專利名稱：一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆短肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物活性肽的制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽、其分離純化方法及用途。
背景技術(shù)：
短肽是介于氨基酸和蛋白之間的由3-9個氨基酸殘基組成的短鏈肽，也叫低聚肽、寡肽或活性肽。近幾年的科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人體吸收蛋白質(zhì)的主要形式不是以氨基酸，而是以短肽的形式吸收的，這是人體吸收蛋白質(zhì)機制研究的重大突破，短肽在人體內(nèi)的作用具有以下特點:1、不需消化，直接吸收，通常，短肽是人體自身合成的，是人體將所吃的營養(yǎng)進行酶促水解。在體外已經(jīng)合成好了，進入人體后不需進行二次降解，直接吸收；吸收迅速，口服劑如同針劑，口服進入人體，其速度如同火箭一樣，有的科學(xué)家把它稱為“生物導(dǎo)彈”，快速地穿過人體的口腔、胃，直接進入小腸，被小腸吸收，最終進入人體血液循環(huán)系統(tǒng)、器官及細(xì)胞組織，迅速發(fā)揮其生理作用和生物學(xué)功能；以完整的形式吸收，短肽自身有一層保護膜，人服用時，不會受到人體中的促酶、胰酶、淀粉酶、消化酶、胃蛋白酶及消化系統(tǒng)中的酸堿物質(zhì)的損害或二次水解，短肽是以完整的形式被人體吸收和利用的；可百分之百被人體吸收；吸收后，不會有任何排泄物，全部被人體吸收和利用；短肽具有主動被人體吸收的特點。短肽自身具有極強的活性和能量，它的主動吸收、迫使吸收，就是自身的活性和能量在起作用，因此，它在被人體吸收時，不是人體要耗費自身的能量去吸收它，而是多肽以自身的能量讓人體吸收；短肽具有優(yōu)先被人體吸收的特點，人體平常所食的營養(yǎng)物質(zhì)，在吸收上，與短肽的競爭中，短肽具有優(yōu)先吸收的特點，這與其主動吸收的特點是分不開的；短肽在被人體吸收時，對氨基酸有保護作用，可保護氨基酸不受破壞，因此，肽與氨基酸的混合物是人體吸收蛋白質(zhì)的最佳吸收機制；短肽在人體中表現(xiàn)出載體的作用，可將人平常所食的營養(yǎng)物質(zhì)，特別是鈣等對人體有益的微量元素，吸附、粘貼、裝載在本體上；短肽可在人體中起運輸工具的作用，可將人平常所食的各種營養(yǎng)物質(zhì)吸附在本體上后，然后運載輸送到人體各個細(xì)胞；短肽被人體吸收后，在 人體中起著信使作用，它作為神經(jīng)遞質(zhì)傳遞信息，讓人體各系統(tǒng)、器官、組織發(fā)揮各自和整體作用。短肽可分為植物源短肽和動物源短肽兩大類，其中大豆類短肽是比較常見研究較多的植物源短肽。近年來的研究表明，由大豆類蛋白降解得到的短肽，具有生物活性，可增強體能，消除疲勞，可用于降膽固醇、降血壓、輔助治療糖尿病及解酒和排毒，延緩衰老；同時，其易消化、易吸收且避免了大豆蛋白對人體的過敏性反應(yīng)。目前大豆類短肽已經(jīng)被用于多種營養(yǎng)品或藥物當(dāng)中。鷹嘴豆屬于高營養(yǎng)豆類植物，富含多種植物蛋白和多種氨基酸、維生素、粗纖維及鈣、鎂、鐵等成份。此外籽粒中還含腺嘌呤、膽堿、肌醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖等。其中純蛋白質(zhì)含量高達28%以上，脂肪5%，碳水化合物61%，纖維4 - 6%，鷹嘴豆含有10多種氨基酸，其中人體必需的8種氨基酸全部具備，而且含量比燕麥還要高出2倍以上。每百克蛋白質(zhì)含谷氨酸16.0g、亮氨酸4.6g、賴氨酸4.6g。
鷹嘴豆短肽也是短肽中生物活性較為突出的一類短肽，除了其較高的營養(yǎng)價值之夕卜，目前也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在抗癌和增強免疫力等方面的功效，而其在抗氧化方面更是有著非常好的表現(xiàn)。目前對于短肽的研究還在逐漸深入當(dāng)中，如何獲取抗氧化效果更好，制備更加簡單穩(wěn)定的鷹嘴豆多肽是本領(lǐng)域中還有待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽。本發(fā)明的第二個目的是提供一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽的分離純化方法。本發(fā)明的第三個目的是提供一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽的用途。在第一方面，本發(fā)明提供了一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽，其特征在于所述鷹嘴豆肽的序列為SEQ ID NO: 1。根據(jù)本發(fā)明的鷹嘴豆肽，其特征在于，所述鷹嘴豆肽可以是對SEQ ID N0:1的鷹嘴豆肽進行一個或多個氨基酸殘基的缺失、增加和/或取代而獲得的，其序列為SEQ IDNO:2-9。根據(jù)本發(fā)明的鷹嘴豆肽，其特征在于，所述鷹嘴豆肽可以是藥學(xué)上可接受的鹽形式。根據(jù)本發(fā)明的鷹嘴豆肽，其特征在于，所述鷹嘴豆肽可以被乙酰化、PEG化或酰胺化修飾。在第二方面，本發(fā)明提供了根據(jù)第一方面所述的鷹嘴豆肽的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:(I)脫脂；(2)蛋白酶水解；(3)凝膠層析分離，獲得所述鷹嘴豆肽。本發(fā)明的鷹嘴豆肽的制備方法可以包括以下步驟:(I)將鷹嘴豆浸泡后脫皮，50°C烘干，用粉碎機打成豆粉。200目過篩，按豆粉:石油醚為1:10 (w/v)的比例進行脫脂，室溫下連續(xù)攪拌lh，鷹嘴豆自然沉降與石油醚分離，傾出石油醚進行回收，重復(fù)上述提取工藝兩次，然后將鷹嘴豆粉置于通風(fēng)櫥下過夜，使石油醚充分揮發(fā)干凈，將處理好的脫脂豆粉袋裝置-20°C冰箱保存；(2)脫脂豆粉與水按1:9 1:12 (w/v),優(yōu)選地1:10 1:11 (w/v),更優(yōu)選地1:10.5 混合,用 0.5mol/LNa0H 調(diào) pH 至 8.3 攬拌 lh, 3000r/min 離心 10 20min,沉淀按固液比1:5 (w/v)提取兩次，將三次上清液合并，上清液用0.5mol/L的HCl調(diào)至等電點pH4.3沉淀蛋白，10000r/min離心20min,冷凍干燥后,得到鷹嘴豆蛋白；(3)將所述鷹嘴豆蛋白溶解于蒸餾水中制成質(zhì)量溶度為2%_5%，優(yōu)選地3%_4%，更優(yōu)選地3.5%的蛋白水溶液，按堿性蛋白酶Alcalase與鷹嘴豆蛋白的比例為2%_5%，優(yōu)選地3%-4%(v/w)，更優(yōu)選地3.5%,將Alcalase酶加入鷹嘴豆蛋白水溶液中，在pH8.0，反應(yīng)溫度為40°C -60°C，優(yōu)選地45°C -55°C，更優(yōu)選地55°C的條件下，水解30_60min，將酶解液放入沸水浴中IOmin,再迅速放入冰水浴中IOmin,冷卻后10000r/min離心IOmin,將離心出的液體部分冷凍干燥，得到鷹嘴豆肽粉末；和
(4)將處理好的S^hadex G_25裝成1.6X 150cm的玻璃層析柱，用超純水將鷹嘴豆酶解物配制成20mg/mL的溶液，上樣量為5mL，用超純水以20mL/h的流速洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm處檢測，分時段共出現(xiàn)6個洗脫峰，收集第一個洗脫峰，冷凍干燥，獲得所
述鷹嘴豆肽。在第三方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其特征在于，所述組合物包含第一方面所述的鷹嘴豆肽。根據(jù)本發(fā)明的所述組合物可以是藥物組合物(包括膠囊、片劑、口服液、沖劑)保健品、食品添加劑、化妝品或詞料。在第四方面，本發(fā)明提供了根據(jù)第一方面所述的鷹嘴豆肽在藥物組合物、保健品、食品添加劑、化妝品或飼料制備中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于:(I)本發(fā)明的鷹嘴豆肽抗氧化生物活性較高。(2)本發(fā)明的鷹嘴豆肽制備條件溫和，簡便易行，重現(xiàn)性好，樣品回收率高，為開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。


圖1為凝膠色譜G-25分離鷹嘴豆蛋白酶解物的圖譜。圖2為本發(fā)明的短肽(SEQ ID NO:1)的提取離子流圖(上)和一級質(zhì)譜圖(下)。
具體實施例方式
本發(fā)明的實施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，并不能對本發(fā)明作任何限制。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽的分離純化方法，包括下述步驟:(I)將鷹嘴豆浸泡后脫皮，50°C烘干，用粉碎機打成豆粉。200目過篩，按豆粉:石油醚為1:10 (w/v)的比例進行脫脂，室溫下連續(xù)攪拌lh，鷹嘴豆自然沉降與石油醚分離，傾出石油醚進行回收，重復(fù)上述提取工藝兩次。然后將鷹嘴豆粉置于通風(fēng)櫥下過夜，使石油醚充分揮發(fā)干凈。將處理好的脫脂豆粉袋裝置-20°C冰箱保存。脫脂豆粉與水按1:9 (w/v)混合，用0.5mol/LNa0H調(diào)pH至8.3攪拌lh，3000r/min離心lOmin,沉淀按固液比1:5 (w/v)提取兩次,將三次上清液合并,上清液用0.5mol/L的HCl調(diào)至等電點pH4.3沉淀蛋白，10000r/min離心20min,,冷凍干燥后,得到鷹嘴豆蛋白。(2)將所述鷹嘴豆蛋白溶解于蒸餾水中制成質(zhì)量溶度為2%_5%的蛋白水溶液，按堿性蛋白酶Alcalase與鷹嘴豆蛋白的比例為2% (v/w),將Alcalase酶加入鷹嘴豆蛋白水溶液中，在PH8.0，反應(yīng)溫度為50°C的條件下，水解30 ;將酶解液放入沸水浴中l(wèi)Omin，再迅速放入冰水浴中IOmin,冷卻后10000r/min離心IOmin,將離心出的液體部分冷凍干燥,得到鷹嘴豆肽粉末。(3)將處理好的S印hadex G-25裝成1. 6X 150cm的凝膠色譜柱，用超純水將鷹嘴豆酶解物配制成20mg/mL的溶液，上樣量為5mL，用超純水以20mL/h的流速洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm處檢測，分時段共出現(xiàn)6個洗脫峰，收集各洗脫峰，冷凍干燥各洗脫組分。經(jīng)測定(見下文)，具有抗氧化活性最高的是第一個洗脫峰，用I表示。見圖1。液質(zhì)聯(lián)用(HLPC-MS)確定組分I的結(jié)構(gòu)。色譜柱:ZorbaxSB C18 (150mmX 2.1mm 1.D.，5 y m);流動相 A:水(含 0.1%TFA),B:乙腈(含 0.1%TFA);梯度:0 80min, B:5% 40% ；80 90min, B:40% 90% ;進樣量80 u L ;流速:0.2ml/min ;檢測波長:214nm。質(zhì)譜條件:ESI電噴霧離子源，噴霧電壓4.5kV，加熱電壓25V，離子導(dǎo)入電壓(skimmer電壓)20V,殼氣流速:60arb,輔助氣流速:5arb,離子傳輸毛細(xì)管溫度:300°C。離子監(jiān)測模式參數(shù)中共設(shè)立3個掃描段，第一段監(jiān)測為一級質(zhì)譜全掃描，掃描范圍為m/z=400-2000，采用正離子監(jiān)測模式；第二段監(jiān)測為數(shù)據(jù)依賴型精確質(zhì)量數(shù)掃描(datadependent zoomscan),用來確定一級質(zhì)譜全掃描中某一高豐度離子所帶電荷數(shù)；第三段監(jiān)測采用數(shù)據(jù)依賴型二級質(zhì)譜的掃描(data dependent MS/MS)，用于掃描在第一段和第二段監(jiān)測中已確定質(zhì)量數(shù)離子的二級質(zhì)譜，離子帶電荷數(shù)默認(rèn)值為2個，二級質(zhì)譜碰撞誘導(dǎo)裂分中的能量值均設(shè)置為35%。為獲得同一色譜峰內(nèi)不同多肽的序列信息，將質(zhì)譜分析過程中的動態(tài)排除次數(shù)降低為1，動態(tài)排除時間設(shè)為0.5min，離子注入離子阱的模式為type2模式，即在離子注入過程中排除低于或高于設(shè)定的掃描范圍的離子從而提高目標(biāo)離子的信號強度。尚子動態(tài)排除數(shù)量設(shè)為20。動態(tài)排除中尚子的質(zhì)量數(shù)寬度設(shè)為1.0。用Turbosequest軟件進行檢索，數(shù)據(jù)庫為從Swiss-Prot下載的包括鷹嘴豆中已發(fā)現(xiàn)的全部蛋白質(zhì)的氨基酸序列。數(shù)據(jù)搜索格式為:FASTA。獲得I組分的分子量為1333Da，氨基酸組成為:Glu_Glu-Pro-Arg-Glu-Ser-Glu-Gln-Gly-Glu-Gly-Ser (SEQ ID NO:1)。保留時間為 15.46 所對應(yīng)的峰為I組分的主要成分。見圖2。鷹嘴豆蛋白酶解物還原能力的測定還原能力測定方法:稱取5mg``不同組分的樣品溶于2mL的去離子水中，震蕩使其充分溶解，加入0.2mol/L pH6.6的磷酸緩沖液2mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶液2mL，混勻，50°C水浴下保溫20min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸(TCA)溶液2mL，震蕩混勻后離心。取離心后的上清液2mL，加入2mL去離子水和0.4mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeC13溶液，震蕩混勻后在50°C水浴下保溫lOmin，體系溶液由黃色變?yōu)樗{色，在700nm下進行比色。以去離子水代替樣品作為空白。測定結(jié)果見表I。表I
權(quán)利要求
1.一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽，其特征在于，所述鷹嘴豆肽的序列為SEQ IDNO:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鷹嘴豆肽，其特征在于，所述鷹嘴豆肽可以是對SEQID NO:I的鷹嘴豆肽進行一個或多個氨基酸殘基的缺失、增加和/或取代而獲得的，其序列為SEQID NO:2-9。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鷹嘴豆肽，其特征在于，所述鷹嘴豆肽是藥學(xué)上可接受的鹽形式。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的鷹嘴豆肽，其特征在于，所述鷹嘴豆肽被乙酰化、PEG化或酰胺化修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的鷹嘴豆肽的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)脫脂； (2)蛋白酶水解； (3)凝膠層析分離，獲得所述鷹嘴豆肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)將鷹嘴豆浸泡后脫皮，50°C烘干，用粉碎機打成豆粉。200目過篩，按豆粉:石油醚為1:10 1:12 (w/v)，優(yōu)選地1:10 1:11 (w/v)，更優(yōu)選地1:10.5的比例進行脫脂，室溫下連續(xù)攪拌lh，鷹嘴豆自然沉降與石油醚分離，傾出石油醚進行回收，重復(fù)上述提取工藝兩次，然后將鷹嘴豆粉置于通風(fēng)櫥下過夜，使石油醚充分揮發(fā)干凈，將處理好的脫脂豆粉袋裝置-20°C冰箱保存； (2)脫脂豆粉與水按1:9 1:12(w/v),優(yōu)選地1:10 1:ll(w/v),更優(yōu)選地1:10.5混合比例混合，攬祥均勻，用0.5mol/LNaOH調(diào)pH至8.3攬祥lh, 3000r/min離心10 20min,沉淀按固液比1:5 (w/v)提取兩次，將三次上清液合并，上清液用0.5mol/L的HCl調(diào)至等電點pH4.3沉淀蛋白，10000r/min離心20min,冷凍干燥后,得到鷹嘴豆蛋白； (3)將所述鷹嘴豆蛋白溶解于蒸餾水中制成質(zhì)量溶度為2%-5%，優(yōu)選地3%-4%，更優(yōu)選地3.5%的蛋白水溶液，按堿性蛋白酶Alcalase與鷹嘴豆蛋白的比例為2%_5%，優(yōu)選地3%-4% (v/w)，更優(yōu)選地3.5%，將Alcalase酶加入鷹嘴豆蛋白水溶液中，在pH8.0 pH9.0，優(yōu)選地pH8.2 pH8.8，更優(yōu)選地pH8.5，反應(yīng)溫度為40°C -60°C，優(yōu)選地45°C _55°C，更優(yōu)選地55°C的條件下，水解30-60min，將酶解液放入沸水浴中l(wèi)Omin，再迅速放入冰水浴中l(wèi)Omin，冷卻后10000r/min離心IOmin,將離心出的液體部分冷凍干燥，得到鷹嘴豆肽粉末； (4)將處理好的S^hadexG-25裝成1.6X 150cm的玻璃層析柱，用超純水將鷹嘴豆酶解物配制成20mg/mL的溶液，上樣量為5mL，用超純水以20mL/h的流速洗脫，同時用紫外檢測儀在280nm處檢測，分時段共出現(xiàn)6個洗脫峰，收集第一個洗脫峰I，冷凍干燥，獲得所述鷹嘴豆肽。
7.一種組合物，其特征在于，包含根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的鷹嘴豆肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，所述組合物是藥物組合物、保健品、食品添加劑、化妝品或飼料。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的組合物，所述組合物為膠囊、片劑、口服液或沖劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的鷹嘴豆肽在藥物組合物、保健品、食品添加劑、化妝品或飼料制備 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗氧化作用的鷹嘴豆肽、其分離純化方法及用途。所述鷹嘴豆肽抗氧化生物活性較高，并且其制備條件溫和，簡便易行，重現(xiàn)性好，樣品回收率高，易于進行相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)。
文檔編號A61P39/06GK103172706SQ20131008414
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月15日
發(fā)明者王麗, 邢慧芳, 楊良嶸, 劉會洲 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所