本發(fā)明涉及一條可與甲胎蛋白特異結(jié)合的多肽序列及其應(yīng)用，屬于多肽設(shè)計及病毒抗原檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

基于分子對接的虛擬篩選技術(shù)是一種新興的研究多肽與蛋白質(zhì)之間相互作用的技術(shù)手段。這一技術(shù)主要是運用計算機快速運算實現(xiàn)多肽與相應(yīng)靶標蛋白在空間構(gòu)象上的對接，將虛擬多肽數(shù)據(jù)庫中的分子逐一與靶標蛋白晶體結(jié)構(gòu)的特定活性位點進行對接，通過計算機快速運算并不斷調(diào)整多肽與靶標蛋白結(jié)合的位置、構(gòu)象、分子內(nèi)部可旋轉(zhuǎn)鍵的二面角和靶標蛋白的氨基酸殘基側(cè)鏈和骨架，尋找多肽分子與靶標蛋白在空間結(jié)構(gòu)上的最佳構(gòu)象，并預(yù)測兩者之間的結(jié)合模式與親和力，通過評分值挑選出接近天然構(gòu)象的與靶標蛋白親和力最佳的多肽配體的一種理論模擬分子間相互作用的方法。

甲胎蛋白(AFP)是一種糖蛋白，正常情況下，這種蛋白主要來自胚胎的肝細胞，胎兒出生后約兩周甲胎蛋白從血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量不到20μg/L。甲胎蛋白在產(chǎn)婦羊水或母體血漿中可用于胎兒產(chǎn)前監(jiān)測。如在神經(jīng)管缺損、脊柱裂、無腦兒等時，AFP可由開放的神經(jīng)管進入羊水而導(dǎo)致其在羊水中含量顯著升高。胎兒在宮腔內(nèi)死亡、畸胎瘤等先天缺陷亦可有羊水中AFP增高。AFP可經(jīng)羊水部分進入母體血循環(huán)。在85％脊柱裂及無腦兒的母體，血漿AFP在妊娠16-18周可見升高而有診斷價值。在成人，AFP可以在大約80％的肝癌患者血清中升高，在生殖細胞腫瘤出現(xiàn)AFP陽性率為50％。在其它腸胃管腫瘤，如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者體內(nèi)也會出現(xiàn)不同程度的升高。因此，甲胎蛋白的檢測結(jié)果可以作為多種病癥的判定依據(jù)之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明借助于分子對接及虛擬篩選技術(shù)，在甲胎蛋白晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過分子對接技術(shù)，搜尋虛擬多肽庫中與靶標蛋白結(jié)合模式與親和力最佳的多肽配體，其多肽序列為WYRVGY，即P217。人工合成P217，利用表達純化的甲胎蛋白進行表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)與ELISA結(jié)合試驗，結(jié)果表明，人工合成的P217與甲胎蛋白有良好的結(jié)合能力，由此證明，借助本發(fā)明設(shè)計而成的多肽，可用于血清中甲胎蛋白進行定量和定性的快速檢測。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

可與甲胎蛋白特異結(jié)合的多肽序列，所述的多肽序列為WYRVGY。

所述的可與甲胎蛋白特異結(jié)合的多肽序列，包括以所述的多肽序列為核心，任何對該多肽序列所進行的相應(yīng)調(diào)整或修飾；修飾材料包括但不限制在納米材料、熒光材料、酶類、生物素及特定的蛋白質(zhì)。

將所述的多肽序列用于血清中甲胎蛋白的檢測，其中包括但不局限于酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測。

一種所述的多肽序列在甲胎蛋白的快速檢測中的應(yīng)用，其中包括但不限于哺乳動物血清中、人工重組表達或人工純化手段得到的甲胎蛋白。

一種所述的多肽序列在甲胎蛋白定量和定性的快速檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明借助于分子對接及虛擬篩選技術(shù)，在甲胎蛋白晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過分子對接技術(shù)，搜尋虛擬多肽庫中與靶標蛋白結(jié)合模式與親和力最佳的多肽配體，最終得到可與甲胎蛋白特異結(jié)合的多肽序列，其多肽序列為WYRVGY，即P217。人工合成P217，并與甲胎蛋白進行親和力鑒定，P217序列與人工表達的甲胎蛋白之間相互作用的平衡解離常數(shù)KD為1.47×10^-9M，即1.47nM，說明親和力較好。

2、由于人工表達甲胎蛋白的局限性，針對甲胎蛋白的抗體的特異性比較差，本發(fā)明設(shè)計得到的P217序列很好地避免了這一難題，實現(xiàn)快速人工合成與低廉檢測成本。

3、本發(fā)明設(shè)計而成的P217序列與人工表達蛋白、人工純化蛋白均可以結(jié)合，除與甲胎蛋白反應(yīng)性較高外，與其它蛋白均不發(fā)生交叉性反應(yīng)，特異性較好。

4、本發(fā)明與傳統(tǒng)噬菌體多肽庫篩選相比，具有簡單，快速及成本低的特點；通過計算機輔助實施分子對接，可為實現(xiàn)甲胎蛋白結(jié)構(gòu)功能解析提供較好的理論指導(dǎo)。

5、本發(fā)明與人工表達純化的蛋白進行免疫來獲得針對蛋白抗體的過程相比，具有操作簡單，省時省力，費用低等優(yōu)點；通過對篩選P217序列進行標記，可實現(xiàn)對甲胎蛋白進行定性和定量的快速檢測。

附圖說明

圖1為P217序列與甲胎蛋白的對接結(jié)果展示。

圖2為P217序列與人工表達甲胎蛋白的SPR親和力鑒定結(jié)果。其中，縱坐標代表傳感器所檢測到的信號值；橫坐標代表樣品在傳感器中相互作用的時間。圖中，從上到下各曲線對應(yīng)的P217溶液濃度逐漸降低。

圖3為P217序列與甲胎蛋白陽性血清的ELISA鑒定結(jié)果。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。

實施例1分子對接及虛擬肽庫的篩選

1、甲胎蛋白的準備

從PDB數(shù)據(jù)庫中搜尋哺乳動物甲胎蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(3MRK)，借助計算機程序?qū)w結(jié)構(gòu)進行分析，選定其第100到200氨基酸殘基之間的特定氨基酸殘基作為對接設(shè)定區(qū)域，以進行分子對接。

2、虛擬多肽庫的設(shè)計

建立不同氨基酸殘基的空間結(jié)構(gòu)，借助計算機程序，實現(xiàn)對輸入目標多肽進行批量生成，以滿足分子對接計算機程序的自動調(diào)用和處理。虛擬多肽庫均以直鏈形式生成，不對任何側(cè)鏈、首尾氨基和羧基進行修飾。單一虛擬多肽庫的生成以不超過四位氨基酸殘基為宜。

3、對接結(jié)果的評斷

分別計算多肽與蛋白結(jié)合的自由能，氫鏈，范得華力等力學(xué)參數(shù)進行綜合評定，以此來判定篩選結(jié)果，并篩選得到P217，其多肽序列為色氨酸-酪氨酸-精氨酸-纈氨酸-甘氨酸-酪氨酸(Trp-Tyr-Arg-Val-Gly-Tyr，簡寫WYRVGY)(SEQ ID NO.1)，其與甲胎蛋白對接的相互作用位置結(jié)果見圖1。

實施例2 P217序列與人工表達甲胎蛋白的親和力鑒定

1、將人工表達純化的甲胎蛋白采用PBS緩沖液(pH 7.4)稀釋為1μg/ml(蛋白量計)，采用活潑酯法，分別將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS，1:1)、甲胎蛋白注入安裝有氨基芯片的SPR檢測儀中，保證EDC/NHS和甲胎蛋白分別與氨基芯片相互作用5min，實施甲胎蛋白與氨基芯片的偶聯(lián)。偶聯(lián)完成后，該傳感器就可以用于測量甲胎蛋白與P217序列之間的相互作用。

2、向傳感器中注入250μl PBS緩沖液(pH 7.4)，以最大流速(150μl/min)運行緩沖液，達到信號基線，將緩沖液的流速降至20μl/min，以獲得較為穩(wěn)定的基線。

3、將人工合成并在氨基端生物素化修飾的P217干粉使用PBS緩沖液(pH 7.4)分別稀成濃度為303.5μM、75.87μM、37.94μM、18.97μM，4.72μM、2.37μM的P217溶液，從低濃度開始依次向傳感器中注入250μl的P217溶液，每次注入樣品均采用20μl/min的流速并且與傳感器相互作用5min，最后用PBS緩沖液(pH 7.4)沖洗5min。以得到的不同濃度P217溶液與甲胎蛋白相互作用的結(jié)合與解離曲線為依據(jù)，進行P217序列與甲胎蛋白相結(jié)合的親和力分析(見圖2)。

結(jié)果表明，P217序列與人工表達的甲胎蛋白具有較好的親和性結(jié)合，兩者之間相互作用的平衡解離常數(shù)KD為1.47×10^-9M，即1.47nM。

實施例3 P217序列與血清的甲胎蛋白的ELISA鑒定

1、取哺乳動物血液(陽性)進行離心，去除血細胞，取血清進行酶標板包被；以同樣方式將不同樣品，即正常人血清、兔血清、牛血清進行酶標板包被，并和同體積PBS緩沖液同時作為對照。其中，包被抗原均采用碳酸鹽(CBS)緩沖液進行稀釋，每孔50μl加入96孔酶標板中，置于4℃條件下過夜，用PBST緩沖液洗滌5次后再用質(zhì)量分數(shù)2％的BSA液進行封閉。

2、將人工合成并在氨基端生物素化修飾的P217干粉使用PBS緩沖液(pH 7.4)稀釋成500ng/ml的濃度，以每孔50μl的體積加入到上述酶標板中，混勻后，置于37℃條件下，避光溫育30min。

3、用PBST緩沖液洗滌5次，并甩干酶標板孔中的液體；使用PBST緩沖液稀釋偶聯(lián)辣根過氧化物酶的鏈霉親和素(1:1000)，以每孔50μl的體積加入甩干的酶標板中，混勻后，置于37℃條件下，避光溫育30min。

4、根據(jù)試驗所需量，將TMB顯色液以每孔100μl的體積加入到上述酶標板中，充分混勻30s之后，室溫條件下，顯色10min。

5、將2M的硫酸終止液以每孔50μl的體積加入上述酶標板中，充分混勻30s之后，在酶標儀器上，讀取各孔在450nm處的吸光值，判定結(jié)果。

結(jié)果表明，P217序列與哺乳動物血清中的甲胎蛋白具有較好的親和性與特異性結(jié)合，與其它陰性血清均不發(fā)生反應(yīng)(見圖3)。

SEQUENCE LISTING

<110> 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院

<120> 可與甲胎蛋白特異結(jié)合的多肽序列及其應(yīng)用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Trp Tyr Arg Val Gly Tyr

1 5