本發(fā)明涉及血管疾病的診斷和治療領(lǐng)域，具體涉及一種新的主動脈瘤靶向分子以及用于早期診斷并靶向治療胸主動脈瘤夾層和腹主動脈瘤發(fā)生的方法和試劑。

背景技術(shù)：

主動脈瘤(aorticaneurysm)，是指主動脈壁局部或彌漫性的異常擴張超過正常直徑50％以上。一旦發(fā)生，破裂率高達(dá)80％以上。主動脈瘤好發(fā)于大動脈，包括升主動脈主動脈弓、胸部降主動脈、胸腹主動脈和腹主動脈。由于大動脈血壓以及流速過快，極容易在應(yīng)激情況下迅速擴張，甚至撕裂形成夾層，威脅病人生命。傳統(tǒng)的主動脈瘤的診斷依靠影像學(xué)與臨床癥狀相結(jié)合的方法，其中cta和mri更是作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)在臨床中廣泛應(yīng)用。

近年來流行病大數(shù)據(jù)的研究發(fā)現(xiàn)在主動脈瘤極早期臨床癥狀隱匿，且管腔并未出現(xiàn)明顯擴張；但此時管壁內(nèi)皮及中層已經(jīng)出現(xiàn)明顯病生理改變，此時若發(fā)生應(yīng)激、突然血壓升高，則容易撕裂出現(xiàn)夾層，而流行病數(shù)據(jù)也證實管腔直徑與破裂風(fēng)險之間無線性關(guān)系，一些管徑較小的動脈瘤反而具有更高的破裂風(fēng)險。由于主動脈夾層發(fā)生破裂后高致死率以及發(fā)病年齡的前移，迫切需要一種在早期特異、靈敏的方法對其進行檢測，從而提高患者的生存率和生活質(zhì)量。

隨著對動脈瘤發(fā)病機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)動脈瘤形成過程中存在多種比直徑變化更早更特異的病理改變，如內(nèi)皮的活化，平滑肌細(xì)胞的凋亡，中層彈力板的降解和炎癥細(xì)胞的浸潤。在此過程中，最先出現(xiàn)的是內(nèi)皮細(xì)胞的活化，包括細(xì)胞間隙的擴大，細(xì)胞皺縮和內(nèi)皮的脫落。四型膠原是一種內(nèi)皮下基底膜的主要成分，在內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)活化后可以暴露，從而被檢測；在正常情況下四型膠原主要參與基底膜的形成與穩(wěn)定性，而在病理過程中則促進細(xì)胞的遷移。分子病理學(xué)的發(fā)展為微觀檢測提供了可能性，可以通過選取病理過程中合適的分子作為靶點，通過與其特異性結(jié)合，特異性監(jiān)測該病理過程的發(fā)生發(fā)展；并且可以通過靶向載藥這一方式，提高病變部分的血藥濃度，并且降低其他器官的毒性。

熒光成像技術(shù)作為一種優(yōu)秀的檢測和示蹤手段被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。熒光成像技術(shù)一般通過設(shè)計合理有效的熒光分子，輔以功能化的修飾，從而實現(xiàn)在細(xì)胞或者動物體內(nèi)發(fā)光成像。其具備可選擇性強，靈敏度高，可視化效果強，重復(fù)性較好等特點，現(xiàn)被充分的利用于疾病的檢測和診斷，納米材料的示蹤，新型藥物效果的評價等方面。通常的熒光探針需要具備一定的優(yōu)異的生物相容性和光學(xué)特性，即需要有較高的熒光量子產(chǎn)率和摩爾消光系數(shù)，同時，其又要規(guī)避與生物基質(zhì)有同樣激發(fā)波長的情況下能有被有效的在細(xì)胞或者動物體內(nèi)檢測?，F(xiàn)有的大部分熒光探針基本分為生物熒光探針和化學(xué)合成探針，其中生物熒光探針一般為固有的生物蛋白如基因編碼的熒光蛋白等等，而化學(xué)熒光探針，包括人工合成的異硫氰酸熒光素，羅丹明b，花青染料熒光標(biāo)記等等，都被廣泛的使用于現(xiàn)在科學(xué)的研究中。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有診療技術(shù)的問題，研究四型膠原作為分子靶點，是否可作為診斷標(biāo)志物應(yīng)用于動脈瘤的精準(zhǔn)診斷中。

本發(fā)明首先涉及四型膠原(coliv)作為診斷檢測靶標(biāo)，在早期診斷主動脈夾層/瘤中的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及四型膠原(coliv)作為診斷檢測靶標(biāo)，在研發(fā)/篩選主動脈夾層/瘤早期診斷標(biāo)識物中的應(yīng)用。

進一步的，本發(fā)明還涉及靶向四型膠原的多肽(coliv-peptide)，所述的多肽的序列如seqidno.1所示，

seqidno.1：cgggkplvwlk。

本發(fā)明還涉及編碼所述靶向四型膠原的多肽的核苷酸片段。

進一步的，本發(fā)明還涉及所述靶向四型膠原的多肽(coliv-peptide)或其衍生物在制備主動脈夾層/瘤早期診斷標(biāo)志物中的應(yīng)用，所述的診斷包括但不限于，經(jīng)超聲下檢測、經(jīng)mri下檢測、經(jīng)cta下檢測、經(jīng)熒光成像下檢測中的任意一種或幾種。

本發(fā)明還涉及所述靶向四型膠原多肽(coliv-peptide)或其衍生物在制備治療或預(yù)防主動脈夾層/瘤藥物中的應(yīng)用，所述的藥物包括但不限于，經(jīng)胃腸消化道道給藥的藥物、經(jīng)靜脈注射給藥的藥物、經(jīng)皮下包埋給藥方式給藥的藥物。

所述的靶向四型膠原的多肽的衍生物包括但不限于，所述的靶向四型膠原的多肽被熒光標(biāo)識物，mri標(biāo)識物或其他可用化學(xué)發(fā)光檢測的標(biāo)記物或電信號檢測的標(biāo)記物中的一種或多種修飾/絡(luò)合/共價偶聯(lián)后的產(chǎn)物。。

優(yōu)選的，所述靶向四型膠原的多肽(coliv-peptide)的衍生物為所述的靶向四型膠原的多肽被羅丹明b通過共價鍵修飾得到的coliv-rhb，所述的衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下式1所示：

更優(yōu)選的，所述靶向四型膠原的多肽(coliv-peptide)的衍生物為所述的靶向四型膠原的多肽被兩分子的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,,4,7,10-四羧酸釓?fù)ㄟ^酰胺鍵偶聯(lián)得到的coliv-gb，其結(jié)構(gòu)如式2所示：

最優(yōu)選的，所述的靶向四型膠原的多肽(coliv-peptide)的衍生物為所述的多肽被羅丹明b通過共價鍵修飾后進一步被兩分子的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,,4,7,10-四羧酸釓?fù)ㄟ^酰胺鍵偶聯(lián)的產(chǎn)物(collageniv-targetedcontrastagent,c4tca)，其結(jié)構(gòu)如式2所示

更進一步的，本發(fā)明還涉及所述的coliv-rhb、coliv-gb、c4tca在制備早期診斷主動脈瘤的制劑中的應(yīng)用。

更進一步的，本發(fā)明還涉及所述的c4tca的制備方法，其步驟包括，

(1)充分鹽化n-羥基琥珀酰亞胺活化過的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四羧酸(nhs-dota)的羧基；

(2)使用n-羥基琥珀酰亞胺修飾過的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,,4,7,10-四羧酸(nhs-dota，化合物1)和六水合氯化釓絡(luò)合，獲得用n-羥基琥珀酰亞胺修飾過的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,,4,7,10-四羧酸釓(nhs-dota-gd，化合物2)；

(2)使用coliv-rhb(化合物3)和nhs-dota-gd反應(yīng)，獲得c4tca(化合物4)。

優(yōu)選的，所述的合成步驟為：

(1)取12.7mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化過的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四羧酸(dota)，即nhs-dota，溶解于1ml的去離子水中，向其中加入8mg的碳酸氫鈉，室溫磁力攪拌10-20分鐘，使其羧基充分鹽化。

(2)取9.4mg的六水合氯化釓溶解于200μl的去離子水中，將所得的溶液緩慢的滴加入實例4(1)的溶液中，室溫磁力攪拌12小時，使其充分絡(luò)合。

(3)取20mg的羅丹明b修飾的四型膠原的靶向多肽(rhb-coliv)在避光的環(huán)境下溶解于800μl的水中，將所得的溶液加入實例4(2)最終得到的溶液里，避光環(huán)境下室溫磁力攪拌12小時，所得的混合液通過1000mw的透析膜超濾提純，最終溶液通過凍干的方式得到紅色絮狀固體，所有的后處理全程避光。

所述的合成路線為

附圖說明

圖1、動脈瘤進程中內(nèi)皮細(xì)胞活化與中層彈力板斷裂出現(xiàn)的時間圖

圖2、四型膠原在正常/病理下血管的表達(dá)部位示意圖

圖3、c4tca在小鼠主動脈瘤早期mri及熒光成像檢測效果圖

具體實施方式

實驗動物

胸主動脈夾層/主動脈瘤模型：3周齡雄性野生型小鼠(c57bl/6)；apoe-/-小鼠(c57bl/6j)均購自北京華阜康生物科技股份有限公司。所有動物均在北京市心肺血管疾病研究所spf級環(huán)境動物房進行飼養(yǎng)繁殖。野生小鼠需為達(dá)到3周齡，體重在10g左右的雄性小鼠。apoe-/-小鼠要求6w左右，體重在20～22g左右的雄性小鼠。所有實驗操作均根據(jù)nih與1996年制定的《實驗動物管理及使用指南》和首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理委員會規(guī)定的實驗流程進行。所有實驗動物按照隨機方法進行分組。

實施例1、胸主動脈夾層/主動脈瘤小鼠模型(小鼠tad模型)的構(gòu)建

bapn喂水組小鼠tad模型的構(gòu)建及評價

取3周齡c57bl/6背景雄性小鼠給予正常飲食，

bapn喂水組(n＝16)：將bapn以1g/kg/day劑量溶于飲水中。

喂bapn第14天，隨機選擇5只小鼠進行胸主動脈超聲，判斷是否已經(jīng)存在胸主動脈的增寬/夾層。經(jīng)多次重復(fù)實驗，14天時部分小鼠已經(jīng)形成主動脈夾層/主動脈瘤，并開始陸續(xù)死亡。

實施例2、小鼠tad模型組織切片檢測

1.冰凍切片：

在實驗結(jié)束時用戊巴比妥(100mg/kg)麻醉處死小鼠，采用肝素化生理鹽水進行心臟灌流，去除心臟殘留血液。用4％多聚甲醛繼續(xù)灌注，使血管組織形態(tài)原位固定。在體視顯微鏡下分離剪取主動脈弓部和降部，在4％多聚甲醛中浸泡固定2小時，后轉(zhuǎn)移至30％蔗糖溶液中4℃過夜，充分脫水。第二天從蔗糖溶液中取出血管，用濾紙充分吸干組織水分，將血管豎直包埋于oct包埋劑中，錫箔紙包繞后于液氮中緩慢凍凝，可貯存于-80℃冰箱。進行連續(xù)冰凍組織切片，厚度5μm，用多聚賴氨酸涂層玻片貼片。

2.石蠟切片：

在實驗結(jié)束時用戊巴比妥(100mg/kg)麻醉處死小鼠，采用肝素化生理鹽水進行心臟灌流，去除心臟殘留血液。在體視顯微鏡下分離剪取主動脈弓部，放于10％甲醛溶液中固定；將正常主動脈和tad組織放于10％甲醛溶液中固定。至少24小時后取出血管進行脫水處理，并用石蠟包埋組織(血管豎直向下)。切片時采用連續(xù)切片，厚度5μm，用多聚賴氨酸涂層玻片貼片。

實施例3、小鼠tad模型組織病理學(xué)檢測：

i.通過彈力纖維染色觀察彈力板情況，

具體操作如下：

1.1.冰凍切片：

(1)冰凍切片pbs中洗去oct；

(2)加入1滴(100μl)lugol碘液(試劑a)孵育5分鐘，稍加水洗；

(3)加入1滴(100μl)硫代酸鈉(試劑b)處理5分鐘；

(4)用流水沖洗5分鐘，70％酒精稍洗；

(5)加入1滴(100μl)醛品紅染液(試劑c)，進行染色10分鐘，用70％酒精浸洗2次(每次約30秒，至切片不再脫色為止)，稍水洗；

(6)加入1滴(100μl)橙黃g染液(試劑d)染色10秒，稍水洗；

(7)95％酒精脫水5min；

(8)無水酒精脫水5min；

(9)二甲苯透明5min，封片；

2.石蠟切片：

(1)石蠟切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級不同濃度的乙醇將石蠟切片脫蠟至水：二甲苯i(20min)→二甲苯ii(20min)→二甲苯iii(20min)→100％酒精(5min)→95％酒精(5min)→80％酒精(5min)→自來水洗去酒精。

(2)加入1滴(100μl)lugol碘液(試劑a)孵育5分鐘，稍加水洗；

(3)加入1滴(100μl)硫代酸鈉(試劑b)處理5分鐘；

(4)用流水沖洗5分鐘，70％酒精稍洗；

(5)加入1滴(100μl)醛品紅染液(試劑c)，進行染色10分鐘，用70％酒精浸洗2次(每次約30秒，至切片不再脫色為止)，稍水洗；

(6)加入1滴(100μl)橙黃g染液(試劑d)染色10秒，稍水洗；

(7)95％酒精脫水5min；

(8)無水酒精脫水5min；

(9)二甲苯透明5min，封片；

采用nikoneclipse90i顯微鏡觀察，彈力纖維呈藍(lán)紫色，背景呈不同程度黃色。彈力板內(nèi)側(cè)為新生內(nèi)膜部分。

結(jié)果顯示，bapn誘導(dǎo)后，小鼠tad模型在2周后已經(jīng)出現(xiàn)內(nèi)皮損傷，而在三周時候雖然已出現(xiàn)夾層，但是大體上仍無明顯變化。我們對比大體情況，彈力蛋白和內(nèi)皮損傷后發(fā)現(xiàn)，相比于前者，內(nèi)皮損傷出現(xiàn)最早也最靈敏(圖1)，提示我們關(guān)注內(nèi)皮下結(jié)構(gòu)，從而為早期診斷提供潛在靶點。

ii.通過免疫熒光染色染色觀察血管壁結(jié)構(gòu)，具體如下：

1.檢測不同膠原的管壁定位：

(1)冰凍切片pbs中洗去oct；

(2)4％的多聚甲醛固定10min，pbs洗3遍。

(3)血清封閉30min

(4)一抗固定，過夜。

(coli，兔，1：500，圖2上，左1)

(coliii，兔，1：500，圖2上，左2)

(coliv，兔，1：500，圖2上，左3)

(ec，大鼠，1：500，圖2上全部)

(5)室溫平衡30min，pbs洗三遍。

(6)二抗40min，pbs洗三遍。

(抗兔，紅色，1：1000)

(抗大鼠，綠色，1：1000)

(7)dapi封片。

(8)顯微鏡下觀察標(biāo)本形態(tài)。

2.檢測造模不同時期coliv表達(dá)量的變化：

(1)冰凍切片pbs中洗去oct；

(2)4％的多聚甲醛固定10min，pbs洗3遍。

(3)血清封閉30min

(4)一抗固定，過夜。

(coliv，兔，1：500，圖2中)

(a-sma,，鼠，1：500，圖2中)

(5)室溫平衡30min，pbs洗三遍。

(6)二抗40min，pbs洗三遍。

(抗兔，綠色，1：1000)

(抗鼠，紅色，1：1000)

(7)dapi封片。

(8)顯微鏡下觀察標(biāo)本形態(tài)。

3.天狼星紅(siriusred)苦味酸染色，輔助定位各型膠原

(1)石蠟切片厚4～6μm，脫蠟至水。

(2)入天青石藍(lán)液5～10min。

(3)蒸餾水沖洗3次。

(4)天狼星紅飽和苦味酸液15～30min；(可用harris蘇木素液淡染細(xì)胞核)。

(5)直接用無水乙醇分化與脫水。

(6)二甲苯透明、光學(xué)樹膠封固。

偏振光顯微鏡下觀察：

ⅰ型膠原纖維：紅色或黃色，排列緊密，具強雙折光性。

ⅱ型膠原纖維：多種色彩，疏松網(wǎng)狀、弱雙折光性。

ⅲ型膠原纖維：綠色、細(xì)纖維、弱雙折光性。

ⅳ型膠原纖維：淡黃色、弱雙折光性(基膜成分)。

結(jié)果顯示，相比于其他兩種血管中含量豐富的膠原(coli，coliii)，coliv特異性定位于血管內(nèi)皮下基底膜，是血管損傷后第一層暴露的部分，可以在極早期發(fā)現(xiàn)動脈損傷；此外，在sham,bapn1w,2w,3w,4w這幾個時間點分別對coliv進行染色發(fā)現(xiàn)，coliv內(nèi)皮下表達(dá)量隨著模型時間而逐漸增加(圖2)，以上證明coliv可以作為早期胸主動脈夾層/主動脈瘤的分子靶點。

實施例4、四型膠原靶向材料c4tca的構(gòu)建

為進一步在活體的情況下檢測早期胸主動脈夾層/主動脈瘤，使用mri核磁標(biāo)記物進一步標(biāo)記coliv-rhb，合成c4tca，所述的c4tca的合成步驟為：

(1)取12.7mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化過的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四羧酸(dota)，即nhs-dota溶解于1ml的去離子水中，向其中加入8mg的碳酸氫鈉，室溫磁力攪拌10-20分鐘，使其羧基充分鹽化。

(2)取9.4mg的六水合氯化釓溶解于200μl的去離子水中，將所得的溶液緩慢的滴加入實例4(1)的溶液中，室溫磁力攪拌12小時，使其充分絡(luò)合。

(3)取20mg的羅丹明b修飾的四型膠原的靶向多肽(rhb-coliv)在避光的環(huán)境下溶解于800μl的水中，將所得的溶液加入實例4(2)最終得到的溶液里，避光環(huán)境下室溫磁力攪拌12小時，所得的混合液通過1000mw的透析膜超濾提純，最終溶液通過凍干的方式得到紅色絮狀固體c4tca，所有的后處理全程避光。

實施例5、靶向材料c4tca在mri在體條件和病理切片下早期診斷主動脈瘤

使用如上所述bapn喂水2周小鼠進行試驗。

1)將小鼠氣麻下眶靜脈注射實施例4制備的c4tca材料1.5mg。

2)靜置30min，使材料充分經(jīng)過血液循環(huán)后再次進行氣麻

3)接入心電、呼吸門控，放入7tmri儀器

4)使用tise序列對于整段主動秒弓降部，腹主動脈腎上部進行斷層掃描。

5)將小鼠血管病變部分提取并制成冰凍切片，晾干后直接dapi封片，鏡下觀察材料熒

光并與mri結(jié)果比對分析，確定mri信號增強部分是否確實出現(xiàn)病生理改變。

結(jié)果顯示，在動脈瘤模型第14天，部分小鼠出現(xiàn)主動脈弓降部信號增強，而在病理切片下正是此時血管確實出現(xiàn)內(nèi)皮損傷；而那些并未出現(xiàn)信號增強的血管并未看到內(nèi)皮/中層病生理改變(圖3)，說明基于coliv為靶點的mri、熒光雙探針c4tca可以在早期特異性發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮損傷，從而監(jiān)測tad的發(fā)生。

實施例6、coliv-gb在mri在體條件下早期診斷主動脈瘤

使用如上所述bapn喂水2周小鼠進行試驗。

1)將小鼠氣麻下眶靜脈注射實施例4制備的coliv-gb材料1.3mg。

2)靜置30min，使材料充分經(jīng)過血液循環(huán)后再次進行氣麻

3)接入心電、呼吸門控，放入7tmri儀器

4)使用tise序列對于整段主動秒弓降部，腹主動脈腎上部進行斷層掃描。

結(jié)果顯示，針對同樣的小鼠bapn模型在單獨使用coliv-gb時，在在體mri診斷條件下，能夠取得和c4tca相似的診斷結(jié)果，表明coliv-gb和c4tca一樣，也能夠在早期特異性發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮損傷，從而監(jiān)測tad的發(fā)生。

最后需要說明的是，以上實施例僅用作幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)，不用做對本發(fā)明保護范圍的限定。

sequencelisting

<110>北京市心肺血管疾病研究所

<120>四型膠原作為靶點在早期診斷主動脈瘤/夾層中的應(yīng)用

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>11

<212>prt

<213>coliv-peptide

<400>1

cysglyglyglylysproleuvaltrpleulys

1510