本發(fā)明屬于牙釉質(zhì)原位修復(fù)材料及牙科植入體表面抗菌材料領(lǐng)域，特別涉及多肽修飾的低聚原花青素及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

齲齒是一種細(xì)菌引起的疾病，主要表現(xiàn)為牙齒的脫礦現(xiàn)象。目前，用于填充齲齒患處的材料包括金屬材料、陶瓷材料和樹脂材料，然而由于牙齒基質(zhì)與填充材料之間性質(zhì)差異巨大，兩者界面間相互作用力不強(qiáng)，50％～60％的填充材料在首次治療后不久脫落(L.L.Kirkevang,M.A.Wenzel,Caries Res.43(2009)286)。近年來，誘導(dǎo)牙釉質(zhì)定點(diǎn)再礦化的材料得到了廣泛的研究和關(guān)注，這類材料通過模擬有機(jī)基質(zhì)誘導(dǎo)牙釉質(zhì)再礦化，目前可用的這類材料包括生物大分子、脂質(zhì)體、自組裝膜等。

葡萄籽提取物(GSE)是從天然葡萄籽中提取的混合物，主要含多酚類化合物、萜類化合物、維生素、氨基酸、生物堿等多種生物活性物質(zhì)，能抑制致齲菌的生長和粘附。施桔紅等以原花青素含量為61.6％的葡萄籽提取物誘導(dǎo)受損牙本質(zhì)再礦化，將經(jīng)過脫礦處理的牙本質(zhì)塊進(jìn)行pH循環(huán)處理8天，以考察GSE對(duì)牙本質(zhì)再礦化的促進(jìn)作用，結(jié)果表明10％的GSE能促進(jìn)脫礦牙本質(zhì)的再礦化作用(施桔紅,黎紅,王伊娜.葡萄籽提取物促進(jìn)早期牙本質(zhì)齲損再礦化作用的體外研究.[J]上海口腔醫(yī).2015,24(1).)。雖然GSE能促進(jìn)脫礦牙本質(zhì)的再礦化，但GSE具有該作用主要是因?yàn)槠渲泻械脑ㄇ嗨啬軠p緩牙本質(zhì)上膠原的生物降解，起到穩(wěn)定膠原的作用有關(guān)，從而為礦物質(zhì)的沉積提供網(wǎng)狀支撐。與牙本質(zhì)相比，牙釉質(zhì)中的膠原等有機(jī)成分的含量明顯更低，且原花青素對(duì)作為牙釉質(zhì)主要無機(jī)成分的對(duì)羥基磷灰石沒有吸附作用，因而原花青素?zé)o法牢固地作用于牙釉質(zhì)上，難以用于牙釉質(zhì)的修復(fù)。

基于以上技術(shù)現(xiàn)狀，若能對(duì)原花青素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改進(jìn)，并利用原花青素能抑制致齲菌的生長和粘附的特點(diǎn)，開發(fā)出對(duì)牙釉質(zhì)具有良好的吸附效果、能有效促進(jìn)牙釉質(zhì)再礦化和具有抑菌作用的誘導(dǎo)牙齒定點(diǎn)再礦化的材料，對(duì)于齲齒修復(fù)和牙科植入體表面抗菌都將產(chǎn)生重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供多肽修飾的低聚原花青素及其制備方法，并證明所述多肽修飾的低聚原花青素可作為牙釉質(zhì)原位再礦化誘導(dǎo)劑以及牙科植入體表面抗菌材料應(yīng)用。

本發(fā)明提供的多肽修飾的低聚原花青素，結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)所示：

式(Ⅰ)中，R代表結(jié)構(gòu)式如式(Ⅱ)所示的低聚原花青素分子中的任意一個(gè)R₁被去掉后形成的基團(tuán)，式(Ⅱ)中，n＝0、1、2或3(即低聚原花青素為二聚、三聚、四聚或五聚原花青素)，R₁為羥基，

本發(fā)明提供的上述多肽修飾的低聚原花青素的制備方法，步驟如下：

(1)丙烯酰基修飾的低聚原花青素的合成

①配制第一種溶液

將低聚原花青素溶解于二甲基甲酰胺中形成第一種溶液，所述低聚原花青素的聚合度為2、3、4或5，低聚原花青素在第一種溶液中的濃度為10～40mg/mL；

②配制第二種溶液

將三乙胺溶解于第一種溶液中形成第二種溶液，所述三乙胺與第一種溶液中低聚原花青素的摩爾比為(1～1.5):1；

③合成

在氬氣保護(hù)條件下于-5～5℃將丙烯酰氯加入到第二種溶液中，在室溫反應(yīng)至少24h，然后經(jīng)透析、冷凍干燥，即得丙烯?；揎椀牡途墼ㄇ嗨?；所述丙烯酰氯與第二種溶液中低聚原花青素的摩爾比為(1～1.5):1；

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的低聚原花青素的合成

①配制第三種溶液

將步驟(1)制備的丙烯酰基修飾的低聚原花青素溶解于去離子水中形成第三種溶液，所述去離子水的量以所述丙烯?；揎椀牡途墼ㄇ嗨啬茉谌ルx子水中完全溶解為限；

②配制第四種溶液

以結(jié)構(gòu)式如式(Ⅲ)所示的多肽為溶質(zhì)，將所述溶質(zhì)溶解于去離子水中形成第四種溶液，所述去離子水的量以溶質(zhì)能在去離子水中完全溶解為限，

③合成

將二甲基苯基磷加入第三種溶液中并混合均勻，然后加入第四種溶液并混合均勻，在密封條件下于室溫反應(yīng)至少24h，經(jīng)透析、冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的低聚原花青素；

所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為(1～1.5):1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為(10^-6～10^-5):1；

(3)多肽修飾的低聚原花青素的合成

①配制第五種溶液

將氨水、二氧六環(huán)、濃度為3～5mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為(1.9～2.1):(0.9～1):(0.08～0.12)；

②合成

以步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的低聚原花青素為溶質(zhì)，將所述溶質(zhì)溶解于第五種溶液中并混合均勻，在密封條件下于室溫反應(yīng)至少24h，然后經(jīng)透析、冷凍干燥，即得多肽修飾的低聚原花青素；所述第五種溶液的量以溶質(zhì)能在第五種溶液中完全溶解為限。

本發(fā)明提供了上述多肽修飾的低聚原花青素作為牙釉質(zhì)原位再礦化誘導(dǎo)劑以及牙科植入體表面抗菌材料的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明：本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素對(duì)羥基磷灰石具有牢固的吸附作用，并能在羥基磷灰表面吸附聚集成膜；本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素能在模擬唾液中誘導(dǎo)羥基磷灰石在磨損牙釉質(zhì)塊表面沉積和結(jié)晶，具有促進(jìn)牙釉質(zhì)再礦化的能力，并且，將本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素與三價(jià)鐵離子配合使用，能進(jìn)一步提升所述多肽修飾的低聚原花青素在模擬唾液中對(duì)牙釉質(zhì)再礦化的能力，說明三價(jià)鐵離子可與本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素配合作為牙釉質(zhì)原位再礦化誘導(dǎo)劑應(yīng)用。本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素能有效防止細(xì)菌(包括死細(xì)菌和活細(xì)菌)在牙釉質(zhì)上粘附，阻止粘附的細(xì)菌在其上繁殖，從而體現(xiàn)出抑菌作用，基于該特性，本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素可作為牙科植入體表面抗菌材料應(yīng)用。

應(yīng)用時(shí)，將所述多肽修飾的低聚原花青素配制成水溶液使用，所述水溶液中，多肽修飾的低聚原花青素的濃度為1000～3000ppm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1.本發(fā)明提供了一種新型結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)牙釉質(zhì)定點(diǎn)再礦化的材料—多肽修飾的低聚原花青素，豐富了牙釉質(zhì)定點(diǎn)再礦化的材料的種類。

2.實(shí)驗(yàn)表明：本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素對(duì)羥基磷灰石具有牢固的吸附作用，并能在羥基磷灰表面吸附聚集成膜，本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素能在模擬唾液中誘導(dǎo)羥基磷灰石在磨損牙釉質(zhì)塊表面沉積和結(jié)晶，具有促進(jìn)牙釉質(zhì)再礦化的能力，并且，與三價(jià)鐵離子配合使用，能進(jìn)一步提升所述多肽修飾的低聚原花青素在模擬唾液中對(duì)牙釉質(zhì)再礦化的能力，可在作為牙釉質(zhì)原位再礦化誘導(dǎo)劑中應(yīng)用(見實(shí)施例5～9)；本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素能有效防止細(xì)菌(包括死細(xì)菌和活細(xì)菌)在牙釉質(zhì)上粘附，阻止粘附的細(xì)菌在其上繁殖，從而體現(xiàn)出抑菌作用，可作為牙科植入體表面抗菌材料應(yīng)用(見實(shí)施例10)。

3.本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素在應(yīng)用時(shí)配制成多肽修飾的低聚原花青素的濃度為1000～3000ppm的水溶液直接浸泡進(jìn)行再礦化的部位即可吸附在相應(yīng)部位，在吸附后可誘導(dǎo)相應(yīng)部位再礦化，應(yīng)用方式簡單，具有簡化治療操作和降低治療成本的優(yōu)勢，容易在實(shí)際應(yīng)用中推廣。

4.本發(fā)明還提供了上述多肽修飾的低聚原花青素的制備方法，該方法采用常規(guī)原料及設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素的合成過程示意圖；

圖2是實(shí)施例1制備的丙烯?；揎椀亩墼ㄇ嗨氐募t外譜圖；

圖3是實(shí)施例1制備的丙烯酰基修飾的二聚原花青素的核磁氫譜；

圖4是實(shí)施例1制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的二聚原花青素的紅外譜圖；

圖5是實(shí)施例1制備的多肽修飾的二聚原花青素的飛行時(shí)間質(zhì)譜；

圖6是實(shí)施例5中各樣品的熒光分布圖，其中，圖(A)～(C)分別為羅丹明標(biāo)記的SAP-2-OPC在酸蝕牙釉質(zhì)塊上、羅丹明標(biāo)記的SAP-2-OPC在未酸蝕牙釉質(zhì)塊上、羅丹明標(biāo)記的二聚原花青素在未酸蝕牙釉質(zhì)塊上的熒光分布圖；

圖7是實(shí)施例6中不同濃度的SAP-2-OPC在羥基磷灰石粉末上的吸附量圖；

圖8是實(shí)施例7中SAP-2-OPC在羥基磷灰石片表面聚集成膜后的SEM照片；

圖9是實(shí)施例8的實(shí)驗(yàn)組中礦化不同時(shí)間的酸蝕牙釉質(zhì)塊表面的SEM圖，其中，圖(A)、(B)的礦化時(shí)間分別為1天和2周。

圖10是實(shí)施例8的空白組中礦化不同時(shí)間的酸蝕牙釉質(zhì)塊表面的SEM圖，其中，圖(A)、(B)的礦化時(shí)間分別為1天和2周。

圖11是實(shí)施例9的實(shí)驗(yàn)組中礦化不同時(shí)間的酸蝕牙釉質(zhì)塊表面的SEM圖，其中，圖(A)、(B)的礦化時(shí)間分別為1天和2周。

圖12是實(shí)施例10實(shí)驗(yàn)組和空白組在波長600nm處測吸光度值柱狀圖；

圖13是實(shí)施例10中實(shí)驗(yàn)組和空白組的羥基磷灰石片表面的SEM照片，其中，圖(A)、(B)為實(shí)驗(yàn)組的SEM照片，圖(C)、(D)為空白組的SEM照片；

圖14是實(shí)施例10中空白組與實(shí)驗(yàn)組樣品的共聚焦顯微鏡圖，其中，圖(A)、(B)分別為空白組的樣品表面的活菌和死菌被染色后的共聚焦顯微鏡圖，圖(C)、(D)分別為實(shí)驗(yàn)組的樣品表面的活菌和死菌被染色后的共聚焦顯微鏡圖。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素及其制備方法與應(yīng)用作進(jìn)一步說明。

下述實(shí)施例1～4中，所述二聚、三聚、四聚和五聚原花青素均由兒茶素與兒茶素聚合而成；步驟(2)中使用的多肽購買自上海波泰生物科技有限公司，其結(jié)構(gòu)式如式(Ⅲ)所示：

實(shí)施例1

本實(shí)施例中，提供多肽修飾的二聚原花青素的制備方法，其合成路線如圖1所示，步驟如下：

(1)丙烯酰基修飾的二聚原花青素的合成

①配制第一種溶液

在室溫、常壓條件下將0.59g二聚原花青素溶解于40mL二甲基甲酰胺中形成第一種溶液，二聚原花青素在第一種溶液中的濃度為14.8mg/mL；

②配制第二種溶液

在室溫、常壓條件下將三乙胺(TEA)溶解于第一種溶液中形成第二種溶液，所述三乙胺與第一種溶液中二聚原花青素的摩爾比為1.1:1；

③合成

在0～5℃的冰水浴及氬氣保護(hù)條件下將丙烯酰氯(Acryloyl chloride)滴加到第二種溶液中，在室溫室溫、常壓條件下反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為500道爾頓的透析袋透析1天，再冷凍干燥，即得丙烯酰基修飾的二聚原花青素；所述丙烯酰氯與第二種溶液中二聚原花青素的摩爾比為1.1:1。

該步驟制備的丙烯?；揎椀亩墼ㄇ嗨丶t外譜圖和核磁氫譜分別如圖2和圖3所示，圖2中，1735cm^-1和1253cm^-1處的峰分別表示酯基中C＝0的伸縮振動(dòng)和O-C-O的伸縮振動(dòng)，1655cm^-1處的峰代表C＝C的伸縮振動(dòng)，圖2中，7.95ppm和5.87ppm處的峰分別代表C＝CH-O和-C＝CH上的質(zhì)子氫，峰面積比為1:2，圖2和圖3說明該步驟已經(jīng)在二聚原花青素的基礎(chǔ)上引入了丙烯酰基。

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的二聚原花青素的合成

①配制第三種溶液

在常壓、室溫條件下將步驟(1)制備的18.3mg丙烯?；揎椀亩墼ㄇ嗨厝芙庥?0mL去離子水中形成第三種溶液；

②配制第四種溶液

以40mg結(jié)構(gòu)式如式(Ⅲ)所示的多肽為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于10mL去離子水中形成第四種溶液；

③合成

將二甲基苯基磷(Dimethylphenylphosphine)加入第三種溶液中，在室溫、常壓攪拌混合均勻，然后加入第四種溶液并攪拌混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為1500道爾頓的透析袋透析1天，冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的二聚原花青素；

所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為1.1:1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為10^-6:1。

該步驟制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的二聚原花青素的紅外譜圖如圖4所示，圖4中1550cm^-1處的峰代表酰胺II帶，1680cm^-1處的峰代表酰胺I帶，說明該步驟在步驟(1)制備的產(chǎn)物的基礎(chǔ)上引入了帶保護(hù)基團(tuán)的多肽。

(3)多肽修飾的二聚原花青素的合成

①配制第五種溶液

在室溫、常壓條件下將氨水、二氧六環(huán)、濃度為4mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為2:1:0.1；

②合成

以20mg步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的二聚原花青素為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于1mL第五種溶液中并攪拌混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后然后在去離子水中用截留分子量為1000道爾頓的透析袋透析24h，冷凍干燥，即得多肽修飾的二聚原花青素，記作SAP-2-OPC，其飛行時(shí)間質(zhì)譜如圖5所示，圖5中，

1919.523為SAP-2-OPC的分子離子峰，SAP-2-OPC的結(jié)構(gòu)式為：

實(shí)施例2

本實(shí)施例中，提供多肽修飾的三聚原花青素的制備方法，其合成路線如圖1所示，步驟如下：

(1)丙烯?；揎椀娜墼ㄇ嗨氐暮铣?/p>

①配制第一種溶液

在室溫、常壓條件下將0.885g三聚原花青素溶解于40mL二甲基甲酰胺中形成第一種溶液，三聚原花青素在第一種溶液中的濃度為22mg/mL；

②配制第二種溶液

在室溫、常壓條件下將三乙胺溶解于第一種溶液中形成第二種溶液，所述三乙胺與第一種溶液中三聚原花青素的摩爾比為1.1:1；

③合成

在0～5℃的冰水浴及氬氣保護(hù)條件下將丙烯酰氯滴加到第二種溶液中，在室溫室溫、常壓條件下反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為750道爾頓的透析袋透析1天，再冷凍干燥，即得丙烯?；揎椀娜墼ㄇ嗨?；所述丙烯酰氯與第二種溶液中三聚原花青素的摩爾比為1.1:1。

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的三聚原花青素的合成

①配制第三種溶液

在常壓、室溫條件下將步驟(1)制備的27.5mg丙烯?；揎椀娜墼ㄇ嗨厝芙庥?0mL去離子水中形成第三種溶液；

②配制第四種溶液

以40mg結(jié)構(gòu)式如式(Ⅲ)所示的多肽為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于10mL去離子水中形成第四種溶液；

③合成

將二甲基苯基磷加入第三種溶液中，在室溫、常壓攪拌混合均勻，然后加入第四種溶液并攪拌混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為1500道爾頓的透析袋透析1天，冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的三聚原花青素；

所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為1.1:1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為5×10^-6:1。

(3)多肽修飾的三聚原花青素的合成

①配制第五種溶液

在室溫、常壓條件下將氨水、二氧六環(huán)、濃度為5mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為2:0.9:0.1；

②合成

以40mg步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的三聚原花青素為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于2mL第五種溶液中并攪拌混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后然后在去離子水中用截留分子量為1000道爾頓的透析袋透析24h，冷凍干燥，即得多肽修飾的三聚原花青素，記作SAP-3-OPC。

實(shí)施例3

本實(shí)施例中，提供多肽修飾的四聚原花青素的制備方法，其合成路線如圖1所示，步驟如下：

(1)丙烯酰基修飾的四聚原花青素的合成

①配制第一種溶液

在室溫、常壓條件下將1.18g四聚原花青素溶解于40mL二甲基甲酰胺中形成第一種溶液，四聚原花青素在第一種溶液中的濃度為29.5mg/mL；

②配制第二種溶液

在室溫、常壓條件下將三乙胺溶解于第一種溶液中形成第二種溶液，所述三乙胺與第一種溶液中四聚原花青素的摩爾比為1:1；

③合成

在0～5℃的冰水浴及氬氣保護(hù)條件下將丙烯酰氯滴加到第二種溶液中，在室溫室溫、常壓條件下反應(yīng)30h，然后在去離子水中用截留分子量為750道爾頓的透析袋透析1天，再冷凍干燥，即得丙烯酰基修飾的四聚原花青素；所述丙烯酰氯與第二種溶液中四聚原花青素的摩爾比為1:1。

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的四聚原花青素的合成

①配制第三種溶液

在常壓、室溫條件下將步驟(1)制備的36.6mg丙烯?；揎椀乃木墼ㄇ嗨厝芙庥?0mL去離子水中形成第三種溶液；

②配制第四種溶液

以40mg結(jié)構(gòu)式如式(Ⅲ)所示的多肽為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于10mL去離子水中形成第四種溶液；

③合成

將二甲基苯基磷加入第三種溶液中，在室溫、常壓攪拌混合均勻，然后加入第四種溶液并攪拌混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)30h，然后在去離子水中用截留分子量為2000道爾頓的透析袋透析1天，冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的四聚原花青素；

所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為1:1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為8×10^-6:1。

(3)多肽修飾的四聚原花青素的合成

①配制第五種溶液

在室溫、常壓條件下將氨水、二氧六環(huán)、濃度為3mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為2:1:0.1；

②合成

以60mg步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的四聚原花青素為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于3mL第五種溶液中并攪拌混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)30h，然后然后在去離子水中用截留分子量為1500道爾頓的透析袋透析30h，冷凍干燥，即得多肽修飾的四聚原花青素，記作SAP-4-OPC。

實(shí)施例4

本實(shí)施例中，提供多肽修飾的五聚原花青素的制備方法，其合成路線如圖1所示，步驟如下：

(1)丙烯?；揎椀奈寰墼ㄇ嗨氐暮铣?/p>

①配制第一種溶液

在室溫、常壓條件下將1.475g五聚原花青素溶解于40mL二甲基甲酰胺中形成第一種溶液，五聚原花青素在第一種溶液中的濃度為36.9mg/mL；

②配制第二種溶液

在室溫、常壓條件下將三乙胺溶解于第一種溶液中形成第二種溶液，所述三乙胺與第一種溶液中五聚原花青素的摩爾比為1.5:1；

③合成

在-5～0℃及氬氣保護(hù)條件下將丙烯酰氯滴加到第二種溶液中，在室溫室溫、常壓條件下反應(yīng)32h，然后在去離子水中用截留分子量為1000道爾頓的透析袋透析1天，再冷凍干燥，即得丙烯?；揎椀奈寰墼ㄇ嗨?；所述丙烯酰氯與第二種溶液中五聚原花青素的摩爾比為1.5:1。

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的五聚原花青素的合成

①配制第三種溶液

在常壓、室溫條件下將步驟(1)制備的45.8mg丙烯?；揎椀奈寰墼ㄇ嗨厝芙庥?0mL去離子水中形成第三種溶液；

②配制第四種溶液

以40mg結(jié)構(gòu)式如式(Ⅲ)所示的多肽為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于10mL去離子水中形成第四種溶液；

③合成

將二甲基苯基磷加入第三種溶液中，在室溫、常壓攪拌混合均勻，然后加入第四種溶液并攪拌混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)32h，然后在去離子水中用截留分子量為2500道爾頓的透析袋透析1天，冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的五聚原花青素；

所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為1.5:1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為10^-5:1。

(3)多肽修飾的五聚原花青素的合成

①配制第五種溶液

在室溫、常壓條件下將氨水、二氧六環(huán)、濃度為4mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為2:0.95:0.1；

②合成

以80mg步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的五聚原花青素為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于4mL第五種溶液中并攪拌混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)32h，然后然后在去離子水中用截留分子量為2000道爾頓的透析袋透析30h，冷凍干燥，即得多肽修飾的五聚原花青素，記作SAP-5-OPC。

實(shí)施例5

本實(shí)施例中，測定實(shí)施例1制備的SAP-2-OPC在牙釉質(zhì)表面的吸附情況，具體使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標(biāo)記了的SAP-2-OPC和二聚原花青素在牙釉質(zhì)表面的吸附情況。

(1)熒光標(biāo)記

熒光標(biāo)記物質(zhì)選擇羅丹明，標(biāo)記方法為：分別向SAP-2-OPC和二聚原花青素的二甲基亞砜溶液中加入與SAP-2-OPC、二聚原花青素等摩爾的羅丹明的二甲基亞砜溶液，再分別加入與SAP-2-OPC、二聚原花青素等摩爾的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，攪拌1天，得到濃度為2.25mg/mL的羅丹明標(biāo)記的SAP-2-OPC和濃度為2.25mg/mL羅丹明標(biāo)記的二聚原花青素。

(2)酸蝕和未酸蝕牙釉質(zhì)塊的制備

①取因正畸拔除的正常前磨牙，用乙醇除去正常牙表面的有機(jī)污染物，用蒸餾水沖洗干凈后貯存于4℃的濃度為0.05wt％的麝香草酚水溶液中備用。

②使用高速牙塊切割機(jī)上將需要的牙釉質(zhì)部分從經(jīng)過步驟①處理的牙上切下，切割成4×4×2mm大小的牙齒塊，切割牙釉質(zhì)面暴露，其余部分用甲基丙烯酸甲酯樹脂包埋，將暴露面用依次用800#、1200#、2400#碳化硅砂紙?jiān)诹魉履テ健伖?，去除表層約150μm，以消除表面有機(jī)污染物和表面的不規(guī)則，得到未酸蝕牙釉質(zhì)塊，置于濃度為0.05wt％的麝香草酚水溶液中備用，使用前，將樹脂包埋的牙塊置于去離子水中，用超聲波清洗器中處理30min。

③使用高速牙塊切割機(jī)上將需要的牙釉質(zhì)部分從經(jīng)過步驟①處理的牙上切下，切割成4×4×2mm大小的牙齒塊，切割牙釉質(zhì)面暴露，其余部分用甲基丙烯酸甲酯樹脂包埋，將暴露面用依次用800#、1200#、2400#碳化硅砂紙?jiān)诹魉履テ健伖?，去除表層約150μm，以消除表面有機(jī)污染物和表面的不規(guī)則，得到未酸蝕牙釉質(zhì)塊，置于濃度為0.05wt％的麝香草酚水溶液中備用，使用前，將樹脂包埋的牙塊置于去離子水中，用超聲波清洗器中處理30min，取出放入37wt％的磷酸中浸泡45s(每顆樹脂包埋的牙塊用10mL磷酸浸泡)，用PBS沖洗3次，再將其置于去離子水中，用超聲波清洗器中處理5min，將得到的酸蝕牙釉質(zhì)塊保存于磷酸鹽緩沖液(PBS)中待用。

(3)用移液槍分別量取2mL羅丹明標(biāo)記的SAP-2-OPC溶液浸泡酸蝕和未酸蝕牙釉質(zhì)塊，用移液槍分別量取2mL羅丹明標(biāo)記的二聚原花青素溶液浸泡未酸蝕牙釉質(zhì)塊，浸泡1天后用PBS沖洗3次，將樣品烘干后用激光共聚焦顯微鏡觀察其表面的熒光分布情況，結(jié)果如圖6所示。

圖6中，圖(A)～(C)分別為羅丹明標(biāo)記的SAP-2-OPC在酸蝕牙釉質(zhì)塊上的熒光分布圖、羅丹明標(biāo)記的SAP-2-OPC在未酸蝕牙釉質(zhì)塊上的熒光分布圖、羅丹明標(biāo)記的二聚原花青素在未酸蝕牙釉質(zhì)塊上的熒光分布圖，其中，圖(A)中樣品具有明顯的紅色熒光，圖(B)中樣品的熒光較圖(A)更暗，這是由于酸蝕后的牙釉質(zhì)的比表面積增大，能吸附更多的熒光標(biāo)記的SAP-2-OPC造成的，而圖(C)中樣品沒有熒光，說明二聚原花青素對(duì)牙釉質(zhì)沒有吸附作用。本實(shí)施例說明本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素在牙釉質(zhì)上具有良好的吸附性能。

實(shí)施例6

本實(shí)施例中，測定實(shí)施例1制備的SAP-2-OPC和二聚原花青素在羥基磷灰石粉末上的吸附情況，所述羥基磷灰石粉末的規(guī)格為HA/M30，其含水量低于0.1％。

將SAP-2-OPC溶解在去離子水中，配制成SAP-2-OPC濃度分別為0.25mg/mL、0.75mg/mL、1.25mg/mL、1.75mg/mL、2.25mg/mL及2.75mg/mL SAP-2-OPC水溶液，用紫外可見分光光度計(jì)測量前述6個(gè)濃度的SAP-2-OPC水溶液在波長為264nm處的吸光度值，得到SAP-2-OPC濃度與吸光度值之間的線性關(guān)系，即標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將SAP-2-OPC溶解在去離子水中，配制成SAP-2-OPC濃度分別為0.25mg/mL、0.75mg/mL、1.25mg/mL、1.75mg/mL、2.25mg/mL及2.75mg/mL的SAP-2-OPC水溶液，分別記作1～6#溶液。取量程為10mL的離心PE管6支，分別向其中加入50mg羥基磷灰石粉末，然后取1～6#溶液各1mL加入離心PE管中，在37℃振蕩攪拌12h，然后對(duì)各離心PE管中的混合液以10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心4分鐘，取離心所得上清液用紫外分光光度計(jì)測量上清液中SAP-2-OPC的濃度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出吸附在羥基磷灰石粉末上的SAP-2-OPC的量，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，當(dāng)SAP-2-OPC的濃度為2.25mg/mL時(shí)在羥基磷灰石粉末上達(dá)吸附飽和，SAP-2-OPC在50mg羥基磷灰石粉末上的飽和吸附量為1.9mg。

二聚原花青素在羥基磷灰石粉末上的吸附情況的測試方法與上述SAP-2-OPC在羥基磷灰石粉末上的吸附情況的測試方法類似，測試結(jié)果表明二聚原花青素在羥基磷灰石上的飽和吸附量為0，即二聚原花青素對(duì)羥基磷灰石粉末并沒有吸附作用。

實(shí)施例7

本實(shí)施例中，測定實(shí)施例1制備的SAP-2-OPC在羥基磷灰石片上聚集成膜的情況，所述羥基磷灰石片的尺寸為8mm*2mm，其含水量低于0.1％。

采用掃描電鏡觀察SAP-2-OPC在羥基磷灰石片表面聚集成膜的情況。將SAP-2-OPC溶解在去離子水中，配制成SAP-2-OPC濃度為2.25mg/mL的SAP-2-OPC水溶液，用移液槍量取2mL的SAP-2-OPC水溶液浸泡羥基磷灰石片，浸泡1天后用PBS沖洗3次，烘干后用掃描觀察SAP-2-OPC在羥基磷灰石片表面聚集成膜的情況，結(jié)果如圖8所示，其中，圖(A)～(C)是SAP-2-OPC在羥基磷灰石片表面聚集成膜后不同放大倍數(shù)的SEM照片。由圖8可知，本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素在羥基磷灰石片上具有良好的聚集成膜性能。

實(shí)施例8

本實(shí)施例中，測定實(shí)施例1制備的SAP-2-OPC對(duì)牙釉質(zhì)再礦化的促進(jìn)能力。

(1)酸蝕牙釉質(zhì)塊的制備

①取因正畸拔除的正常前磨牙，用乙醇除去正常牙表面的有機(jī)污染物，用蒸餾水沖洗干凈后貯存于4℃的濃度為0.05wt％的麝香草酚水溶液中備用。

②使用高速牙塊切割機(jī)上將需要的牙釉質(zhì)部分從經(jīng)過步驟①處理的牙上切下，切割成4×4×2mm大小的牙齒塊，切割牙釉質(zhì)面暴露，其余部分用甲基丙烯酸甲酯樹脂包埋，將暴露面用依次用800#、1200#、2400#碳化硅砂紙?jiān)诹魉履テ?、拋光，去除表層約150μm，以消除表面有機(jī)污染物和表面的不規(guī)則，得到未酸蝕牙釉質(zhì)塊，置于濃度為0.05wt％的麝香草酚水溶液中備用，使用前，將樹脂包埋的牙塊置于去離子水中，用超聲波清洗器中處理30min，取出放入37wt％的磷酸中浸泡45s(每顆樹脂包埋的牙塊用10mL磷酸浸泡)，用PBS沖洗3次，再將其置于去離子水中，用超聲波清洗器中處理5min，將得到的酸蝕牙釉質(zhì)塊保存于磷PBS中待用。

(2)①用去離子水將實(shí)施例1制備的SAP-2-OPC配制成濃度為2.25mg/mL的SAP-2-OPC水溶液。

②按如下配方配制模擬唾液：CaCl₂ 0.1665g、KCl 9.685g、NaH₂PO₄0.1224g、NaN₃·0.065g、HEPES 4.766g，在37℃溶于用750mL去離子中，用1mol/L的KOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.02，用去離子水定容至1000mL。

(3)將步驟(1)制備的酸蝕牙釉質(zhì)塊分為實(shí)驗(yàn)組和空白組，每組中酸蝕牙釉質(zhì)塊2塊。各組的操作如下：

①將實(shí)驗(yàn)組的酸蝕牙釉質(zhì)塊在室溫下浸泡于2.25mg/mL的SAP-2-OPC水溶液中，浸泡時(shí)間為30min，取出，用PBS洗滌；將空白組的酸蝕牙釉質(zhì)塊在室溫下浸泡于去離子水中，浸泡時(shí)間為30min，取出，用PBS洗滌。

②將步驟①得到的牙釉質(zhì)塊浸泡于模擬唾液中，于37℃恒溫保存，模擬唾液每1天更換一次，并重復(fù)步驟①，每組中的酸蝕牙釉質(zhì)塊分別浸泡1天和2周，取出，用PBS洗滌、烘干，然后用掃描電鏡觀察各組酸蝕牙釉質(zhì)塊表面羥基磷灰石的沉積和結(jié)晶的情況，結(jié)果如圖9和圖10所示。

圖9中，圖(A)、(B)分別為實(shí)驗(yàn)組礦化1天和2周后酸蝕牙釉質(zhì)塊表面的SEM圖，圖10中，圖(A)、(B)分別為空白組礦化1天和2周后酸蝕牙釉質(zhì)塊表面的SEM圖。由圖9可知，實(shí)驗(yàn)組的酸蝕牙釉質(zhì)塊在模擬唾液中浸泡1天后，其表面已有羥基磷灰石的沉積和結(jié)晶，實(shí)驗(yàn)組的酸蝕牙釉質(zhì)在模擬唾液中浸泡2周后，其表面明顯可見有一定厚度的羥基磷灰石的沉積和結(jié)晶，而由圖10可知，空白組的酸蝕牙釉質(zhì)塊則礦化程度較弱，說明本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素在模擬唾液中能誘導(dǎo)羥基磷灰石在酸蝕牙釉質(zhì)塊表面沉積和結(jié)晶，可用作牙釉質(zhì)原位再礦化誘導(dǎo)劑。

實(shí)施例9

本實(shí)施例中，考察三價(jià)鐵離子對(duì)本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素對(duì)牙釉質(zhì)再礦化能力的促進(jìn)作用。

(1)酸蝕牙釉質(zhì)塊的制備

①取因正畸拔除的正常前磨牙，用乙醇除去正常牙表面的有機(jī)污染物，用蒸餾水沖洗干凈后貯存于4℃的濃度為0.05wt％的麝香草酚水溶液中備用。

②使用高速牙塊切割機(jī)上將需要的牙釉質(zhì)部分從經(jīng)過步驟①處理的牙上切下，放置于規(guī)格為1×1×1cm的砂盤中，并向沙盤中澆上DMDHE樹脂，待其自然固化，將樹脂塊取出，在高速渦輪砂紙上將其磨平，特別注意將所需的牙釉質(zhì)表面從樹脂中暴露出來。將包有DMDHE樹脂的牙塊置于去離子水中，在超聲波清洗器中處理30min，取出放入37wt％的磷酸中浸泡45s(每顆樹脂包埋的牙塊用10mL磷酸浸泡)，用PBS沖洗3次，再將其置于去離子水中，在超聲波清洗器中處理5min，將得到的酸蝕牙釉質(zhì)塊保存于PBS中待用。

(2)①用去離子水將實(shí)施例1制備的SAP-2-OPC配制成濃度為2.25mg/mL的SAP-2-OPC水溶液。

②按如下配方配制模擬唾液：CaCl₂ 0.1665g、KCl 9.685g、NaH₂PO₄0.1224g、NaN₃·0.065g、HEPES 4.766g，在37℃溶于用750mL去離子中，用1mol/L的KOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.02，用去離子水定容至1000mL。

(3)配制Fe³⁺緩沖液

①配制Tris.HCl緩沖液，配方為：50mL 0.1mol/L Tris水溶液、45.7mL 0.1mol/L HCl水溶液用去離子水定容至100mL，用0.1mol/lNaOH調(diào)節(jié)pH值至7；

②用Tris.HCl緩沖液將實(shí)施例1制備的SAP-2-OPC配制成SAP-2-OPC濃度為2.25mg/mL的SAP-2-OPC溶液，用Tris.HCl緩沖液將FeCl₃.6H₂O配制成Fe³⁺與前述SAP-2-OPC溶液中SAP-2-OPC摩爾濃度相等的溶液，然后將兩種溶液等摩爾比混合，并用0.1mol/L的NaOH調(diào)pH值至9得到Fe³⁺緩沖液。

(4)將步驟(1)制備的酸蝕牙釉質(zhì)塊分為實(shí)驗(yàn)組和空白組，每組中酸蝕牙釉質(zhì)塊2塊。各組的操作如下：

①將實(shí)驗(yàn)組的酸蝕牙釉質(zhì)塊在室溫下浸泡于步驟(3)配制的Fe³⁺緩沖液中，浸泡時(shí)間為30min，取出，用PBS洗滌；將空白組的酸蝕牙釉質(zhì)塊在室溫下浸泡于去離子水中，浸泡時(shí)間為30min，取出，用PBS洗滌。

②將步驟①中得到的牙釉質(zhì)塊浸泡于模擬唾液中，于37℃恒溫保存，模擬唾液每1天更換一次，并重復(fù)步驟①，分別浸泡1天、2周，取出，用PBS洗滌、烘干，然后用掃描電鏡觀察各組酸蝕牙釉質(zhì)塊表面羥基磷灰石的沉積和結(jié)晶的情況，結(jié)果如圖10和圖11所示。

圖11中，圖(A)、(B)分別為實(shí)驗(yàn)組的酸蝕牙釉質(zhì)塊在礦化1天和2周后，其表面的SEM圖，由圖11可知，酸蝕牙釉質(zhì)塊表面明顯可見有一定厚度的羥基磷灰石的沉積和結(jié)晶，與實(shí)例8中實(shí)驗(yàn)組的酸蝕牙釉質(zhì)塊(圖9)相比對(duì)比，礦化程度明顯增強(qiáng)并且分布更加均勻，說明三價(jià)鐵離子能促進(jìn)本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素誘導(dǎo)羥基磷灰石在酸蝕牙釉質(zhì)塊表面沉積和結(jié)晶的能力，三價(jià)鐵離子可與本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素配合作為牙釉質(zhì)原位再礦化誘導(dǎo)劑應(yīng)用。

實(shí)施例5～9說明本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素可作為牙釉質(zhì)原位再礦化誘導(dǎo)劑應(yīng)用。

實(shí)施例10

本實(shí)施例中，考察實(shí)施例1制備的SAP-2-OPC對(duì)口腔變異鏈球菌的抑制作用。

(1)將SAP-2-OPC溶解在去離子水中，配制成SAP-2-OPC濃度為2.25mg/mL的SAP-2-OPC水溶液，用移液槍量取2mL的SAP-2-OPC水溶液浸泡羥基磷灰石片1天，干燥后，得到帶SAP-2-OPC涂層的在羥基磷灰石片。

(2)以步驟(1)制備的帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石片作為實(shí)驗(yàn)組試樣，以羥基磷灰石片作為空白組試樣，實(shí)驗(yàn)組和空白組的操作如下：

實(shí)驗(yàn)組：將帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石片置于孔板中，將口腔變異鏈球菌接種到所述帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石片表面，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后將所述帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石片移到新孔板，用PBS沖洗3次，將濃度為5mg/mL的MTT加入到放有所述帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石片的孔板中，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h，將孔板中的MTT吸盡，加DMSO，放入搖床振搖至所述帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石上的甲瓚完全溶解，吸取所得溶液到96孔板中，用酶標(biāo)儀在波長600nm下測吸光度值OD₆₀₀。

空白組：將羥基磷灰石片置于孔板中，將口腔變異鏈球菌接種到羥基磷灰石片表面，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后將羥基磷灰石片移到新孔板，用PBS沖洗3次，將濃度為5mg/mL的MTT加入到放有羥基磷灰石片的孔板中，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h，將孔板中的MTT吸盡，加DMSO，放入搖床振搖至所述帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石上的甲瓚完全溶解，吸取所得溶液到96孔板中，用酶標(biāo)儀在波長600nm下測吸光度值OD₆₀₀。

實(shí)驗(yàn)組和空白組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示，由圖12可知，空白組的吸光度值明顯大于實(shí)驗(yàn)組，說明SAP-2-OPC具有抑菌作用。

(3)以步驟(1)制備的帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石片作為實(shí)驗(yàn)組試樣，以羥基磷灰石片作為空白組試樣，實(shí)驗(yàn)組和空白組的操作如下：

分別將口腔變異鏈球菌接種到帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石片和羥基磷灰石片表面，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用戊二醛固定過夜，然后分別依次用體積濃度分別為60％、70％、80％、90％的乙醇脫水10分鐘。用掃描電鏡觀察，結(jié)果如圖13所示，其中，圖(A)、(B)分別為實(shí)驗(yàn)組的帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石片表面的SEM照片，圖(C)、(D)分別為空白組的羥基磷灰石片表面的SEM照片，由圖13可知，與空白組相比，帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石片表面粘附的變異鏈球菌數(shù)量明顯減少。

(4)以步驟(1)制備的帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石片作為實(shí)驗(yàn)組試樣，以羥基磷灰石片作為空白組試樣，實(shí)驗(yàn)組和空白組的操作如下：

分別將口腔變異鏈球菌接種到帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石片和羥基磷灰石片表面，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，然后分別將細(xì)胞死活染染料滴到經(jīng)過上述處理的帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石片和羥基磷灰石片上，染色15分鐘，用共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果如圖14所示。

圖14中，圖(A)、(B)分別為空白組的羥基磷灰石片表面的活菌和死菌被染色后的共聚焦顯微鏡圖，圖(C)、(D)分別為實(shí)驗(yàn)組的帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石片表面的活菌和死菌被染色后的共聚焦顯微鏡圖，將圖(A)與(B)，(C)與(D)比較可知，活菌和死菌的位置基本一致，說明活菌和死菌都會(huì)粘附在羥基磷灰石片上，將圖(A)與圖(C)、圖(B)與圖(D)比較可知，實(shí)驗(yàn)組的帶SAP-2-OPC涂層的羥基磷灰石片上比空白組的羥基磷灰石片上粘附的活細(xì)菌和死細(xì)菌數(shù)量都明顯減少，說明SAP-2-OPC具有良好的抑菌作用是由于其能有效防止細(xì)菌粘附，進(jìn)而阻止粘附的細(xì)菌在其上繁殖。本實(shí)施例說明本發(fā)明所述多肽修飾的低聚原花青素可作為牙科植入體表面抗菌材料應(yīng)用。