切位點(diǎn)之間上，構(gòu)建pet-22b(+)/s1v1質(zhì)粒。

(2)將pgl基因(seqidno.4所示)克隆至pet-22b(+)/s1v1質(zhì)粒的ncoi和hindiii位點(diǎn)之間，構(gòu)建成為表達(dá)融合自組裝雙親短肽的重組酶表達(dá)質(zhì)粒pet-22b(+)/s1v1-pgl；

(3)將重組質(zhì)粒pet-22b(+)/s1v1-pgl轉(zhuǎn)化至宿主e.colibl21(de3)中，構(gòu)建高效表達(dá)目的酶的誘導(dǎo)型大腸桿菌基因工程菌e.colibl21(de3)pet-22b(+)/s1v1-pgl。

(4)將基因工程菌進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)，其中iptg誘導(dǎo)量為0.04mm，30℃培養(yǎng)48h。將發(fā)酵液離心，使菌體與發(fā)酵上清液分開(kāi)，收集發(fā)酵上清液。采用0.22um微孔濾膜過(guò)濾除去雜質(zhì)，將樣品注入安裝于akta純化儀的事先用a液平衡好的鎳柱(histrapff)中，上樣品10ml，繼續(xù)用a液體平衡，待穿透峰被洗平后用b液進(jìn)行0～100％的線(xiàn)性洗脫，收集出峰蛋白。

sds-page電泳分析進(jìn)行純度驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證。pgl-s1v1蛋白質(zhì)純化過(guò)程峰圖和sds-page如圖1所示，收率如表1所示，電泳純胞外pgl-s1v1回收率可達(dá)到47.01％。以n端加his標(biāo)簽的野生型pgl為對(duì)照，結(jié)果顯示，野生型pgl不能用親和層析進(jìn)行蛋白純化(野生型堿性果膠酶標(biāo)簽被包埋在蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部)。此外，胞外酶活由原來(lái)的279.14±8.96u/mg提高到587.39±1.14u/mg。分泌量明顯提高，如圖1所示；測(cè)序結(jié)果顯示，pgl-s1v1的氨基酸序列如seqidno.5所示。

表1pgl-s1v1蛋白質(zhì)純化過(guò)程得率計(jì)算

將純化后的堿性果膠酶稀釋?zhuān)凑丈鲜龇椒y(cè)定酶活，用bsa蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。結(jié)果顯示，本發(fā)明構(gòu)建的堿性果膠酶突變體pgl-s1v1熱穩(wěn)定性提高顯著，60℃下半衰期由原來(lái)的5.2min提高到11.85min(圖2)。

實(shí)施例2脂肪氧和酶分離純化及熱穩(wěn)定性測(cè)定

(1)合成編碼seqidno.1所示雙親短肽的核苷酸序列，并將其克隆至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pet-22b(+)的ndei和ncoi酶切位點(diǎn)之間上，構(gòu)建pet-22b(+)/s1v1質(zhì)粒。

(2)將lox基因(seqidno.6所示)克隆至pet-22b(+)/s1v1質(zhì)粒的ncoi和hindiii位點(diǎn)之間，構(gòu)建成為表達(dá)融合自組裝雙親短肽的重組酶表達(dá)質(zhì)粒pet-22b(+)/s1v1-lox；

(3)將重組質(zhì)粒pet-22b(+)/s1v1-lox轉(zhuǎn)化至宿主e.colibl21(de3)中，構(gòu)建高效表達(dá)目的酶的誘導(dǎo)型大腸桿菌基因工程菌rosetta(de3)pet-22b(+)/s1v1-lox。

(4)將基因工程菌進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)，其中iptg誘導(dǎo)量為1mm，20℃培養(yǎng)24h。

將發(fā)酵液離心，使菌體與發(fā)酵上清液分開(kāi)，清洗菌體兩遍。使用高壓勻漿儀破碎細(xì)胞，離心取胞內(nèi)上清，0.22um微孔濾膜過(guò)濾除去雜質(zhì)，將樣品注入安裝于akta純化儀的事先用a液平衡好的鎳柱(histrapspff)中，上樣品10ml，繼續(xù)用a液體平衡，待穿透峰被洗平后用b液進(jìn)行0～100％的線(xiàn)性洗脫，收集出峰蛋白。sds-page電泳分析進(jìn)行純度驗(yàn)證，并對(duì)獲得蛋白進(jìn)行測(cè)序。結(jié)合圖3和表2分析可知，電泳純的條件下，lox-s1v1的蛋白質(zhì)純化收率可達(dá)到39％，測(cè)序結(jié)果顯示，lox-s1v1氨基酸序列如seqidno.6所示，而野生型lox蛋白在進(jìn)行鎳柱純化前若不進(jìn)行硫銨沉淀，純化效果不明顯，甚至不能被鎳柱純化。

表2lox-s1v1蛋白質(zhì)純化過(guò)程得率計(jì)算

將純化后的堿性果膠酶稀釋?zhuān)凑丈鲜龇椒y(cè)定酶活，用bsa蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。結(jié)果顯示，本發(fā)明構(gòu)建的堿性果膠酶突變體lox-s1v1熱穩(wěn)定性提高顯著，50℃下半衰期由原來(lái)的10min提高到38min(圖4)。

實(shí)施例3綠色熒光蛋白的分離純化及熱穩(wěn)定性測(cè)定

(1)合成編碼seqidno.1所示雙親短肽的核苷酸序列，并將其克隆至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pet-22b(+)的ndei和ncoi酶切位點(diǎn)之間上，構(gòu)建pet-22b(+)/s1v1質(zhì)粒。

(2)將gfp基因(seqidno.8所示)克隆至pet-22b(+)/s1v1質(zhì)粒的ncoi和hindiii位點(diǎn)之間，構(gòu)建成為表達(dá)融合雙親短肽的重組酶表達(dá)質(zhì)粒pet-22b(+)/s1v1-gfp；

(3)將重組質(zhì)粒pet-22b(+)/s1v1-gfp轉(zhuǎn)化至宿主e.colibl21(de3)中，構(gòu)建高效表達(dá)目的酶的誘導(dǎo)型大腸桿菌基因工程菌e.colibl21(de3)pet-22b(+)/s1v1-gfp。

(4)將基因工程菌進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)，其中iptg誘導(dǎo)量為0.05mm，20℃培養(yǎng)24h。

將發(fā)酵液離心，使菌體與發(fā)酵上清液分開(kāi)，清洗菌體兩遍。使用高壓勻漿儀破碎細(xì)胞，離心取胞內(nèi)上清，0.22um微孔濾膜過(guò)濾除去雜質(zhì)，將樣品注入安裝于akta純化儀的事先用a液平衡好的鎳柱(histrapspff)中，上樣品10ml，繼續(xù)用a液體平衡，待穿透峰被洗平后用b液進(jìn)行0～100％的線(xiàn)性洗脫，收集出峰蛋白。sds-page電泳分析進(jìn)行純度驗(yàn)證，并對(duì)收集的蛋白進(jìn)行測(cè)序。如圖5和表3，4所示，電泳純回收率達(dá)到56％。由于s1v1可以提高酶蛋白的表達(dá)量，由于不經(jīng)過(guò)硫銨沉淀濃縮gfp蛋白，其收率僅有7.25％，測(cè)序結(jié)果顯示，gfp-s1v1氨基酸序列如seqidno.9所示。

表3gfp-s1v1蛋白質(zhì)純化過(guò)程得率計(jì)算

表4gfp蛋白質(zhì)純化過(guò)程得率計(jì)算

將純化后的堿性果膠酶稀釋?zhuān)凑丈鲜龇椒y(cè)定酶活，用bsa蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。結(jié)果顯示，本發(fā)明構(gòu)建的堿性果膠酶突變體gfp-s1v1熱穩(wěn)定性有所提高，在70～90℃下分別保溫5min后測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度衰減曲線(xiàn)如下圖6所示。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>江南大學(xué)

<120>一種自組裝雙親短肽及其應(yīng)用

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

alaglualaglualahisalahisalaglualaglualahisalahis

151015

<210>2

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gcggaggcggaagctcacgctcatgcggaggcggaagctcacgctcat48

<210>3

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<400>3

prothrproprothrthrprothrproprothrthrprothrprothr

151015

<210>4

<211>1206

<212>dna

<213>人工序列

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atggatgctgatttaggccaccagacgttgggatccaatgatggctggggcgcgtactcg60

accggcacgacaggcgggtcaaaagcatcgtccttaaatgtgtataccgtcagcaacaga120

aaccagcttgtctcggcattagggaaggaaacgaacacaacgccaaaaatcatttatatc180

aagggaacgattgacatgaacgtagatgacaatctgaagccgcttggtctaaatgactat240

aaagatccggagtatgatttggacaaatatttgaaagcctatgatcctagcacatggggc300

aaaaaagagccgtcgggaacacaagaagaagcgagagcacgctctcagaaaaaccaaaaa360

gcacgggttatggtggatatccctgcaaacacgacgatcgtcggttcagggactaacgct420

aaagtcgtgggaggaaacttccaaatcaagagtgataacgtcattattcgcaacattgaa480

ttccaggatgcctatgattattttccgcaatgggatccgactgacggaagctcaggaaac540

tggaactcacaatacgacaacatcacgataaacggcggcacacacatctggattgatcac600

tgtacatttaacgacggttcgcgtccggacagcacatcaccgaaatattatggaagaaaa660

tatcagcaccatgacggccaaacggatgcgtccaacggcgctaactatatcacgatgtcc720

tacaactattatcacgatcatgataaaagctccattttcggatcaagtgacagcaaaacc780

tccgatgacggcaaattaaaaattacgctccatcataaccgctataaaaatattgtccag840

cgcgcgccgagagtccgcttcgggcaagtgcacgtatacaacaactattatgaaggaagc900

acaagctcttcaagttatcctttcagctatgcatggggaatcggaaagtcatctaaaatc960

tatgcccaaaacaatgtcattgacgtaccgggactgtcagctgctaaaacgatcagcgta1020

ttcagcgggggaacggctttatatgactccggcacgttgctgaacggcacacagatcaac1080

gcatcggctgcaaacgggctgagctcttctgtcggctggacgccgtctctgcatggatcg1140

attgatgcttctgctaatgtgaaatcaaatgtcataaatcaagcgggtgcgggtaaatta1200

aattaa1206

<210>5

<211>439

<212>prt

<213>人工序列

<400>5

metalaglualaglualahisalahisalaglualaglualahisala

151015

histrpileserprothrproprothrthrprothrproprothrthr

202530

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354045

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65707580

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859095

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115120125

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165170175

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180185190

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195200205

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210215220

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225230235240

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245250255

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260265270

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275280285

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290295300

lysilethrleuhishisasnargtyrlysasnilevalglnargala

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proargvalargpheglyglnvalhisvaltyrasnasntyrtyrglu

325330335

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340345350

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glyleuseralaalalysthrileservalpheserglyglythrala

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alaalaasnglyleuserserservalglytrpthrproserleuhis

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alaglyalaglylysleuasn

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glusergluseraspleutyrtrpglytrpglnmetalalysthrval

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leutyrlys

275