專利名稱：一種短肽、其異構(gòu)體及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種短肽、其異構(gòu)體及其應用。特別是涉及以該短肽、其異構(gòu)體為活性成分的舒血管、降血壓、抗血栓、控制心率失常并有抗癌功效的藥物。
背景技術(shù)：
天冬氨酸-精氨酸-纈氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-組氨酸-脯氨酸 (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro)，簡寫為DRWIHP，它是一個內(nèi)源性七肽也被稱為 angl-7，廣泛分布于體內(nèi)各種組織及體液中。這個七肽主要由血管緊張素II經(jīng)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2水解，或由血管緊張素原由其他途徑少量合成而釋放。在血液中的濃度一般為納摩爾級。angl-7的藥代動力學研究發(fā)現(xiàn)，angl-7靜脈注入體內(nèi)后，很快就被降解，半衰期僅為8 12秒。angl-7在人體內(nèi)通過四種機制從血漿中清除①血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)介導的水解作用；②中性內(nèi)肽酶(NEP)介導的水解作用③亮氨酸內(nèi)肽酶(LAP)介導的水解作用④腎小球濾過作用。其中酶解介導的水解作用是angl-7代謝的主要途徑。angl-7是腎素-血管緊張素調(diào)控系統(tǒng)內(nèi)的一個重要組成部分。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2在把血管緊張素II水解為angl-7降低了血管緊張素II在血液中的含量。同時angl-7 的特異性受體Mas受體因結(jié)合angl-7活化后可直接降低ATl對血管緊張素II的結(jié)合活性，angl-7長期刺激可降低ATl受體的表達。因此在體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2水解血管緊張素II產(chǎn)生angl-7的途徑是體內(nèi)腎素血管緊張素系統(tǒng)中平衡調(diào)節(jié)血管緊張素II生理功能的主要內(nèi)源平衡抑制劑。在多種心腦血管系統(tǒng)疾病中內(nèi)源產(chǎn)生的血管緊張素II是重要的致病因子，因此除了現(xiàn)在市面上大量使用ACE酶抑制劑(抑制ANGII的生成 < 普利類>) 和其受體阻斷劑(主要阻斷ATl受體作用 < 沙坦類 >)外，ANG1-7作為ANGII的內(nèi)源平衡抑制劑也納入了人們的視線范圍。angl-7作為一種主要為平衡血管緊張素II功能的多功能性生理調(diào)控因子，具有多種生物學活性。早期報道，angl-7可以促進內(nèi)皮細胞生成NO并舒張血管的功效。隨后發(fā)現(xiàn)angl-7在細胞上擁有獨立于AT1受體和AT2受體以外的血管緊張素受體Mas受體， 并通過該受體發(fā)揮多種調(diào)節(jié)拮抗血管緊張素II功能的生物學活性，包括抗血管增生、抗血栓、抗心肌肥、抗心律失常等一系列有益的生物學活性。此外angl-7還被發(fā)現(xiàn)具有獨特的抑制和VEGF于PIGF表達相關(guān)的異體移植瘤功效。雖然angl-7具有非常顯著的抗心腦血管疾病的特點，但由于其進入人體后，在體內(nèi)多種酶的作用下迅速降解，使其濃度大大下降，極大地限制了其生物活性的發(fā)揮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為一種短肽及其異構(gòu)體，它的結(jié)構(gòu)式(以下簡稱發(fā)明短肽1)為Ac-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-NH2其中Ac-代表氮末端乙酰化，-NH2代表碳末端酰胺化。其異構(gòu)體的(以下簡稱發(fā)明短肽2)結(jié)構(gòu)式為
Ac-Asp-Arg-Val-Tyr(D)-Ile-His(D)-Pro其中“D”表示此氨基酸殘基為D構(gòu)型。該短肽及其異構(gòu)體的獲得，采用現(xiàn)有技術(shù)中的公知方法進行，可以用常規(guī)的化學合成方法，或生物合成方法獲得。該短肽及其異構(gòu)體分別與ACE酶、NEP酶、LAP酶作用，HPLC檢測分析，確定其都能抵抗這三種酶降解。分別以該短肽及其異構(gòu)體為活性成份的抗高血壓藥物、抗血栓藥物和抗癌藥物，具有與天然angl-7基本相同甚至優(yōu)于天然angl-7的特性，而且在體內(nèi)抵抗上述三種降解酶降解，含酶條件下其半衰期延長超過原型100倍以上，使其更能夠持續(xù)有效的發(fā)揮功能。該短肽及其異構(gòu)體可制備如舒血管降血壓藥物，它的活性成份是治療有效量的本發(fā)明短肽或其異構(gòu)體；抗血管增生藥物，它的活性成份是治療有效量的本發(fā)明短肽或其異構(gòu)體；抗心律失常藥物，它的活性成份是治療有效量的本發(fā)明短肽或其異構(gòu)體；抗癌藥物， 它的活性成份是治療有效量的本發(fā)明短肽或其異構(gòu)體。需要的時候，在上述藥物中還可以含有一種或多種藥學上可以接受的載體。所述載體包括藥學領域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。本發(fā)明的藥物可以制成片劑、粉劑、粒劑、膠囊、及凍干粉注射液等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規(guī)方法制備。上述藥物的用量一般為每天100 μ g/kg體重。


圖1所示為本發(fā)明短肽對比血管緊張素1-7的耐酶解效果HPLC圖譜；A圖血管緊張素1-7標準品；
B圖發(fā)明短肽1標準品；
C圖發(fā)明短肽2標準品；
D圖血管緊張素1-7被ACE酶水解結(jié)果
E圖發(fā)明短肽1被ACE酶水解結(jié)果；
F圖發(fā)明短肽2被ACE酶水解結(jié)果；
G圖血管緊張素1-7被LAP酶水解結(jié)果
H圖發(fā)明短肽1被LAP酶水解結(jié)果；
I圖發(fā)明短肽2被LAP酶水解結(jié)果；
J圖血管緊張素1-7被NEP酶水解結(jié)果
K圖本發(fā)明短肽1被NEP酶水解結(jié)果；
L圖發(fā)明短肽2被NEP酶水解結(jié)果。圖2所示為本發(fā)明短肽1刺激HUVEC釋放NO的含量測定對比。圖3所示為血管緊張素1-7、本發(fā)明短肽1、本發(fā)明短肽2抑制HUVEC細胞形成小管對比圖；A圖為小管數(shù)目統(tǒng)計圖；B圖無藥物刺激情況下HUVEC細胞形成光鏡下可見的小管；
C圖血管緊張素1-7抑制HUVEC細胞形成光鏡下可見的小管；D圖本發(fā)明短肽1抑制HUVEC細胞形成光鏡下可見的小管；E圖本發(fā)明短肽2抑制HUVEC細胞形成光鏡下可見的小管。圖4所示為本發(fā)明短肽抑制A549細胞增殖的對比結(jié)果，其中A圖為血管緊張素1-7抑制A549細胞生長結(jié)果；B圖為本發(fā)明短肽1抑制A549細胞生長結(jié)果；C圖為本發(fā)明短肽2抑制A549細胞生長結(jié)果。
具體實施例方式實施1本發(fā)明短肽及其異構(gòu)體對比血管緊張素1-7的耐酶解效果用PBS溶解血管緊張素1-7、發(fā)明短肽1、發(fā)明短肽2至5mmol/L。用PBS溶解血管緊張素1-7、發(fā)明短肽1、發(fā)明短肽25μ1+20μ1 PBS 37°C水浴 30min+5 μ 1乙腈過HPLC作標準圖譜。發(fā)明短肽15μ 1+10μ 1 ACE 或 NEP 或 LAP 酶(0. 05U)+10PBS 37°C 水浴 30min+5 μ 1 乙腈過HPLC。發(fā)明短肽25μ 1+10μ 1 ACE 或 NEP 或 LAP 酶(0. 05U)+10PBS 37°C 水浴 30min+5 μ 1 乙腈過HPLC。色譜條件A液0.1%磷酸溶液B液100%乙腈溶液C18 柱流速0. ;35ml/min12% B溶液平衡柱子后上樣，B液濃度15min中逐漸梯度升至M%，24% B液濃度繼續(xù)沖洗15min。結(jié)果見圖1，如圖所示，相比于血管緊張素1-7標準品，兩種發(fā)明短肽可以更好的抵抗降解血管緊張素1-7相關(guān)酶的降解。實施例2本發(fā)明短肽及其異構(gòu)體刺激HUVEC釋放一氧化氮消化HUVEC細胞后以每孔2X IO5個細胞鋪入12孔板加入10% FBS DMEM37°C 5% CO2培養(yǎng)過夜。取10% FBS DMEM分別稀釋angl-7、本發(fā)明短肽其結(jié)構(gòu)式為Ac-Asp-Arg-Val-Tyr -Ile-His-Pro-NH2,和 Ac-Asp-Arg-Val-Tyr (D)-Ile-His (D)-Pro-NH2,為 1 μ m/L。12 孔分為無藥組、angl-7、本發(fā)明短肽1、發(fā)明短肽2，四組每組2個副孔吸取培養(yǎng)液后加入新鮮培養(yǎng)基或藥物900 μ 1 37°C培養(yǎng)30min。取出12孔板每孔取50 μ 1培養(yǎng)液做一氧化氮含量測定。結(jié)果見圖2，如圖所示，加入改構(gòu)體后改構(gòu)體可刺激血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)釋放一氧化氮，而一氧化氮是一種強效的舒血管活性物質(zhì)并對機體氧化損傷有保護作用。實施例3本發(fā)明短肽及其異構(gòu)體抑制HUVEC細胞形成小管預冷96孔板和200 μ 1槍頭，4°C過夜融化_20°C保存的matrgiel基質(zhì)膠。將融化的matrgiel基質(zhì)膠50 μ 1每孔快速加入預冷的96孔板，室溫放置IOmin待matrgiel基質(zhì)膠凝固。消化HUVEC細胞調(diào)節(jié)細胞密度2 X IO5HiL取144 μ 1細胞懸液加入凝固的matrgiel 基質(zhì)膠上。DMEM調(diào)配1 μ m/L angl_7、本發(fā)明短肽1、本發(fā)明短肽2，16孔分為無藥組、angl_7、 本發(fā)明短肽1、本發(fā)明短肽2四組，每組3個副孔加入16 μ 1藥液于加好細胞的96孔板中。370C 5% CO2培養(yǎng)他觀察小管形成效果并計算小管數(shù)目。結(jié)果見圖3，如圖所示，本發(fā)明短肽可以比原型更好的抑制血管內(nèi)皮細胞的小管形成，內(nèi)皮細胞遷移、相互融合并形成管狀結(jié)構(gòu)是血管形成過程中的重要環(huán)節(jié)，如能抑制這一環(huán)節(jié)，就可以抑制血管的形成和增生。實施例4本發(fā)明短肽抑制Α549細胞增殖消化Α549細胞每孔1 X IO4鋪入M孔板加入10% FBS164037°C 5% CO2培養(yǎng)培養(yǎng)過夜。熱壓PBS(PH7. 2)并用其稀釋本發(fā)明短肽。取出M孔板后消化第一列孔中細胞計數(shù)，其余孔中細胞吸去培養(yǎng)液4行分別加入PBS，本發(fā)明短肽0. 1 μ m/L、1 μ m/L、10 μ m/L沖洗細胞并在37°C孵育30min。吸去洗液加入FBS 164037°C 5% CO2培養(yǎng)培養(yǎng)Id。第二天重復第二段步驟，消化計數(shù)第二列孔中細胞并以此類推直到第六天完成實驗，沒孔細胞數(shù)描點繪制細胞生長曲線。結(jié)果見圖4，如圖所示，本發(fā)明短肽1和本發(fā)明短肽2擁有類似Angl-7的抑制A549 細胞(肺癌)的增殖的效果。
權(quán)利要求
1.一種短肽，其結(jié)構(gòu)式為Ac-Asp-Arg-Val-Tyr-IIe-HiS-Pro-NH2其中Ac-代表氮末端乙?；?，-NH2代表碳末端酰胺化。
2.一種短肽，其結(jié)構(gòu)式為Ac-Asp-Arg-Val-Tyr(D)-Ile-His(D)-Pro其中“D”表示此氨基酸殘基為D構(gòu)型。
3.—種舒血管降血壓藥物，它的活性成份是治療有效量的權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽。
4.一種抗血管增生藥物，它的活性成份是治療有效量的權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽。
5.一種抗心律失常藥物，它的活性成份是治療有效量的權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽。
6.一種抗癌藥物，它的活性成份是治療有效量的權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽。
7.權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽在制造降壓藥物中的應用。
8.權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽在制造抗心律失常藥物中的應用。
9.權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽在制造抗血栓藥物中的應用。
10.權(quán)利要求1所述短肽或權(quán)利要求2所述短肽在制造抗癌藥物中的應用。
11.權(quán)利要求7、8、9、10所述藥物應用中含有一種或多種藥學上可以接受的載體包括藥學領域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等所制成的片劑、粉劑、粒劑、膠囊、及凍干粉注射液等藥用形式和保健品及食品添加劑形式。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種短肽、其異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)如下Ac-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-NH2和Ac-Asp-Arg-Val-Tyr(D)-Ile-His(D)-Pro，兩種改構(gòu)體擁有促進HUVEC細胞釋放NO遷移和形成小管的能力并且能夠抑制A549細胞生長等類似于血管緊張素1-7的生物學活性；與此同時，該改構(gòu)體擁有抵抗ACE、NEP、AP這3三種降解酶降解的能力，從而保證其比血管緊張素1-7原型更長的半衰期；該改構(gòu)體獲得簡單，對開發(fā)成為新型心腦血管治療用多肽藥物有重要應用價值。
文檔編號A61P9/06GK102532265SQ201110449129
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者張英起, 王增祿, 郭翰文, 黃同列 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學