專利名稱：一對短肽、蛋白質(zhì)和多核苷酸、其宿主細(xì)胞及其應(yīng)用的制作方法
—對短肽、蛋白質(zhì)和多核苷酸、其宿主細(xì)胞及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本專利涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說涉及一種可以對人IL2RG基因高效打靶的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)的合成及打靶方法。
背景技術(shù)：
IL2RG，又稱白細(xì)胞介素_2受體亞基Y，是一種細(xì)胞因子受體的亞基，是至少6種白細(xì)胞介素受體復(fù)合物(IL-2，IL-4，IL-7，IL-9，IL-15和IL-21)的組成部分。IL2RG基因一般定位在哺乳動物的X染色體上。
IL2RG基因突變會引起X-連鎖嚴(yán)重的組合免疫缺陷病(X-SCID)。200多種不同IL2RG基因突變已確定存在于人X-連鎖嚴(yán)重組合免疫缺陷病(X-SCID)患者基因組中，這些突變大多涉及一個或幾個DNA堿基的變化。IL2RG基因突變后，導(dǎo)致相關(guān)的白細(xì)胞介素受體失去功能，重要的信號分子無法傳遞，淋巴細(xì)胞不能正常發(fā)育，缺乏功能成熟的淋巴細(xì)胞，人的免疫能力將徹底喪失。IL-7和IL-15突變后，T細(xì)胞和NK細(xì)胞群也將無法正常發(fā)育成熟?；颊呷绻麤]有進(jìn)行骨髓移植或病原體隔離將在出生數(shù)月內(nèi)死亡。對患者的細(xì)胞進(jìn)行定向的基因組靶向修飾，然后導(dǎo)入患者體內(nèi)可以治療該疾病。
但人們一直沒有找到簡單高效的方法對基因組進(jìn)行靶向修飾，傳統(tǒng)的基因打靶依賴于細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體隨機交換的基因打靶技術(shù)，效率非常低，通常只有10_6-10_8，這種打靶方法只在小鼠中得到了廣泛應(yīng)用。而在其他模式動物及大型哺乳動物中都因效率太低而得不到應(yīng)用。
近年發(fā)展很快的序列特異的核酸酶可以用于精確的基因組靶向修飾。一般序列特異的核酸酶由一個DNA識別結(jié)構(gòu)域和一個非特異性核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。原理是首先由DNA識別結(jié)構(gòu)域把核酸酶定位到需要編輯的基因組區(qū)域，然后非特異性核酸內(nèi)切酶切斷雙鏈DNA從而造成DNA雙鏈斷裂(double-strand break, DSB)，引入的DSB激活的DNA自我修復(fù)可以引起基因的突變和促進(jìn)該位點DNA的同源重組。鋅指核酸酶(Zinc-fingernucleases, ZFN)是現(xiàn)在研究最清楚也是應(yīng)用最廣泛的序列特異性核酸酶。其原理是兩個鋅指蛋白特異識別兩段相隔5-7bp的DNA序列并把與之融合表達(dá)的非特異性DNA切割蛋白Fokl的兩個亞基定位到一起，DNA切割蛋白形成雙聚體時可以切斷該位置的雙鏈DNA，從而造成DSB。ZFN的出現(xiàn)使得基因組靶向修飾向前邁進(jìn)了一大步。然而ZFN技術(shù)還存在靶向不確定性，效率低，脫靶率高等問題，研究者自行設(shè)計出特異和高效的靶向基因組目的序列的鋅指核酸酶仍然是制約ZFN廣泛應(yīng)用的瓶頸。
2009 年兩個研究組發(fā)現(xiàn)植物病原體Xanthomonas中的一種可以調(diào)節(jié)植物基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(transcription activator-like effector, TALE)表現(xiàn)出DNA結(jié)合特異性，而其識別密碼具有模塊化和簡單化的特點，為科學(xué)家們開發(fā)出更簡易的新型基因組靶向技術(shù)帶來了新希望。
TALE與Fokl融合后即形成轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸(transcriptionactivator-like effector nucleases, TALEN)。TALEN 的打革E原理與 ZFN 相同，只是識別特異的DNA的蛋白質(zhì)不同。TALEs由數(shù)十個特異性識別DNA的串聯(lián)“蛋白模塊”和兩側(cè)的N-末端及C-末端序列組成。每個“蛋白模塊”包含34個氨基酸，第12和13位殘基是靶向識別的關(guān)鍵位點，被稱為重復(fù)可變的d1-residUes(RVDs)位點。然而不同于每個鋅指蛋白識別特異性的三聯(lián)體堿基，TALEs上的每個RVDs僅能識別一個堿基。
Sangamo BioSciences公司和哈佛大學(xué)的兩個研究小組分別利用TALEs技術(shù)進(jìn)行了基因組靶向修飾相關(guān)研究，兩篇論文發(fā)表在同一期的《自然生物技術(shù)》(NaturalBiotechnology)雜志上。
Edward Rebar領(lǐng)導(dǎo)的研究小組將帶有不同C-末端TALE的截短片段連接到核酸酶Fokl的催化結(jié)構(gòu)域上，當(dāng)研究人員將構(gòu)建的TALENs靶向內(nèi)源性的人類NTF3和CCR5基因時，證實TALENs能夠特異性地對這些基因片段進(jìn)行剪切。哈佛大學(xué)研究小組開發(fā)了一種基于分層連接的策略來構(gòu)建12個重復(fù)模塊的TALEs。他們在保留RVDs的基礎(chǔ)上減少了每個模塊的DNA序列，同時將剩余序列的重復(fù)性降到最低。進(jìn)而通過12重PCR研究人員獲得了帶有特異性連接序列的單體，并將其克隆到包含TALE N-末端和C-末端序列的骨架載體中。為了構(gòu)建TALE轉(zhuǎn)錄因子，研究人員又將TALE融合到一個轉(zhuǎn)錄因子的激活域。在接下來的靶向性檢測中，研究人員證實其能特異地使四個檢測內(nèi)源基因中的兩個基因表達(dá)上調(diào)。
今年七月MIT的Rudolf Jaenisch小組也驗證了 TALEN在人胚胎干細(xì)胞和人IPSC中的打靶效果。其通過在五個位點的TALENs與之前其在相同位置的ZFNs的打靶效果作對t匕，得出五組TALENs在打靶效率和精確度上都與從Sangamo BioSciences公司購買的ZFNs相似，進(jìn)一步驗證了 TALENs是非常好的基因組編輯工具。
但是，目前尚無對人IL2RG基因進(jìn)行打靶的報道，因此本領(lǐng)域迫切需要開展對人IL2RG基因進(jìn)行高效打靶的研究。發(fā)明內(nèi)容
本專利的目的之一是提供一種可以對人IL2RG基因高效打靶的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)的基因序列、融合蛋白及其重組質(zhì)粒載體和宿主細(xì)胞等。
本發(fā)明的第一方面提供一對短肽，所述一對短肽序列為SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2。
本發(fā)明第二方面，提供一對多核苷酸，所述一對多核苷酸分別編碼上述一對短肽。
上述一對多核苷酸分別為SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。
本發(fā)明的第三方面，提供一對蛋白質(zhì)，所述一對蛋白質(zhì)能特異性地識別二段核苷酸序列，所述二段核苷酸序列分別選自下述二個核苷酸序列:
(I)SEQ ID N0:10或SEQ ID NO: 10序列的一個或二個核苷酸經(jīng)過取代所衍生的核苷酸序列；
(2) SEQ ID N0:13或SEQ ID NO: 13序列的一個或二個核苷酸經(jīng)過取代所衍生的核苷酸序列。
上述一對蛋白質(zhì)為上述的一對短肽二端分別加上轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架的N端和C端。
上述轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架的N端和C端為人工改造的序列或天然的序列。
上述一對蛋白質(zhì)序列分別為SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
本發(fā)明第四方面，提供一對多核苷酸，所述一對多核苷酸分別編碼上述一對蛋白質(zhì)。
上述一對多核苷酸序列為SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41。
本發(fā)明第五方面，提供一對融合蛋白，所述一對融合蛋白為上述一對蛋白質(zhì)分別與DNA切割蛋白融合而成。
上述DNA切割蛋白為DNA內(nèi)切酶。
上述一對融合蛋白為上述一對蛋白質(zhì)分別與DNA切割蛋白的二個亞基融合而成。
上述DNA切割蛋白為天然的或經(jīng)過人工改造的FoklDNA內(nèi)切酶。
上述一對融合蛋白序列為SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。
本發(fā)明的第六方面，提供一對多核苷酸，所述一對多核苷酸分別編碼上述的一對融合蛋白。
上述一對多核苷酸序列分別SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47。
本發(fā)明的第七方面，提供一種含有上述一對多核苷酸中的任意一條多核苷酸的載體。
本發(fā)明第八方面，提供一種上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
上述宿主細(xì)胞為人離體細(xì)胞。在具體實施例中，上述宿主細(xì)胞為293T細(xì)胞。
本發(fā)明的第九方面，提供一種含有上述一對多核苷酸中的任意一對多核苷酸的載體。
本發(fā)明的第十方面，提供一種用上述含有一對多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
上述宿主細(xì)胞為人離體細(xì)胞。在具體實施例中，上述宿主細(xì)胞為293T細(xì)胞。
本發(fā)明的第十一方面，提供上述一對融合蛋白在制備治療人IL2RG基因突變所致的疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述一對融合蛋白序列為SEQ ID N0:48和SEQ ID NO:49。
本發(fā)明的第十二方面，提供上述編碼融合蛋白的一對多核苷酸在制備治療人IL2RG基因突變所致的疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述一對多核苷酸序列為SEQ ID NO:46 和 SEQ ID NO -Al0
本發(fā)明的第十三方面，提供一種人IL2RG基因打靶方法，所述基因打靶方法包括以下步驟:
I)將表達(dá)上述一對融合蛋白的任意一對多核苷酸或該對多核苷酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人離體細(xì)胞；
2)人離體細(xì)胞在37°C下，培養(yǎng)3-7天，經(jīng)PCR測序鑒定，靶位點發(fā)生突變的細(xì)胞即打靶細(xì)胞。
本發(fā)明的第十四方面，提供一種人IL2RG基因打靶方法，所述基因打靶方法包括以下步驟:
1)將表達(dá)上述一對融合蛋白的任意一對多核苷酸或含有該對多核苷酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人離體細(xì)胞；
2)人離體細(xì)胞培養(yǎng)3-7天，其中至少一天在30°C下培養(yǎng)，其余時間為37°C培養(yǎng)，經(jīng)PCR測序鑒定，靶位點發(fā)生突變的細(xì)胞即打靶細(xì)胞。
本發(fā)明的第十五方面，提供一種人IL2RG基因打靶方法，所述基因打靶方法包括以下步驟:
I)將表達(dá)上述一對融合蛋白的任意一對多核苷酸或含有該對多核苷酸的質(zhì)粒與抗puro的多核苷酸或其質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入人離體細(xì)胞；
2)37°C下，puro培養(yǎng)基篩選出表達(dá)抗puro蛋白的人離體細(xì)胞；
3) 37°C下，人離體細(xì)胞培養(yǎng)3-7天，經(jīng)PCR測序鑒定，靶位點發(fā)生突變的細(xì)胞即打靶細(xì)胞。
本發(fā)明的第十六方面，提供一種人IL2RG基因打靶方法，所述基因打靶方法包括以下步驟:
I)將表達(dá)上述一對融合蛋白的任意一對多核苷酸或含有該對多核苷酸的質(zhì)粒與抗puro的多核苷酸或其質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入人離體細(xì)胞；
2)37°C下，puro培養(yǎng)基篩選出表達(dá)抗puro蛋白的人離體細(xì)胞；
3)人離體細(xì)胞培養(yǎng)3-7天，其中至少一天在30°C下培養(yǎng)，其余時間為37°C培養(yǎng)，經(jīng)PCR測序鑒定，靶位點發(fā)生突變的細(xì)胞即打靶細(xì)胞。
優(yōu)選的，上述四個基因打靶方法中，所述一對融合蛋白序列為SEQ ID N0:48和SEQID NO:49o
優(yōu)選的，上述四個基因打靶方法中，所述一對多核苷酸序列為SEQ ID Ν0:46和SEQID NO:47ο
上述基因打靶方法中的篩選鑒定為，利用puro篩選出成功轉(zhuǎn)入目標(biāo)多核苷酸或目標(biāo)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，非轉(zhuǎn)染細(xì)胞不能存活。PCR測序鑒定，IL2RG基因發(fā)生突變的細(xì)胞即為打靶細(xì)胞。
為實現(xiàn)上述目的，本研究經(jīng)大量實驗，獲得一對轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶:IL2RG-TALEN-L和IL2RG-TALEN-R，由兩個可以分別識別人IL2RG基因exon2上相鄰的二段核苷酸的DNA識別結(jié)構(gòu)域分別與一個經(jīng)人工改造的核酸內(nèi)切酶Fokl的兩個異源亞基融合得到的融合蛋白。
根據(jù)本專利，所述的一對轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶為IL2RG-TALEN-L和IL2RG-TALEN-R，其核苷酸分別具有SEQ ID NO:46和SEQ ID N0:47所示的序列。
根據(jù)本專利，所述的一對轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶為IL2RG-TALEN-L和 IL2RG-TALEN-R,分別識別人 IL2RG 基因 exon2 上的 5’ tcagtgttttgtgtt 3，和5’ gctgttccaagtgcaat 3’ 序列。


圖1:人工設(shè)計的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)識別的DNA序列及位點
圖2:18個識別模塊連接策略示意圖
A =PCR為每個識別模塊添加酶切識別序列及連接結(jié)頭過程示意圖
B.PCR為每個識別模塊添加酶切識別序列及連接結(jié)頭之后示意圖
C.PCR擴增6重復(fù)模塊與中間載體示意圖
D.最終構(gòu)建的TALEN示意圖
圖3:中間載體 pCMV-NLS-TALE backbo ne-Fokl (R) -1ntermediate 的不意圖
圖4:最終載體 pEFla-NLS-TALE backbone-Fokl (R) -pA 的示意圖
圖 5:載體 pEFl-NLS-TALE backbone-Fokl (L) -1RES-PURO-pA 的示意圖
圖 6:最終的 TALEN 質(zhì)粒 pEFla-NLS-TALE backbone N terminal-1L2RG_TALEN-Ll-TALE backbone C terminal-Fokl (L)-1RES-PURO-pA 的不意圖
圖7:T7Endonuclease I酶切變性雜交處理的打靶位點DNA PCR片段的電泳圖
圖8:IL2RG基因在打靶位點的基因型變化，-表示堿基缺失，小寫字母cgag表示喊基插入具體實施方式
實施例1TALENs樽塊序列的設(shè)計
1.NCBI下載人IL2RG的基因組序列(編號NC_000023.10)，選擇exon2為打靶目標(biāo)。
2.設(shè)計引物并PCR擴增基因組上打靶位點片段，并測序。
PCR引物及測序引物設(shè)計如表I
權(quán)利要求
1.一對短肽，其特征在于，所述一對短肽序列為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
2.—對多核苷酸,其特征在于,所述一對多核苷酸分別編碼如權(quán)利要求1所述的一對短肽。
3.如權(quán)利要求2所述的一對多核苷酸，其特征在于，所述一對多核苷酸為SEQID NO:44 和 SEQ ID NO:45。
4.一對蛋白質(zhì)，其特征在于，所述一對蛋白質(zhì)能特異性地識別二段核苷酸序列，所述二段核苷酸序列分別選自下述二個核苷酸序列: (1)SEQID N0:10或SEQ ID NO: 10序列的一個或二個核苷酸經(jīng)過取代所衍生的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO:13或SEQ ID NO: 13序列的一個或二個核苷酸經(jīng)過取代所衍生的核苷酸序列。
5.一對蛋白質(zhì)，其特征在于，所述一對蛋白質(zhì)為權(quán)利要求1所述的一對短肽二端分別加上轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架的N端和C端。
6.如權(quán)利要求5所述的一對蛋白質(zhì)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架的N端和C端為人工改造的序列或天然的序列。
7.如權(quán)利要求5或6所述的一對蛋白質(zhì)，其特征在于，所述一對蛋白質(zhì)序列分別為SEQID NO:3 和 SEQ ID NO:4。
8.—對多核苷酸,其特征在于，所述一對多核苷酸分別編碼如權(quán)利要求5或6所述的一對蛋白質(zhì)。
9.一對多核苷酸,其特征在于,所述一對多核苷酸分別編碼如權(quán)利要求7所述的一對蛋白質(zhì)。
10.如權(quán)利要求9所述一對多核苷酸,其特征在于,所述一對多核苷酸序列為SEQIDNO:40 和 SEQ ID NO:41。
11.一對融合蛋白，其特征在于，所述一對融合蛋白為權(quán)利要求5或6所述一對蛋白質(zhì)分別與DNA切割蛋白融合而成。
12.如權(quán)利要求11所述一對融合蛋白，其特征在于，所述DNA切割蛋白為DNA內(nèi)切酶。
13.如權(quán)利要求11所述一對融合蛋白，其特征在于，所述一對融合蛋白為權(quán)利要求5或6所述一對蛋白質(zhì)分別與DNA切割蛋白的二個亞基融合而成。
14.如權(quán)利要求13所述一對融合蛋白，其特征在于，所述DNA切割蛋白為天然的或經(jīng)過人工改造的FoklDNA內(nèi)切酶。
15.如權(quán)利要求11-14任一權(quán)利要求所述一對融合蛋白，其特征在于,所述一對融合蛋白序列為 SEQ ID NO:48 和 SEQ ID NO:49。
16.—對多核苷酸,其特征在于,所述一對多核苷酸分別編碼如權(quán)利要求12-14任一權(quán)利要求所述的一對融合蛋白。
17.—對多核苷酸,其特征在于,所述一對多核苷酸分別編碼如權(quán)利要求15所述的一對融合蛋白。
18.如權(quán)利要求17所述一對多核苷酸,其特征在于,所述一對多核苷酸序列為SEQIDNO:46 或 SEQ ID NO:47。
19.一種含有權(quán)利要求2_3、8_10、16-18任一權(quán)利要求所述一對多核苷酸中的任意一條多核苷酸的載體。
20.一種用權(quán)利要求19所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求20所述宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為人離體細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求20所述宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為293T細(xì)胞。
23.—種含有權(quán)利要求2-3、8_10、17或18任一權(quán)利要求所述一對多核苷酸中的任意一對多核苷酸的載體。
24.一種用權(quán)利要求23所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求24所述宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為人離體細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求24所述宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為293T細(xì)胞。
27.一種如權(quán)利要求15所述一對融合蛋白在制備治療人IL2RG基因突變所致的疾病的藥物中的應(yīng)用。
28.一種權(quán)利要求18所述一對多核苷酸在制備治療人IL2RG基因突變所致的疾病的藥物中的應(yīng)用。
29.—種人IL2RG基因打靶方法，其特征在于，所述基因打靶方法包括以下步驟: 1)將權(quán)利要求17或18所述一對多核苷酸或含有權(quán)利要求17或18所述一對多核苷酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人離體細(xì)胞； 2)人離體細(xì)胞在37°C下，培養(yǎng)3-7天，經(jīng)PCR測序鑒定，靶位點發(fā)生突變的細(xì)胞即打靶細(xì)胞。
30.一種人IL2RG基因打靶方法，其特征在于，所述基因打靶方法包括以下步驟: 1)將權(quán)利要求17或18所述一對多核苷酸或含有權(quán)利要求17或18所述一對多核苷酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人離體細(xì)胞； 2)人離體細(xì)胞培養(yǎng)3-7 天，其中至少一天在30°C下培養(yǎng)，其余時間為37°C培養(yǎng)，經(jīng)PCR測序鑒定，靶位點發(fā)生突變的細(xì)胞即打靶細(xì)胞。
31.一種人IL2RG基因打靶方法，其特征在于，所述基因打靶方法包括以下步驟: 1)將權(quán)利要求17或18所述一對多核苷酸或含有權(quán)利要求17或18所述一對多核苷酸的質(zhì)粒與抗puro的多核苷酸或其質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入人離體細(xì)胞； 2)37°C下，puro培養(yǎng)基篩選出表達(dá)抗puro蛋白的人離體細(xì)胞；3)37°C下，人離體細(xì)胞培養(yǎng)3-7天，經(jīng)PCR測序鑒定，靶位點發(fā)生突變的細(xì)胞即打靶細(xì)胞。
32.—種人IL2RG基因打靶方法，其特征在于，所述基因打靶方法包括以下步驟: 1)將權(quán)利要求17或18所述一對多核苷酸或含有權(quán)利要求17或18所述一對多核苷酸的質(zhì)粒與抗puro的多核苷酸或其質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入人離體細(xì)胞； 2)37°C下，puro培養(yǎng)基篩選出表達(dá)抗puro蛋白的人離體細(xì)胞； 3)人離體細(xì)胞培養(yǎng)3-7天，其中至少一天在30°C下培養(yǎng)，其余時間為37°C培養(yǎng)，經(jīng)PCR測序鑒定，靶位點發(fā)生突變的細(xì)胞即打靶細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一對短肽、蛋白質(zhì)和多核苷酸、其宿主細(xì)胞及其應(yīng)用，提出了一種可以對人細(xì)胞內(nèi)源的IL2RG基因高效打靶的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)基因的人工合成方法，以及用含有該基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行定向打靶的方法。所述的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶含有一對轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(TALEs)蛋白及分別與其融合的DNA內(nèi)切酶的催化亞基，可以分別識別人IL2RG基因exon 2上的兩個相鄰位點。在對TALEs的氨基酸序列進(jìn)行設(shè)計的基礎(chǔ)上，合成了編碼該TALEN的核苷酸序列及構(gòu)建了包含該核苷酸序列的載體，通過用TALENs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可以大大地提高細(xì)胞打靶的效率。
文檔編號C12N9/22GK103184202SQ20111044608
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者肖磊, 趙金龍 申請人:浙江大學(xué)