本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種gnrh抗原及其在主動(dòng)免疫對(duì)公牛的去勢(shì)效果及肉品質(zhì)影響中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：家畜去勢(shì)是一種控制家畜性欲和繁殖能力的有效方法，不僅使得家畜變得溫馴便于飼養(yǎng)管理、提高飼料報(bào)酬，還能夠改善肉質(zhì)、提高胴體品級(jí)。未閹割的公豬胴體中含有睪丸間質(zhì)細(xì)胞生成的雄烯酮，使得豬肉在加熱過(guò)程中產(chǎn)生“腥膻味”，嚴(yán)重影響豬肉品質(zhì)(matthewskretal,2000)；公牛、公羊常會(huì)因性情兇暴而發(fā)生相互打斗、傷及同類和飼養(yǎng)人員的現(xiàn)象，同時(shí)完整公牛胴體還存在著肉質(zhì)嫩度差、質(zhì)地粗糙和膻味等問(wèn)題，去勢(shì)已是生產(chǎn)高檔牛肉常采用的重要方法之一(livestockscience，2010,131(2)：218-221)；母牛在性成熟后會(huì)出現(xiàn)周期性發(fā)情，易引起牛群混亂，導(dǎo)致無(wú)計(jì)劃懷孕進(jìn)而影響育肥效果(priceeo,2003)。目前畜牧業(yè)最常采用的還是外科閹割方法，傳統(tǒng)的去勢(shì)手術(shù)常會(huì)造成傷口感染，引起動(dòng)物高度應(yīng)激反應(yīng)，提高發(fā)病率和死亡率。尤其在非麻醉的狀態(tài)下殘忍手術(shù)廣被動(dòng)物保護(hù)主義者所詬病，且在施術(shù)過(guò)程中對(duì)醫(yī)務(wù)人員的安全構(gòu)成威脅，已不能適應(yīng)現(xiàn)代集約化畜牧業(yè)發(fā)展的需要。另外，手術(shù)閹割完全摘除了公畜睪丸，使得睪丸中一些分泌控制早期生長(zhǎng)發(fā)育的激素受到阻斷而造成閹畜體型單薄、發(fā)育緩慢從而降低了家畜的生產(chǎn)性能。由此可見(jiàn)，運(yùn)用新方法取代傳統(tǒng)去勢(shì)術(shù)勢(shì)在必行。促性腺激素釋放激素(gonadotrpin-releasinghormone,gnrh)是由動(dòng)物下丘腦分泌的一種十肽激素，其主要生物學(xué)功能是與腦垂體促性腺激素分泌細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合，刺激合成并分泌促黃體素(lh)及促卵泡素(fsh)，這些激素能夠促進(jìn)性腺及性器官的正常發(fā)育(duboiseaetal,2002)，所以通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄕ{(diào)控gnrh的分泌或干擾其功能，就能夠達(dá)到控制動(dòng)物生殖器官發(fā)育和生殖功能的目的。目前，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者已在多種動(dòng)物上開(kāi)展了利用gnrh主動(dòng)免疫的方法使動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗gnrh抗體以中和內(nèi)源性gnrh的研究(zengx,2002；millerla,2004；dalinam,2002；melchess,2007；chaleamchat,2016；bothaae,2016)，證實(shí)gnrh主動(dòng)免疫能夠替代傳統(tǒng)手術(shù)去勢(shì)，控制動(dòng)物性行為和繁殖能力，且具有一定的改善動(dòng)物肉質(zhì)，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高飼料利用率的作用(zamaratskaiagetal,2008)。gnrh作為由9種不同氨基酸殘基構(gòu)成的短肽，分子量?jī)H為1.181kda，導(dǎo)致其本身不具備免疫原性，因此它需要與大分子載體蛋白結(jié)合后來(lái)提高其免疫原性，但多數(shù)以gnrh單體或并列體與載體蛋白連接后免疫動(dòng)物效果并不理想(cuisetal,2003)；此外研究表明在天然的gnrh分子結(jié)構(gòu)上替換第6、10位氨基酸能夠使其與gnrh受體結(jié)合力有效提高100-200倍(marziehah,2010)。gnrh對(duì)于哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)的調(diào)控是一把雙刃劍，正常生理劑量下的gnrh能夠明顯升高血液中fsh和lh的含量，但大劑量的外源性gnrh能夠降低其體內(nèi)內(nèi)源性gnrh分泌量，致使性腺萎縮。近年來(lái)，國(guó)外一些學(xué)者開(kāi)展了對(duì)gnrh免疫動(dòng)物的試驗(yàn)研究，但是由于他們所用的gnrh半抗原的結(jié)構(gòu)及單體數(shù)目不同，免疫結(jié)果存在著很大的差異。gnrh單體與載體蛋白結(jié)合后作為抗原時(shí)，免疫動(dòng)物后發(fā)現(xiàn)其效果并不理想(sabeurketal,2003)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供gnrh衍生體。本發(fā)明提供的gnrh衍生體，為在多個(gè)串聯(lián)的gnrh抗原單體間插入能形成α螺旋的短肽，得到gnrh衍生體；所述gnrh抗原單體為將促性腺激素釋放激素gnrh氨基酸序列中(從n端起)第6位甘基酸替換為d型賴氨酸，得到多肽。上述gnrh衍生體中，所述能形成α螺旋的短肽為mal(從n端起一次由met,ala,leu三個(gè)氨基酸殘基組成的短肽)。上述gnrh衍生體中，所述gnrh衍生體為2個(gè)或4個(gè)串聯(lián)的gnrh抗原單體間插入所述能形成α螺旋的短肽，得到gnrh衍生體；或所述gnrh衍生體的氨基酸序列的(從n端起)第一個(gè)和/或最后一個(gè)氨基酸殘基分別進(jìn)行磷酸化修飾和氨基修飾。上述gnrh衍生體為如下1)或2)：1)所示的gnrh衍生體的氨基酸序列為序列3，且第一個(gè)氨基酸殘基磷酸化修飾，且最后一個(gè)氨基酸殘基氨基修飾；2)所示的gnrh衍生體的氨基酸序列為序列7，且第一個(gè)氨基酸殘基磷酸化修飾，且最后一個(gè)氨基酸殘基氨基修飾。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種gnrh衍生體復(fù)合物。本發(fā)明提供的gnrh衍生體復(fù)合物，為將上述衍生體與載體蛋白偶聯(lián)，得到的復(fù)合物。上述的復(fù)合物中，所述衍生物與所述載體蛋白的偶聯(lián)比為80％。上述衍生體或上述的復(fù)合物在制備如下1)8)中任一種產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍：1)雄性動(dòng)物去勢(shì)疫苗；2)降低雄性動(dòng)物體重和/或睪丸重量產(chǎn)品；3)降低雄性動(dòng)物血清中促卵泡素fsh、促黃體素lh和/或睪酮t含量產(chǎn)品；4)用于雄性動(dòng)物去勢(shì)產(chǎn)品；5)降低雄性動(dòng)物垂體生殖相關(guān)基因mrna表達(dá)水平產(chǎn)品；6)降低雄性動(dòng)物的攻擊行為和/或性行為產(chǎn)品；7)抑制雄性動(dòng)物的睪丸生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)品；8)提高雄性動(dòng)物的胴體的營(yíng)養(yǎng)水平產(chǎn)品。本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，包括上述衍生體或上述的復(fù)合物；所述產(chǎn)品具有如下1)-8)中至少一種功能：1)雄性動(dòng)物去勢(shì)；2)降低雄性動(dòng)物體重和/或睪丸重量；3)降低雄性動(dòng)物血清中促卵泡素fsh、促黃體素lh和/或睪酮t含量；4)用于雄性動(dòng)物去勢(shì)；5)降低雄性動(dòng)物垂體生殖相關(guān)基因mrna表達(dá)水平；6)降低雄性動(dòng)物的攻擊行為和/或性行為；7)抑制雄性動(dòng)物的睪丸生長(zhǎng)發(fā)育；8)提高雄性動(dòng)物的胴體的營(yíng)養(yǎng)水平。上述產(chǎn)品為疫苗；或，所述疫苗包括上述衍生體或上述的復(fù)合物和佐劑。上述中，所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，或，所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，所述哺乳動(dòng)物為小鼠或牛。本發(fā)明在抗原表位設(shè)計(jì)時(shí)，將gnrh第6位甘基酸由d型賴氨酸取代，這樣能夠有效減慢肽的降解，延長(zhǎng)半衰期，并使其余受體結(jié)合力增強(qiáng)至正常的100-200倍。此外通過(guò)增加串聯(lián)gnrh抗原的數(shù)量以及插入易于形成蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸等方法，能夠有效的提高gnrh抗原的免疫原性，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體識(shí)別“非己”成分的靈敏度，引起較強(qiáng)的免疫系統(tǒng)反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到提升免疫去勢(shì)效果的目的。本發(fā)明在gnrh抗原表位設(shè)計(jì)中，選擇用d型賴氨酸取代gnrh十肽的第6位甘氨酸，共設(shè)計(jì)了3種類型的gnrh抗原：1、利用串聯(lián)技術(shù)將gnrh單體串聯(lián)成為gnrh二串子、gnrh四串子，大大增加了gnrh抗原的分子量，使得其易被免疫系統(tǒng)識(shí)別。2、通過(guò)在gnrh單體間插入易于形成α螺旋與β折疊的氨基酸來(lái)改變抗原的分子構(gòu)象，以達(dá)到增強(qiáng)免疫原性的作用。3、雙半胱氨酸使得抗原由“平面化”變?yōu)椤傲Ⅲw化”，二硫鍵(-s-s-)是肽鏈上2個(gè)半胱氨酸殘基的巰基基團(tuán)脫氫發(fā)生氧化反應(yīng)形成的共價(jià)鍵，在蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)形成上起著一定的重要作用。本項(xiàng)目在設(shè)計(jì)時(shí)將二串子gnrh與四串子gnrh的c端與n端同時(shí)加上半胱氨酸，使其形成鏈內(nèi)二硫鍵，進(jìn)而由平面的單鏈肽變?yōu)榱Ⅲw的折疊肽，推測(cè)以上抗原表位設(shè)計(jì)原則能夠起到增強(qiáng)抗原免疫原性，提高免疫系統(tǒng)識(shí)別能力的作用。將以上gnrh抗原乳化后免疫雄鼠和奶公犢后，通過(guò)檢測(cè)試驗(yàn)動(dòng)物血清中抗gnrh抗體滴度和激素水平，發(fā)現(xiàn)當(dāng)gnrh串聯(lián)倍數(shù)相同個(gè)數(shù)時(shí)，插入易于形成α螺旋的氨基酸的gnrh疫苗免疫去勢(shì)效果最明顯，插入β折疊氨基酸的疫苗效果次之，而雙半胱氨酸串聯(lián)的gnrh疫苗基本無(wú)法起到免疫效果，表明gnrh多倍抗原經(jīng)易于形成α螺旋和β折疊的氨基酸修飾后，其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，成為易于被動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別的非自身分子，具有更高的免疫原性，而雙半胱氨酸結(jié)構(gòu)的疫苗免疫去勢(shì)效果較差，推測(cè)該抗原在合成的過(guò)程中并未形成預(yù)想的鏈內(nèi)二硫鍵“立體化折疊肽”；當(dāng)構(gòu)象變化類型相同時(shí)，二倍體α螺旋的效果的效果略優(yōu)于四倍體α螺旋，這與前人的研究結(jié)果并不一致(jinshuxetal,2004)，推測(cè)這可能是由于插入易于形成α螺旋氨基酸的原因，這種構(gòu)象的改變并不單再是倍數(shù)的疊加，而是數(shù)量與二級(jí)結(jié)構(gòu)的雙重作用，這種雙重作用也可能會(huì)引起四倍體α螺旋在經(jīng)過(guò)動(dòng)物血腦屏障時(shí)的阻礙，最終導(dǎo)致降低外源性的gnrh與其受體特異性結(jié)合能力。此外，在本項(xiàng)目中乳化佐劑采取白油span佐劑，白油span屬于油乳佐劑，能夠促進(jìn)細(xì)胞免疫。乳狀液在注射部位的貯存效應(yīng)能延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，緩慢釋放抗原，從而持續(xù)刺激機(jī)體，提高抗原的免疫原性。同時(shí)乳劑能夠包裹抗原，保護(hù)其不被體液中的酶迅速分解，延長(zhǎng)抗原刺激機(jī)體的時(shí)間。乳劑還會(huì)在注射部位引起細(xì)胞浸潤(rùn)，促使抗原呈遞細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等聚集和增殖，從而提高免疫應(yīng)答水平(aucoutuierjetal,2001)。免疫程序的設(shè)計(jì)上，為了維持小鼠和公犢牛體內(nèi)高水平的gnrh抗體，在初次免疫一月后加免一次，通過(guò)檢測(cè)免疫后血清中抗gnrh抗體滴度水平，發(fā)現(xiàn)加強(qiáng)免疫后抗體含量持續(xù)升高，隨后一直維持在較高水平直至試驗(yàn)期末，表明加強(qiáng)免疫可以使血清抗體濃度維持在較長(zhǎng)時(shí)間且較高水平，達(dá)到更長(zhǎng)期、更有效的免疫去勢(shì)效果，這個(gè)結(jié)果與ferrova等人的研究結(jié)果一致(2004)。利用外源性的gnrh主動(dòng)免疫動(dòng)物后能夠刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生大量的gnrh抗體以特異性的中和內(nèi)源性gnrh的活性。本實(shí)驗(yàn)中，gnrh主動(dòng)免疫雄鼠后產(chǎn)生了良好的抗體反應(yīng)，特別是二串子α螺旋的免疫去勢(shì)鼠，免疫后抗gnrh抗體滴度明顯高于對(duì)照組，該結(jié)果與turkstra等人的研究結(jié)果一致，他們將gnrh疫苗免疫公豬后，檢測(cè)其血清樣本同樣得到了較高水平的抗gnrh抗體(2011)(本發(fā)明的抗原序列不同，在小鼠試驗(yàn)結(jié)果二倍體α螺旋比單純二串子效果要好，但是由于試驗(yàn)動(dòng)物物種不同，不能說(shuō)明在公豬上二倍體α螺旋比單純二串子效果要好)。內(nèi)源性gnrh活性被中和，會(huì)抑制垂體促性腺激素(lh和fsh)及性腺激素(t)的合成與分泌，最終導(dǎo)致性腺萎縮。本實(shí)驗(yàn)中，gnrh主動(dòng)免疫雄鼠后，伴隨著抗體滴度的上升，c組血清中促性腺激素lh及fsh水平顯著下降(p＜0.05)。通過(guò)gnrh主動(dòng)免疫，由于gnrh抗體的中和作用，引起體內(nèi)gnrh水平降低，從而抑制了gnrh對(duì)促性腺激素的刺激作用，使促性腺激素的分泌量大大降低，這與hanxf等人利用gnrh主動(dòng)免疫小鼠的結(jié)果一致(2016)。t是雄性動(dòng)物體內(nèi)最主要的雄性激素，其生物學(xué)活性能夠刺激并維持附睪、副性腺等生殖器官的生長(zhǎng)發(fā)育，并對(duì)精子的啟動(dòng)、控制、維持及各級(jí)生精細(xì)胞的分化和成熟均起著重要作用。正常t的分泌主要是受腺垂體lh的控制。本研究顯示，使用gnrh免疫雄鼠后，t含量顯著低于空白組，說(shuō)明gnrh主動(dòng)免疫嚴(yán)重影響了睪丸間質(zhì)細(xì)胞的功能。lh分泌量的減少，降低了間質(zhì)細(xì)胞對(duì)lh的應(yīng)答反應(yīng)，致使睪酮的合成、分泌受到抑制。促性腺激素、睪酮是雄性動(dòng)物性腺發(fā)育必不可少的激素。gnrh主動(dòng)免疫，大大抑制了這些激素的分泌，從而間接的抑制了動(dòng)物性腺的發(fā)育，導(dǎo)致動(dòng)物性腺發(fā)生退行性變化。在試驗(yàn)中c組gnrh主動(dòng)免疫的雄鼠體重增長(zhǎng)緩慢，處死時(shí)睪丸重量與大小顯著低于對(duì)照組，表明gnrh二串子α螺旋主動(dòng)免疫可使雄鼠睪丸重量降低、萎縮，組織學(xué)切片顯示，免疫組睪丸曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞發(fā)育不良，生精小管中無(wú)精子，這表明該gnrh疫苗主動(dòng)免疫雄鼠具有很好地去勢(shì)作用，前人的研究也能夠很好地支持本發(fā)明的結(jié)論。gnrh是下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary-gonadalaxis,hpg)的關(guān)鍵信號(hào)分子，gnrh主動(dòng)免疫動(dòng)物，會(huì)影響雄性動(dòng)物下丘腦-垂體-睪丸軸的反饋調(diào)節(jié)，阻礙精子發(fā)生，進(jìn)而達(dá)到去勢(shì)效果。本實(shí)驗(yàn)中c組和g組小鼠經(jīng)gnrh主動(dòng)免疫后垂體中g(shù)nrhr、fshβ和lhβmrna的表達(dá)被顯著抑制，表明gnrh對(duì)gnrhr、fshβ和lhβmrna的正常表達(dá)具有顯著影響。gnrh的生物學(xué)效應(yīng)需通過(guò)gnrhr予以顯現(xiàn)，gnrhrmrna表達(dá)的減弱，提示gnrhr合成量可能受到抑制，gnrh主動(dòng)免疫不但阻止了內(nèi)源性gnrh激素向垂體的輸入，同時(shí)也下調(diào)了垂體gnrh受體的數(shù)量，降低了垂體對(duì)gnrh激素的反應(yīng)性。fshβ和lhβmrna表達(dá)水平顯著下調(diào)，進(jìn)一步從分子水平證實(shí)了gnrh主動(dòng)免疫通過(guò)阻止內(nèi)源性gnrh，達(dá)到垂體及下調(diào)垂體gnrh受體數(shù)量來(lái)抑制促性腺激素的合成與分泌，從而導(dǎo)致性腺發(fā)育遲緩。垂體分泌的fsh和lh分別與相應(yīng)性腺受體特異性結(jié)合，促進(jìn)性激素的合成及配子發(fā)生。本研究中，c組和g組gnrh主動(dòng)免疫顯著降低了睪丸fshr和lhrmrna表達(dá)水平，提示gnrh主動(dòng)免疫可能通過(guò)下調(diào)fshr和lhr基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)下調(diào)性腺fshr和lhr受體的數(shù)量。促性腺激素fshr和lhrmrna表達(dá)水平的下調(diào)可能是由于gnrh主動(dòng)免疫后血清fsh和lh激素的降低引起的。此外，還檢測(cè)了性激素結(jié)合蛋白(sexhormone-bindingglobulin,shbg)在不同免疫組中的表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)c組和g組gnrh主動(dòng)免疫使睪丸內(nèi)shbg的mrna表達(dá)量明顯下降。該基因在支持細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生睪丸特有的雄激素結(jié)合蛋白(androgen-bindingprotein,abp)，它分泌于睪丸的生精小管內(nèi)并且控制著睪酮的活性。shbg與雄激素有很強(qiáng)的親和力，能調(diào)節(jié)雄激素的分泌合成，并且影響精子的生成，進(jìn)而影響生殖功能。該基因mrna表達(dá)水平的顯著下降，提示c組和g組的gnrh去勢(shì)疫苗可能對(duì)睪丸支持細(xì)胞造成了損傷，該結(jié)果正好與我們的睪丸組織學(xué)切片結(jié)果一致，表明gnrh二串子α螺旋和四串子α螺旋抗原乳化后免疫雄鼠能夠有效的起到抑制精子生成，阻礙睪丸發(fā)育的作用。gnrh由下丘腦gnrh神經(jīng)元合成并儲(chǔ)存，通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸控制著動(dòng)物性腺激素的合成及配子發(fā)生。反過(guò)來(lái)，性激素通過(guò)反饋調(diào)節(jié)環(huán)作用于下丘腦或直接作用于垂體以間接或直接地影響促性腺激素的合成與分泌，從而維持生殖內(nèi)分泌的穩(wěn)態(tài)。所有下丘腦gnrh基因具有相同的基本結(jié)構(gòu)，其氨基酸序列在哺乳動(dòng)物中具有高度保守性。因而，選擇在雄鼠中產(chǎn)生良好去勢(shì)作用的c組和g組gnrh疫苗主動(dòng)免疫公犢牛，檢測(cè)血清中抗gnrh抗體滴度，發(fā)現(xiàn)c組和g組的gnrh抗原主動(dòng)免疫公牛后都產(chǎn)生了良好的免疫應(yīng)答，機(jī)體內(nèi)抗體水平明顯升高，特別是在第二次免疫后，抗體水平持續(xù)上升，并且一直維持在一個(gè)較高的水平。表明這兩種gnrh疫苗可有效刺激公犢牛機(jī)體的免疫記憶應(yīng)答，誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生特異性體液免疫，產(chǎn)生維持時(shí)間較長(zhǎng)、滴度高的特異性抗體，具有很強(qiáng)的免疫原性。促性腺激素、睪酮是雄性動(dòng)物性腺發(fā)育必不可少的激素，本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)免疫c組與對(duì)照組公牛血清激素水平，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)期間兩組fsh、lh和t平均水平有顯著差異，血清激素水平在注射c組gnrh抗原后2周內(nèi)明顯下降，4周時(shí)有所回升，此時(shí)進(jìn)行第二次免疫后激素水平逐漸下降至最低值，試驗(yàn)?zāi)┢谟谢厣厔?shì)，但仍明顯低于對(duì)照組。初次免疫后，血清激素含量并沒(méi)有發(fā)生太大變化，可能是由于初次免疫并沒(méi)有破壞下丘腦-垂體軸，加強(qiáng)免疫后，血清中抗gnrh抗體滴度顯著升高，下丘腦-垂體軸被破壞，血清激素含量隨之伴隨著顯著下降。以上結(jié)果表明這種gnrh免疫方法所造成的去勢(shì)是暫時(shí)的，有一定的時(shí)限，對(duì)于性腺功能有所保留，同時(shí)也說(shuō)明加強(qiáng)免疫能夠明顯提升去勢(shì)效果，延長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間。前人的研究中也有相似的報(bào)道，chantlersa等人利用gnrh疫苗主動(dòng)免疫公牛后也使得lh分泌量的減少，降低了間質(zhì)細(xì)胞對(duì)lh的應(yīng)答反應(yīng)，致使睪酮的合成、分泌受到抑制(chantlersaetal,2012；)。但在一些學(xué)者的研究中，發(fā)現(xiàn)利用gnrh主動(dòng)免疫公豬后，對(duì)于血清中抗體滴度以及t的分泌量并沒(méi)有顯著影響(claudiooetal,2016)，造成這種差異可能與試驗(yàn)動(dòng)物的品種、免疫劑量及性成熟程度等因素有關(guān)。通過(guò)對(duì)免疫前后的公犢牛睪丸組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)免疫c組睪丸組織發(fā)生明顯病變，生精細(xì)胞發(fā)育不良，生精小管中無(wú)精子，這種睪丸組織學(xué)變化與其他關(guān)于豬(stigetal,2011)、羊(ozdaletal,2010)的研究報(bào)道一致。一些學(xué)者對(duì)公豬進(jìn)行免疫去勢(shì)，發(fā)現(xiàn)免疫能夠顯著降低其睪丸組織大小、周長(zhǎng)和重量(fangfgetal,2010；carlbetal,2011)，發(fā)明人在試驗(yàn)期間紀(jì)錄試驗(yàn)動(dòng)物的睪丸周長(zhǎng)和極長(zhǎng)變化，發(fā)現(xiàn)免疫c組公犢牛的睪丸周長(zhǎng)和極長(zhǎng)均較對(duì)照組相比有所下降，屠宰后觀察大小，免疫組公牛睪丸明顯皺縮，體積減小，表明gnrh疫苗免疫引起垂體促性腺激素水平下降，延緩了性腺的發(fā)育，導(dǎo)致性腺發(fā)生一系列的表型變化，最終導(dǎo)致雄性動(dòng)物生育力下降甚至喪失。t的分泌水平與雄性動(dòng)物的攻擊行為和性行為密切相關(guān)。本試驗(yàn)中免疫去勢(shì)后觀察公犢牛的日常行為，發(fā)現(xiàn)未進(jìn)行免疫的公犢牛會(huì)頻繁出現(xiàn)爬跨現(xiàn)象，并且群體間打斗攻擊行為較強(qiáng),，而經(jīng)gnrh主動(dòng)免疫后的公犢牛爬跨現(xiàn)象及攻擊行為減少，性欲降低，但會(huì)出現(xiàn)被爬跨現(xiàn)象，同時(shí)免疫去勢(shì)組血清睪酮水平顯著低于空白對(duì)照組，表明雄性動(dòng)物的攻擊行為和性行為與血清中的睪酮濃度成正相關(guān)。以上結(jié)果提示gnrh主動(dòng)免疫不僅能夠用于安全高效的去勢(shì)，便于生產(chǎn)管理，同時(shí)通過(guò)減弱雄性動(dòng)物性行為和攻擊行為，將飼料供給的多余能量用于鞏固胴體膘情，增加飼料利用率，能夠起到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高生產(chǎn)性能的作用。為了進(jìn)一步探討gnrh疫苗對(duì)公牛肉品質(zhì)的影響，對(duì)屠宰后的第3和4肋間背最長(zhǎng)肌進(jìn)行了一系列的品質(zhì)測(cè)定。屠宰后(45min)免疫組與對(duì)照組牛肉ph值均在6.2左右，經(jīng)24h排酸后，免疫去勢(shì)c組與對(duì)照組牛肉的ph值下降至5.8左右，且兩種牛肉ph之間差距不大，免疫去勢(shì)c組牛肉ph值在排酸過(guò)程中變化較小，說(shuō)明免疫去勢(shì)c組牛肉在屠宰之后貯藏?fù)p失小，利于系水力的提高及貯存時(shí)間的延長(zhǎng)；免疫去勢(shì)組的干燥水分損失比對(duì)照組低5.62％，說(shuō)明經(jīng)gnrh免疫后的牛肉保水性能良好；免疫去勢(shì)c組牛肉剪切力略低于對(duì)照組牛肉，說(shuō)明gnrh免疫后的牛肉相對(duì)細(xì)嫩，口感較好；免疫去勢(shì)c組總氨基酸含量比對(duì)照組高8.37％，說(shuō)明經(jīng)gnrh免疫后的牛肉營(yíng)養(yǎng)更為豐富，推測(cè)該gnrh疫苗可能對(duì)提高肉制品的營(yíng)養(yǎng)水平具有一定的作用；此外，免疫c組牛肉中谷氨酸和甘氨酸含量分別為2.41％和0.6％，而對(duì)照組牛肉中谷氨酸和甘氨酸含量分別為2.12％和0.54％，均低于免疫去勢(shì)組(結(jié)果如圖5所示，檢測(cè)方法見(jiàn)后)，這兩種氨基酸均屬于風(fēng)味系氨基酸，表明經(jīng)gnrh抗原免疫后的牛肉具有更加良好的風(fēng)味；在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)免疫去勢(shì)c組的粗脂肪含量相對(duì)于對(duì)照組來(lái)說(shuō)有所降低，并且兩組肉質(zhì)的粗脂肪含量均低于我國(guó)肌內(nèi)脂肪含量的要求(7.3％)，推測(cè)這可能與所選擇的肉樣部位有關(guān)，取部位約為第3和4肋間背最長(zhǎng)肌，而肌內(nèi)脂肪含量測(cè)定時(shí)一般是根據(jù)第12和13肋間背最長(zhǎng)肌切面的可見(jiàn)脂肪劃分。在skrlepk等人的試驗(yàn)中，利用gnrh免疫公豬屠宰后，免疫組與完整對(duì)照組屠宰后ph45、ph24及剪切力的結(jié)果趨勢(shì)與一致，而免疫組肌間脂肪含量略高于完整對(duì)照組，但差異不顯著，與本發(fā)明的結(jié)果有所不同(2012)，這可能與試驗(yàn)物種以及最后測(cè)定時(shí)抽取樣品部位差異有關(guān)。一些學(xué)者比較gnrh免疫與手術(shù)閹割公豬對(duì)其胴體品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)與手術(shù)去勢(shì)法相比，gnrh免疫去勢(shì)會(huì)降低公豬肌間脂肪含量，增加豬肉剪切力值(dazaaetal,2016；martinez-macipemetal,2016)。以上結(jié)果均提示該gnrh二串子α螺旋疫苗對(duì)于提升公犢牛胴體品質(zhì)有一定的作用。雄性動(dòng)物垂體生殖相關(guān)基因?yàn)閒shβ、lhβ、gnrhr。提高雄性動(dòng)物的胴體的營(yíng)養(yǎng)水平具體體現(xiàn)在降低雄性動(dòng)物背最長(zhǎng)肌的剪切力、降低干燥水分損失、降低脂肪含量、降低蛋白質(zhì)含量和/或降低總氨基酸含量。雄性動(dòng)物背最長(zhǎng)肌為雄性動(dòng)物背第3和4肋間最長(zhǎng)肌。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)篩選出的gnrh二串子α螺旋疫苗主動(dòng)免疫雄鼠和公牛，對(duì)其睪丸重量、大小、長(zhǎng)度、血清抗gnrh抗體滴度及激素水平及垂體和睪丸組織生殖相關(guān)基因及其受體mrna表達(dá)水平具有顯著影響，可以使睪酮的生物學(xué)活性部分或完全喪失，發(fā)揮免疫去勢(shì)作用，加強(qiáng)免疫效果更佳，且對(duì)于免疫后的動(dòng)物胴體品質(zhì)有一定的提高。以上數(shù)據(jù)為深入探討gnrh調(diào)節(jié)動(dòng)物生殖的機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)，有助于開(kāi)發(fā)新型、高效、安全、可逆的動(dòng)物免疫去勢(shì)疫苗。附圖說(shuō)明圖1為新型gnrh衍生體的制備與gnrh-ova復(fù)合物的偶聯(lián)，(a)c組二串子α螺旋gnrh衍生體質(zhì)譜圖；(b)g組四串子α螺旋gnrh衍生體質(zhì)譜圖；(c)gnrh-ova復(fù)合物偶聯(lián)圖。圖2為新型gnrh衍生體對(duì)雄鼠免疫去勢(shì)效果的影響，(a)雄鼠對(duì)照組與免疫c組睪丸組織對(duì)比；(b)雄鼠血清抗gnrh抗體滴度；(c)雄鼠血清激素含量；(d)對(duì)照組雄鼠睪丸組織學(xué)分析；(e)免疫c組雄鼠睪丸組織學(xué)分析；(f)雄鼠垂體組織生殖相關(guān)基因mrna水平；(g)雄鼠睪丸組織生殖相關(guān)基因mrna水平。圖3為新型gnrh衍生體對(duì)公犢牛行為學(xué)及睪丸形態(tài)學(xué)的影響，(a)公犢牛gnrh疫苗頸部皮下免疫；(b)對(duì)照組公犢牛爬跨行為；(c)對(duì)照組公犢牛打斗行為；(d)免疫組公犢牛日常狀態(tài)；(e)免疫組公犢牛被爬跨行為；(f)公犢牛對(duì)照組與免疫c組睪丸組織對(duì)比。圖4為新型gnrh衍生體對(duì)公犢牛免疫去勢(shì)效果的影響，(a)公犢牛血清抗gnrh抗體滴度；(b)公犢牛血清fsh濃度；(c)公犢牛血清lh濃度；(d)公犢牛血清t濃度；(e)對(duì)照組公犢牛睪丸組織學(xué)分析；(f)免疫c組公犢牛睪丸組織學(xué)分析。圖5為新型gnrh衍生體對(duì)公犢牛肉品質(zhì)的影響，(a)gnrh衍生體對(duì)牛肉酸度的影響；(b)gnrh衍生體對(duì)牛肉剪切力的影響；(c)gnrh衍生體對(duì)牛肉干燥水分損失的影響；(d)gnrh衍生體對(duì)牛肉總蛋白含量的影響；(e)gnrh衍生體對(duì)牛肉總氨基酸含量的影響；(f)gnrh衍生體對(duì)牛肉肌間脂肪含量的影響；(g)gnrh衍生體對(duì)牛肉各氨基酸含量的影響。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中數(shù)據(jù)分析：熒光定量數(shù)據(jù)分析：以持家基因gapdh為參照，將小鼠對(duì)照組中的表達(dá)量定義為1，熒光實(shí)時(shí)定量pcr結(jié)果利用2-δδct法計(jì)算生殖相關(guān)基因在對(duì)照組和免疫組垂體組織和睪丸組織中的相對(duì)表達(dá)量，并利用spss(18.0)數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。對(duì)不同的處理組牛的血液激素含量，抗gnrh抗體的滴度及睪丸大小和重量進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，以上數(shù)據(jù)處理用sas軟件進(jìn)行分析。實(shí)施例1、gnrh疫苗的制備1、gnrh衍生體的獲得自然界中g(shù)nrh短肽共由9種氨基酸組成，分別為谷氨酸、組氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸及脯氨酸，本試驗(yàn)中將gnrh短肽中第6位甘基酸由d型賴氨酸取代，共設(shè)計(jì)4種類型gnrh抗原表位，共表1所示的8個(gè)gnrh衍生體，這8個(gè)gnrh衍生體分別為：小分子的gnrh抗原串聯(lián)、雙半胱氨酸串聯(lián)、插入易于形成α螺旋的短肽mal、插入易形成β折疊的短肽viy(抗原表位序列見(jiàn)表1)。表1為gnrh衍生體氨基酸序列將上述表1所示的8個(gè)gnrh衍生體a-h由上海吉爾生化有限責(zé)任公司合成，經(jīng)高效液相色譜(hplc)純化，純度＞90％。c組二串子α螺旋的gnrh衍生體質(zhì)譜圖如圖1a所示。g組四串子α螺旋的gnrh衍生體質(zhì)譜圖如圖1b所示。2、gnrh疫苗的制備1)gnrh-ova復(fù)合將上述1得到的8個(gè)gnrh衍生體a-h分別采用碳二亞胺法與載體蛋白o(hù)va(購(gòu)自solarbio公司，產(chǎn)品目錄號(hào)：326a0515)連接，得到gnrh-ova復(fù)合物；具體如下：分別稱取等質(zhì)量的10mg上述1得到的8個(gè)gnrh衍生體a-h和10mgova，分別與等體積去離子水混合，然后將兩者混合，形成ova-gnrh混合物，再將200mgedc.hcl(碳二亞胺鹽酸鹽，購(gòu)自solarbio公司，產(chǎn)品目錄號(hào)：20150522)溶解于適量雙蒸水中，緩慢加入上述混合物中，用磁力攪拌器不斷攪拌6h以上，然后將反應(yīng)液裝入10kd透析袋中，透析48h，每4-6h換水一次。透析后的液體即為gnrh與ova的偶聯(lián)產(chǎn)物(gnrh-ova)溶液。凍干后得到8種gnrh-ova復(fù)合物a-h(偶聯(lián)比為80％)。檢測(cè)gnrh-ova復(fù)合物的偶聯(lián)率，結(jié)果如圖1c所示，以上8組gnrh-ova復(fù)合物的偶聯(lián)率均達(dá)80％，表明該gnrh-ova復(fù)合物可以用于后續(xù)gnrh免疫疫苗的乳化制備。2)添加佐劑將上述1)得到的8種gnrh-ova復(fù)合物a-f分別溶于pbs(ph＝7.4)中，用span白油佐劑(由礦物油mineraloil(購(gòu)自solarbio公司，產(chǎn)品目錄號(hào)：703c055)、span85(購(gòu)自sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)：mkbt4291v)和tween85(購(gòu)自sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)：mkbr3983v)構(gòu)成))充分乳化，乳化過(guò)程如下：a水相：稱取gnrh-ova溶于適量0.85％nacl中；b礦物油；cspan85和tween85(乳化劑)的混合物，體積比為54：46；組分a、b、c的體積比為8：9：1。先將組分b和組分c按比例充分混勻，然后使用乳化儀邊攪拌邊逐滴加入組分a，10000rpm持續(xù)攪拌5min。制成抗原乳劑，-20℃保存?zhèn)溆?，得?種gnrh疫苗a-h。將制備好的8種gnrh疫苗a-h分別密封后放置于4℃恒溫環(huán)境中，觀察乳液性狀，無(wú)分層情況，性狀保持良好；并將乳化液滴與純凈水上靜置，無(wú)散開(kāi)、破乳現(xiàn)象，說(shuō)明8種gnrh疫苗a-h穩(wěn)定性較好，可用于后期免疫試驗(yàn)。實(shí)施例2、gnrh疫苗的應(yīng)用一、gnrh疫苗免疫小鼠小試試驗(yàn)1、試驗(yàn)動(dòng)物取1月齡，體重相近的健康雄性小鼠(購(gòu)自石河子大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心)27只，隨機(jī)分為9組，分別設(shè)定為對(duì)照組、a組、b組、c組、d組、e組、f組、g組、h組；2、免疫免疫組a-h：于1月齡時(shí)分別向a-h這8組雄鼠采取腿部肌肉注射的方法對(duì)應(yīng)免疫1ml實(shí)施例1獲得的8種gnrh疫苗a-h(含gnrh約50μg)；4周后以相同劑量與注射方法對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物加強(qiáng)免疫一次。對(duì)照組：試驗(yàn)動(dòng)物免疫由生理鹽水與佐劑乳化后的疫苗，試驗(yàn)期間飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同。3、檢測(cè)1)小鼠體重及睪丸重量的變化小鼠試驗(yàn)中，將初次免疫時(shí)間記為0dpv(daypostvaccination)，加強(qiáng)免疫時(shí)間記為70dpv(daypostvaccination)，檢測(cè)初次免疫和加強(qiáng)免疫時(shí)小鼠體重。結(jié)果如表2所示表2為免疫組與對(duì)照組雄鼠體重及睪丸重量的變化(g)由表2可知，免疫前，免疫組和對(duì)照組雄鼠的平均體重?zé)o明顯差異(p＞0.05)。gnrh主動(dòng)免疫兩次后，免疫組雄鼠的體重較對(duì)照組相比，增重緩慢，其中b組雄鼠的體重與對(duì)照組相比，差異不顯著(p＞0.05)，c組雄鼠的初免后70dpv體重與對(duì)照組相比，差異極顯著(p＜0.01)，其余各組體重與對(duì)照組相比，差異顯著(0.01＜p＜0.05)；在第二次免疫后第8周采集眼眶動(dòng)脈血后，9組試驗(yàn)雄鼠斷頸法處死后，迅速分離出垂體和單側(cè)睪丸置于液氮中，用于生殖相關(guān)基因mrna水平測(cè)定；另一單側(cè)睪丸剝離附睪后，在電子天平上稱取重量，將1cm3大小單側(cè)睪丸組織置于4％中性甲醛中固定，用于制作石蠟切片。檢測(cè)睪丸重量，結(jié)果如表2所示，試驗(yàn)雄鼠睪丸重量與對(duì)照組相比，a組、b組差異不顯著(p＞0.05)，c組、g組差異極顯著(p＜0.01)，其余各組睪丸重量與對(duì)照組相比，差異顯著(0.01＜p＜0.05)。比較免疫組與對(duì)照組小鼠睪丸組織，發(fā)現(xiàn)體積明顯減小(圖2a)。以上數(shù)據(jù)可知，gnrh疫苗免疫會(huì)對(duì)雄鼠的體重及睪丸重量產(chǎn)生較大的影響，gnrh疫苗免疫能夠有效降低雄鼠的體重及睪丸重量2)小鼠血清抗gnrh抗體及激素含量試驗(yàn)雄鼠于第二次免疫后第8周采集眼眶動(dòng)脈血樣1.5ml，3000rpm離心15min，分離血清，-20℃保存，用于后續(xù)血清激素及抗體含量測(cè)定。采用elisa法檢測(cè)血清中g(shù)nrh抗體(小鼠促性腺激素釋放激素抗體gnrh-abelisa試劑盒)、促卵泡素fsh(小鼠促卵泡素fshelisa試劑盒)、促黃體素lh(小鼠促黃體素lhelisa試劑盒)、睪酮t(小鼠睪酮telisa試劑盒)的含量，試劑盒均購(gòu)自上海藍(lán)基生物技術(shù)有限公司，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。測(cè)定試驗(yàn)鼠血清中抗gnrh抗體滴度結(jié)果如圖2b所示，gnrh主動(dòng)免疫的雄鼠部分產(chǎn)生了良好的免疫反應(yīng)，其中c組產(chǎn)生的抗gnrh抗體含量最高，g組次之，b組的抗體含量與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。各組雄鼠主動(dòng)免疫后血清中fsh、lh、t含量變化見(jiàn)圖2c，對(duì)照組試驗(yàn)期末fsh、lh、t含量分別為4.91ng/μl、14.59ng/μl、3.08ng/μl，8組試驗(yàn)雄鼠中，c組免疫去勢(shì)效果最好，試驗(yàn)期末fsh、lh、t含量分別為4.41ng/μl、8.19ng/μl、2.026ng/μl，均顯著低于對(duì)照組激素濃度?？梢钥闯?，gnrh疫苗免疫小鼠后，血清中可產(chǎn)生抗gnrh抗體，且血清中的促卵泡素fsh、促黃體素lh、睪酮t含量降低。3)小鼠睪丸組織石蠟切片分析將單側(cè)睪丸組織置于4％中心甲醛中固定，每個(gè)樣品組織石蠟切片連續(xù)切10張6μm厚度切片，經(jīng)he染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)正常，各級(jí)生精細(xì)胞發(fā)育良好，排列緊密，管腔內(nèi)有大量精子生成(如圖2d)；免疫c組睪丸曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞發(fā)育不良，數(shù)量減少且排列稀疏，生精小管中無(wú)精子生成(如圖2e)。表明該gnrh抗原c主動(dòng)免疫小鼠后具有良好的去勢(shì)作用。4)小鼠垂體、睪丸組織生殖相關(guān)基因mrna水平測(cè)定分別取免疫組b、c、g和對(duì)照組試驗(yàn)雄鼠的垂體組織和睪丸組織100mg于1mltrizol中，用苯酚-氯仿法提取總rna，反轉(zhuǎn)錄后獲得cdna用于real-timeqpcr分析(生殖相關(guān)基因引物設(shè)計(jì)序列見(jiàn)表3)。表3為垂體組織及睪丸組織生殖相關(guān)基因引物采用sybrgreenⅰ染料法分別檢測(cè)生殖相關(guān)基因在對(duì)照組和免疫組垂體組織和睪丸組織中的mrna表達(dá)水平，每組各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并設(shè)置相應(yīng)的陰性對(duì)照(擴(kuò)增模板為雙蒸水)。gnrh衍生體主動(dòng)免疫對(duì)垂體生殖相關(guān)基因mrna表達(dá)水平的影響如圖2f所示，與對(duì)照組相比，c組和g組gnrh抗原主動(dòng)免疫極顯著下調(diào)fshβ、lhβ、gnrhr、tshβ及ghmrna表達(dá)水平(p＜0.01)，且c組各基因mrna表達(dá)水平低于g組，而b組gnrh抗原主動(dòng)免疫顯著下調(diào)fshβ、lhβ、tshβ及ghmrna表達(dá)水平(0.01＜p＜0.05)，對(duì)gnrhrmrna的表達(dá)沒(méi)有顯著影響(p＞0.05)。睪丸基因mrna表達(dá)變化如圖2g所示，c組gnrh抗原主動(dòng)免疫后睪丸中fshr、lhr、inhα和shbgmrna均顯著低于對(duì)照組(0.01＜p＜0.05)，g組睪丸組織生殖相關(guān)基因的mrna表達(dá)水平與對(duì)照組相比也均有下調(diào)，但差異不顯著(p＞0.05)，b組僅lhr基因mrna水平低于對(duì)照組，其他基因表達(dá)量較對(duì)照組相比有所上調(diào)?？梢钥闯觯琯nrh疫苗免疫后，小鼠垂體生殖相關(guān)基因fshβ、lhβ、gnrhr表達(dá)量下降。因此，從上述可以看出，免疫小鼠所用的疫苗中b、c、g三種類型的疫苗對(duì)于小鼠去勢(shì)效果好。二、gnrh疫苗免疫牛中試試驗(yàn)1、動(dòng)物取7月齡，體重相近的健康公犢牛12頭，隨機(jī)分為4組，分別設(shè)定為對(duì)照組、b組、c組、g組，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、免疫免疫組：公犢牛7月齡時(shí)，用選取gnrh疫苗b、gnrh疫苗組c、gnrh疫苗g這三種疫苗分別采取頸部皮下注射的方法免疫1ml(含gnrh約500μg)；4周后以相同劑量與注射方法對(duì)各試驗(yàn)動(dòng)物加強(qiáng)免疫一次(圖3a)。對(duì)照組：試驗(yàn)動(dòng)物免疫由生理鹽水與佐劑乳化后的疫苗，試驗(yàn)期間飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同。3、檢測(cè)1)日常行為加強(qiáng)免疫15天后觀察公犢牛的日常行為，發(fā)現(xiàn)未進(jìn)行免疫的公犢牛會(huì)頻繁出現(xiàn)爬跨現(xiàn)象(圖3b)，并且群體間有打斗攻擊行為(圖3c)，而經(jīng)gnrh主動(dòng)免疫后的公犢牛無(wú)爬跨現(xiàn)象及攻擊行為(圖3d)，但會(huì)出現(xiàn)被爬跨現(xiàn)象(圖3e)，說(shuō)明gnrh主動(dòng)免疫能夠有效的降低動(dòng)物的攻擊行為和性行為。2)奶公犢體重及睪丸長(zhǎng)度(周長(zhǎng)、極長(zhǎng))的變化初次免疫當(dāng)天記為0wpv(weekspostvaccination)，試驗(yàn)公牛于0wpv，14wpv記錄睪丸周長(zhǎng)、極長(zhǎng)數(shù)據(jù)。試驗(yàn)期間定期采集奶公犢睪丸長(zhǎng)度數(shù)據(jù)如表4所示，表4免疫組與對(duì)照組公牛體重及睪丸周長(zhǎng)、極長(zhǎng)的變化(cm)對(duì)照bcg0wpv睪丸周長(zhǎng)28.3±0.828.9±0.528.7±0.728.5±0.814wpv睪丸周長(zhǎng)32.6±0.532.5±0.330.1±0.430.6±0.60wpv睪丸極長(zhǎng)10.8±0.210.9±0.111.3±0.310.6±0.414wpv睪丸極長(zhǎng)13.8±0.513.3±0.411.3±0.212.3±0.5可以看出，gnrh主動(dòng)免疫c組和g組的公牛，其睪丸周長(zhǎng)、極長(zhǎng)增長(zhǎng)緩慢，隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)縮短，表明注射gnrh免疫去勢(shì)疫苗能夠阻礙睪丸發(fā)育，顯著降低睪丸重量。b組免疫去勢(shì)疫苗對(duì)于公牛睪丸周長(zhǎng)、極長(zhǎng)的影響差異不顯著(p＞0.05)。試驗(yàn)?zāi)┢谀坦珷偻涝缀笕蝹?cè)睪丸組織，觀察對(duì)照組與免疫組公牛睪丸大小的對(duì)比圖，發(fā)現(xiàn)gnrh主動(dòng)免疫公犢牛后，c組睪丸體積減小約1/3，睪丸重量降低，嚴(yán)重皺縮(圖3f)。說(shuō)明免疫c組公牛睪丸生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制。結(jié)合小鼠試驗(yàn)數(shù)據(jù)，推測(cè)在b、c、g三種類型的疫苗中，插入易于形成α螺旋的氨基酸的gnrh疫苗(c組)免疫去勢(shì)效果最明顯，而雙半胱氨酸串聯(lián)的gnrh疫苗(b組)基本無(wú)法起到免疫效果。3)奶公犢血清抗gnrh抗體及激素含量初免當(dāng)天起每2周采集試驗(yàn)公牛尾靜脈血樣1.5ml，即2wpv，4wpv，6wpv，8wpv，10wpv，12wpv，14wpv，直至屠宰，采集血樣3000rpm離心15min，分離血清，-20℃保存，用于后續(xù)血清激素及抗體含量測(cè)定。采用elisa法檢測(cè)血清中g(shù)nrh抗體(牛促性腺激素釋放激素抗體gnrh-abelisa試劑盒)、促卵泡素fsh(牛促卵泡素fshelisa試劑盒)、促黃體素lh(牛促黃體素lhelisa試劑盒)、睪酮t(牛睪酮telisa試劑盒)的含量，試劑盒均購(gòu)自上海藍(lán)基生物技術(shù)有限公司，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行?？筭nrh抗體含結(jié)果如圖4a所示，箭頭表示免疫時(shí)間，初次免疫(4wpv)后c、g兩組公牛血清抗gnrh抗體含量開(kāi)始升高，加免前免疫組血清抗gnrh抗體濃度與對(duì)照組無(wú)顯著差異(p＞0.05)，8wpv加強(qiáng)免疫后抗體含量持續(xù)升高，隨后一直維持在較高水平直至試驗(yàn)期末，較對(duì)照組相比抗gnrh抗體含量差異極顯著(p＜0.01)，表明加強(qiáng)免疫可以使血清抗體濃度維持在較長(zhǎng)時(shí)間且較高水平，達(dá)到更長(zhǎng)期、更有效的免疫去勢(shì)效果。分析c組gnrh衍生體乳化后主動(dòng)免疫公犢牛后的激素變化情況，箭頭表示免疫時(shí)間，整個(gè)試驗(yàn)期間對(duì)照組fsh、lh濃度變化平穩(wěn)，平均濃度分別為17.91ng/ml和26.46ng/ml；而實(shí)驗(yàn)組c組fsh、lh含量在初次免疫(0wpv)后，都有一定程度的降低，4周后(4wpv)二次免疫使得fsh、lh濃度持續(xù)下降，與對(duì)照組相比始終維持在較低的水平，平均濃度分別僅為13.44ng/ml和21.14ng/ml(圖4b、圖4c)。觀察試驗(yàn)期間血清t濃度，對(duì)照組血清t濃度從0wpv(濃度為7.71ng/ml)開(kāi)始持續(xù)上升，至4wpv達(dá)到峰值(11.72ng/ml)，后持續(xù)維持在較高水平，平均濃度達(dá)9.13ng/ml，免疫去勢(shì)組血清t濃度顯著低于對(duì)照組(p<0.05)，平均濃度為7.39ng/ml(圖4d)。表明gnrh疫苗免疫注射可以明顯的降低血清中l(wèi)h、fsh和t的合成與分泌，影響動(dòng)物的生殖能力，并且加強(qiáng)免疫效果更加明顯。5)奶公犢睪丸組織石蠟切片分析試驗(yàn)公牛屠宰后，迅速分離出單側(cè)睪丸剝離附睪，采集睪丸組織1cm3大小置于4％中性甲醛中固定，用于制作石蠟切片。對(duì)照組與c組奶公犢單側(cè)睪丸組織切片后經(jīng)he染色結(jié)果顯示，將c組gnrh抗原乳化后免疫公牛，gnrh抗原免疫組睪丸組織出現(xiàn)明顯的組織學(xué)變化。生理鹽水組(對(duì)照組)公牛睪丸組織中，曲精細(xì)管排列整齊，管腔內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞層次清晰，層數(shù)正常，精原細(xì)胞向管腔內(nèi)發(fā)育，分化為初級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子，精子數(shù)量較多，上皮組織完整，支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分布均勻(圖4e)；而gnrh主動(dòng)免疫公牛睪丸(c組)組織發(fā)生明顯空泡變性，曲細(xì)精管生殖上皮明顯萎縮，管腔內(nèi)精原細(xì)胞、精母細(xì)胞及精子細(xì)胞層次減少且不分明，在曲精小管內(nèi)僅見(jiàn)一兩層退化的精原細(xì)胞，腔內(nèi)無(wú)精子或極少精子，管腔空蕩間質(zhì)組織疏松，細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖4f)。以上結(jié)果表明該gnrh疫苗c主動(dòng)免疫公牛后，抑制公牛睪丸的發(fā)育，使曲精小管發(fā)生萎縮，精子發(fā)生受到抑制，最終導(dǎo)致睪丸組織萎縮，去勢(shì)作用較好，也表明該gnrh抗原c具有良好的免疫原性。6)牛肉品質(zhì)分析試驗(yàn)?zāi)┢诠Ｍ涝缀?，采集?和4肋間背最長(zhǎng)肌500g，檢測(cè)c組gnrh疫苗和對(duì)照組的牛肉嫩度(剪切力)、干燥水分損失、酸度(ph值)、脂肪含量、蛋白質(zhì)含量以及總氨基酸含量。取3個(gè)平行樣本的均值比較兩組之間的差異。具體測(cè)定方法如下：(1)剪切力測(cè)定將肉樣修建成厚度約為2.5cm的肉塊，85℃水浴加熱30min,使得肉塊中心溫度達(dá)到80℃后取出室溫冷卻，用直徑為1.27cm的中空取樣器沿著肌纖維的方向取樣，每個(gè)肉樣重復(fù)采集3次，用肌肉嫩度儀測(cè)定其剪切力大小，取3次的平均值即為該肉塊的剪切力值，結(jié)果以牛頓為單位。(2)干燥水分損失測(cè)定由于背最長(zhǎng)肌橫截面上，大理石花紋與水分含量分布都不均勻，因而采集背部肌肉每份約5g，用剪刀剪成肉末狀，從中隨機(jī)稱取出1g左右(w1)用錫箔紙包裹，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中，干燥3h至恒重，冷卻至室溫后準(zhǔn)確稱取干燥后的重量(w2)。按照公式1計(jì)算干燥水分損失。公式1干燥水分損失％＝(w1-w2)/w1×100％(3)ph值測(cè)定公牛屠宰后，在新鮮胴體上采集不含脂肪的背部肌肉約5g,于溫度4℃，濕度80％-85％的環(huán)境中，每隔24h測(cè)定1次，持續(xù)監(jiān)測(cè)72h。每份肉樣剪碎后，50ml蒸餾水浸泡15min后過(guò)濾，使用酸度計(jì)測(cè)定其ph值。(4)肌內(nèi)脂肪含量測(cè)定采集30g左右具有代表性的肉樣剪碎，隨機(jī)稱取3g肉樣，烘干后用濾紙包好，稱重記為w3，置于索氏提取器中，以石油醚作為抽提劑，70℃水浴抽提10h后取出，烘干后冷卻至室溫再次稱重記為w4，按照公式2計(jì)算肌內(nèi)脂肪含量。公式2干燥水分損失％＝(w3-w4)/w3×100％(5)蛋白質(zhì)含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取1.5g肉樣于消化管中，加入1粒消化片及12ml濃硫酸，在消化爐中消化2h，用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。(6)氨基酸含量測(cè)定秤取350mg肉樣置于20ml安瓶中，加入6mol/lhcl溶液10ml抽真空融封，放入110℃烘箱中水解22h，經(jīng)氨基酸分析儀的離子交換柱分離后，與茚三酮反應(yīng)，通過(guò)分光光度計(jì)比色測(cè)定氨基酸含量。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，可以看出，排酸后，免疫去勢(shì)c組ph值比對(duì)照組高0.08，剪切力比對(duì)照組低0.36n,干燥水分損失比對(duì)照組低5.62％，蛋白質(zhì)含量比對(duì)照組低1.49％，總氨基酸含量比對(duì)照組高8.37％。但與對(duì)照組相比，c組gnrh抗原免疫后牛肉的剪切力、干燥水分損失、酸度、脂肪含量、蛋白質(zhì)含量及氨基酸含量雖有一定的變化，均差異不顯著(p＞0.05)，其中氨基酸含量比對(duì)照組高8.37％，說(shuō)明該gnrh疫苗c對(duì)提高胴體的營(yíng)養(yǎng)水平具有一定的作用。序列表<110>新疆農(nóng)墾科學(xué)院<120>gnrh抗原及其在主動(dòng)免疫對(duì)公牛的去勢(shì)效果及肉品質(zhì)影響中的應(yīng)用<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>prt<213>人工序列<220><223><400>1gluhistrpsertyrlysleuargproglyglnhistrpsertyrlys151015leuargproglycys20<210>2<211>22<212>prt<213>人工序列<220><223><400>2cysglnhistrpsertyrlysleuargproglyglnhistrpsertyr151015lysleuargproglycys20<210>3<211>24<212>prt<213>人工序列<220><223><400>3gluhistrpsertyrlysleuargproglymetalaleuglnhistrp151015sertyrlysleuargproglycys20<210>4<211>24<212>prt<213>人工序列<220><223><400>4gluhistrpsertyrlysleuargproglyvaliletyrglnhistrp151015sertyrlysleuargproglycys20<210>5<211>41<212>prt<213>人工序列<220><223><400>5gluhistrpsertyrlysleuargproglyglnhistrpsertyrlys151015leuargproglyglnhistrpsertyrlysleuargproglyglnhis202530trpsertyrlysleuargproglycys3540<210>6<211>42<212>prt<213>人工序列<220><223><400>6cysglnhistrpsertyrlysleuargproglyglnhistrpsertyr151015lysleuargproglyglnhistrpsertyrlysleuargproglygln202530histrpsertyrlysleuargproglycys3540<210>7<211>50<212>prt<213>人工序列<220><223><400>7gluhistrpsertyrlysleuargproglymetalaleuglnhistrp151015sertyrlysleuargproglyalaleumetglnhistrpsertyrlys202530leuargproglyleualametglnhistrpsertyrlysleuargpro354045glycys50<210>8<211>50<212>prt<213>人工序列<220><223><400>8gluhistrpsertyrlysleuargproglyvaliletyrglnhistrp151015sertyrlysleuargproglyilevaltyrglnhistrpsertyrlys202530leuargproglytyrilevalglnhistrpsertyrlysleuargpro354045glycys50當(dāng)前第1頁(yè)12