專利名稱:原花青素的分析方法
技術領域:
本發(fā)明涉及一種對天然物質(zhì)、飲食物、醫(yī)藥品和/或化妝品中含有的原花青素及黃烷-3-醇類進行定量的方法。
背景技術:
就原花色素(proanthocyanidin)(OPC)的功效而言,因其也存在于葡萄酒中,所以被認為是“法蘭西奇跡”(French Paradox)的有效成分之一(1995,Clin.Chim.Acta.,235,207-219),已知其具有抗氧化作用、末梢循環(huán)改善作用、血液流動性改善效果、肝功能改善效果(2004,Japan Food Science,403,1月號,40-45)、血小板凝集抑制效果(特表2003-527418)等。
目前已知的原花色素的分析方法有質(zhì)量分析檢測器與高效液相色譜法聯(lián)用(LC-MS)的反相HPLC(2003,Biosci.Biotechnol.Biochem.,67(5),1140-1142)、LC-MS梯度洗脫正相HPLC(2003,J.Agric.FoodChem.,51,7513-7521)。但在任何一種分析方法中,茶、營養(yǎng)補充品中與其它成分混合的原花青素很難與雜質(zhì)峰分離,因此難以說是準確的定量方法。而且,原花色素因其組成成分黃烷-3-醇類的立體異構而存在很多立體異構體,能夠獲得的作為標準物質(zhì)的化合物有限,因此定量分析不可能除去一部分已知化合物。
日本特表2003-527418[非專利文獻1]1995,Clin.Chim.Acta.,235,207-219[非專利文獻2]
2004,Japan Food Science,403,1月號,40-45[非專利文獻3]2003,Biosci.Biotechnol.Biochem.,67(5),1140-1142[非專利文獻4]2003,J.Agric.Food Chem.,51,7513-7521發(fā)明內(nèi)容人們渴望開發(fā)出一種可以在不受雜質(zhì)干擾的情況下對含有原花青素(兒茶素n聚合體混合物的總稱;n≥1)及黃烷-3-醇類的茶制品、天然物質(zhì)、飲食物、醫(yī)藥品和/或化妝品中的原花青素及黃烷-3-醇類進行準確定量的新分析方法。因此,本發(fā)明提供一種對茶制品、天然物質(zhì)、飲食物、醫(yī)藥品和/或化妝品中含有的原花青素及黃烷-3-醇類進行定量的新方法。
本發(fā)明人等為了解決上述問題進行了各種研究,結果發(fā)現(xiàn)(a)用葡聚糖系或乙烯基聚合物系的樹脂對分析樣品進行前處理,從而除去用疏水性吸附樹脂等無法分離的咖啡因等雜質(zhì),然后(b)將分離的原花青素及黃烷-3-醇類用高效液相色譜法分離、定量,從而可以不受雜質(zhì)的影響對天然物質(zhì)、飲食物中含有的原花青素及黃烷-3-醇類進行定量。
因此,本發(fā)明的方法是對分析樣品中含有的原花青素及黃烷-3-醇類進行定量的方法,其含有以下過程。
a)用色譜柱將影響原花青素、黃烷-3-醇類分析的雜質(zhì)從分析樣品中除去的前處理過程。
b)將經(jīng)上述a)前處理過程除去雜質(zhì)后的處理溶液中的原花青素、黃烷-3-醇類用高效液相色譜法(HPLC)分離、定量的過程。
用本發(fā)明的方法定量的物質(zhì)用本發(fā)明的方法定量的物質(zhì)可以是原花青素(兒茶素n聚合體混合物的總稱;n≥1)及黃烷-3-醇類的任一物質(zhì)。用本發(fā)明的方法定量的黃烷-3-醇類有兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素-3-O-沒食子酸酯、表兒茶素-3-O-沒食子酸酯、沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯、表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯,但不限于這些。用本發(fā)明的方法定量的原花青素有原花青素B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8,但不限于這些。用本發(fā)明的方法定量的物質(zhì)優(yōu)選原花青素B1(PB1)和/或原花青素B3(PB3),更優(yōu)選PB1。
分析樣品作為本發(fā)明方法分析對象的分析樣品是天然物質(zhì)(葡萄籽、羅望子、蘋果、樹皮、松樹皮的多酚、茶葉、可可等、和/或它們的處理物(提取物等))、飲食物、醫(yī)藥品、和/或化妝品等預計含有原花青素和/或黃烷-3-醇類的任意樣品。作為本發(fā)明方法分析對象的分析樣品,優(yōu)選含有原花青素的茶飲料,更優(yōu)選含有松樹皮提取物的茶飲料。
前處理過程用高效液相色譜法對分析樣品中的原花青素及黃烷-3-醇類進行分析時,干擾分析的雜質(zhì)有咖啡因、可可堿等甲基黃嘌呤類;咖啡酸、香豆酸、阿魏酸等苯丙素類;黃酮類;黃酮醇類;以及它們的糖苷類。
嘗試用反相(例如,C8或C18)載體對上述雜質(zhì)與原花青素及黃烷-3-醇類的進行分離,結果發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)同時吸附于樹脂上,而且同時洗脫,因此無法分離,或即使能分離也需要很長的分析時間。本發(fā)明人等對能夠?qū)⑦@些雜質(zhì)與原花青素及黃烷-3-醇類分離的條件進行了反復研究,結果成功地用含有極性有機溶劑的洗脫液通過凝膠過濾柱將這些雜質(zhì)與原花青素及黃烷-3-醇類分離。因此,在本發(fā)明的方法中,前處理通過進行色譜柱分離可以使原花青素及黃烷-3-醇類與上述雜質(zhì)分離。
在前處理中能使用的色譜柱的樹脂有葡聚糖系樹脂(例如,Sephadex LH-20(日本國Amersham Biosciences株式會社))、親水性乙烯基聚合物系凝膠過濾樹脂(例如,TOYOPEARL HW40(日本國TOSOH株式會社)、TOYOPEARL HW-50(日本國TOSOH株式會社)),用這些樹脂可以進行雜質(zhì)與原花青素及黃烷-3-醇類的分離。此外,用填充色譜柱Superdex Peptide 10/300GL(日本國Amersham Biosciences株式會社)也可以進行同樣的分離,當然不限于這些。
在前處理過程中,將分析樣品負載于色譜柱上使雜質(zhì)與原花青素及黃烷-3-醇類分離的洗脫溶劑,只要能分離即可,沒有特殊限制,可以采用水和可溶于水的極性有機溶劑如乙醇、甲醇、乙腈、丙酮等的混合溶劑。作為可溶于水的極性溶劑,特別優(yōu)選乙醇,例如,將分析樣品負載于色譜柱上,用0%~20%的乙醇使雜質(zhì)咖啡因洗脫,用20%~40%的乙醇使苯丙素類、黃酮類及黃酮醇類洗脫,最后,用60%~80%的乙醇使原花青素及黃烷-3-醇類洗脫,從而可以在不含雜質(zhì)的情況下得到所需的原花青素及黃烷-3-醇類。
用高效液相色譜法分離、定量的過程接著,將經(jīng)前處理過程除去雜質(zhì)后的處理溶液中的原花青素、黃烷-3-醇類用高效液相色譜法(HPLC)定量。分析中使用的色譜柱優(yōu)選反相色譜柱,反相色譜柱可以用硅膠載體上化學鍵合了十八烷基的填料(ODS)、化學鍵合了丁基的填料(C4)、化學鍵合了辛基的填料(C8)、化學鍵合了苯基的填料(Ph)、化學鍵合了C30烷基鏈的填料(C30)、合成聚合物上鍵合了十八烷基的填料(ODP)、或反相合成聚合物載體(例如,Shodex Rspak DE系列(日本國昭和電工株式會社))、酰胺鍵合反相載體(例如,Ascentis RP-Amide(日本國SIGMA-ALDRICH Japan株式會社)),但不限于這些。
作為HPLC分析的流動相,可以用水和可溶于水的極性溶劑,例如,可以采用乙醇、甲醇、乙腈、丙酮等與水的混合比例是0%~100%的流動相。流動相呈酸性有利于要分離和分析的成分的穩(wěn)定性,因此還可以是三氟乙酸(TFA)、甲酸、乙酸、三氯乙酸(TCA)、高氯酸等以0.001%~5%混合使用。優(yōu)選0.05%~0.1%的TFA。
具體為,采用ODS色譜柱(Capcellpak C-18AQ(6mm×150mm、日本國資生堂株式會社)),A溶液為0.05%TFA/水,B溶液為0.05%TFA/90%乙腈/水,流速為1.2ml/分,進行B10%→B10%(10分)B10%→B35%(10分)的梯度洗脫,柱溫為40℃。通過測定225nm處的吸光度(A225nm)進行檢測,根據(jù)各個物質(zhì)的峰面積,可以對原花青素及黃烷-3-醇類進行定量??梢杂迷ㄇ嗨谺1(PB1)(日本國FUNAKOSHI株式會社)及原花青素B3(PB3按照下述實施例4的方法合成)作為原花青素的標準物質(zhì)。PB1及PB3的結構式如圖1所示。在上述條件下,PB1在10.7分、PB3在12.6分洗脫。黃烷-3-醇類的(-)-表兒茶素、(-)-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯、(-)-表沒食子兒茶素、(-)-表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯、(+)-兒茶素、(-)-兒茶素-3-O-沒食子酸酯、(+)-沒食子兒茶素、(-)-沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯從和光純藥工業(yè)株式會社購入。(-)-表兒茶素在17.6分、(-)-表沒食子兒茶素在11.1分、(-)-表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯在18.2分、(+)-兒茶素在14.0分、(+)-沒食子兒茶素在6.4分、(-)-沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯在19.1分洗脫。但并不限于此分析條件,可以采用能定量的所有條件。
而且,在另外的方式中,本發(fā)明的方法還可以在用高效液相色譜法分離后再聯(lián)用質(zhì)量分析器進行分析。即,用LC-MS也可以對前處理后的樣品進行定量。例如,在下述實施例6所示的條件下,可以進行LC-MS的分離和定量,但不限于這些。例如,用LC-MS只對二聚體的原花青素進行定量時,利用選擇離子檢測(SIMselected ion monitoring),根據(jù)m/z 579([M+H]+)離子的色譜圖可以定量。當樣品中含有的原花青素非常少時(等于或小于1ppm),用LC-MS定量是很有效的分析手段。
本發(fā)明的方法能夠使含有原花青素的茶制品、天然物質(zhì)、飲食物和/或化妝品中含有的原花青素及黃烷-3-醇類與雜質(zhì)分離,從而可以對上述茶制品等中含有的原花青素及黃烷-3-醇類進行分離、定量。因此,本發(fā)明的方法不分解茶制品、天然物質(zhì)、飲食物、醫(yī)藥品和/或化妝品中的原花青素及黃烷-3-醇類而進行分析,是合適的方法。
圖1是原花青素B1及原花青素B3的結構式示意圖。
圖2是前處理過程中70%EtOH洗脫組分的HPLC色譜圖。分析條件HPLC裝置島津LC-2010HT(日本國島津制作所);色譜柱capcellpak C-18 AQ(6mm×150mm、日本國資生堂株式會社);流動相A溶液為0.05%TFA/水、B溶液為0.05%TFA/90%CH3CN/水;流速1.2ml/分;洗脫梯度B10%→B10%(10分)B10%→B35%(10分);柱溫40℃;檢測A225nm。在此條件下,原花青素B1在10.7分、原花青素B3在12.6分、兒茶素在14.0分、表兒茶素在17.6分、沒食子兒茶素在6.4分、表沒食子兒茶素在11.1分、表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯在18.2分、沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯在19.1分洗脫。
具體實施例方式
下面,根據(jù)實施例,進一步具體地說明本發(fā)明。但是,本發(fā)明不限于實施例。
前處理條件的探討將含有原花青素B1(PB1)及咖啡因各20ppm的水溶液5ml負載于用水使干燥重量為0.25g的Sephadex LH-20(日本國Amersham Biosciences株式會社)溶脹后的色譜柱上,用2ml水洗凈后,用20%、40%、60%、80%的EtOH各2ml洗脫。各洗脫組分在減壓濃縮下濃縮后,裝入2ml容量瓶中,將各洗脫組分供HPLC分析(分析條件在實施例3中記載),進行咖啡因和PB1的定量。
由此結果可知,咖啡因幾乎被水(H2O)洗脫,而PB1被等于或大于60%的EtOH洗脫,兩者可以分離。
茶制品的Sephadex LH-20前處理將含有Flavangenol(來源于松樹皮的原花青素)的茶制品5ml負載于用水使干燥重量為0.25g的Sephadex LH-20(日本國AmershamBiosciences株式會社)溶脹后的色譜柱上,用2ml水洗凈后,用35%EtOH2ml、70%EtOH 4ml洗脫。70%EtOH洗脫組分在減壓濃縮下濃縮后,裝入2ml容量瓶中,將各洗脫組分供HPLC分析(分析條件在實施例3中記載),進行咖啡因和PB1的定量。濃度換算成與原來的體積(5ml)相對應的濃度。
水洗凈使咖啡因幾乎完全洗脫,然后用35%EtOH使苯丙素類和黃酮醇類洗脫,用70%EtOH使所需的原花青素及黃烷-3-醇類洗脫。
另外,也可以事先量取5ml茶制品,經(jīng)冷凍干燥后,溶解于5ml水中使用。
用HPLC分離原花青素和黃烷-3-醇類在下述條件,對Sephadex LH-20處理中分離的水、35%或70%EtOH洗脫組分、以及經(jīng)前處理除去咖啡因等雜質(zhì)后的樣品溶液用HPLC進行分析。
分析條件為,色譜柱采用Capcellpak C-18 AQ(6mm×150mm、日本國資生堂株式會社),A溶液為0.05%TFA/水、B溶液為0.05%TFA/90%CH3CN/水,流速1.2ml/分,進行B10%→B10%(10分)B10%→B35%(10分)的梯度洗脫。柱溫為40℃,用A225nm的面積值定量。HPLC采用島津LC-2010HT(日本國島津制作所)。
在本條件下,原花青素B1在10.7分、原花青素B3在12.6分、兒茶素在14.0分、表兒茶素在17.6分、沒食子兒茶素在6.4分、表沒食子兒茶素在11.1分、表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯在18.2分、沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯在19.1分洗脫,顯示出良好的分離效果。(圖2)[實施例4]原花青素B3的合成根據(jù)論文(J.C.S.Perkin I,1981,Jacobus J.Botha,et al.,1235-1245),按照下述方法合成原花青素B3。
將(+)-花旗松素500mg溶解于乙醇50ml,加入NaBH4200mg后,加入(+)-兒茶素1g,溶解后,再加入HCl攪拌1小時。用反相HPLC精制反應物,得到200mg原花青素B3。
前處理使用的樹脂的探討將含有原花青素B1(PB1)及咖啡因各20ppm的水溶液2ml負載于用水使1ml TOYOPEARL HW-40(日本國TOSOH株式會社)平衡后的色譜柱上,用2ml水洗凈后,用35%EtOH 2ml、70%EtOH 4ml洗脫,將各洗脫組分供HPLC分析,進行咖啡因和PB1的定量。
由此結果可知,與Sephadex LH-20同樣,咖啡因幾乎被水(H2O)洗脫,而PB1被70%EtOH洗脫,兩者可以分離。因此,本前處理方法是在葡聚糖系凝膠過濾樹脂、親水性乙烯基聚合物系樹脂中均有效的方法。
用質(zhì)量分析器定量前處理后的樣品用下述條件的LC-MS進行定量。
質(zhì)量分析器采用Quattro micro(日本國日本W(wǎng)aters株式會社),ESI正模式,在以下條件下測定。
Cone voltage 35VCollision energy 2eVCapillary voltage4000VSource block Temp80℃Desolvation Temp 350℃HPLC采用Aliance 2795(日本國日本W(wǎng)aters株式會社)。HPLC的條件如下所示。
色譜柱Capcell pak C-18AQ(3mmφ×15cm、日本國資生堂株式會社)流動相A溶液0.1%HCOOH/水、B溶液90%CH3CN/0.1%HCOOH/水、流速0.2ml/分洗脫梯度B10%→B35%(7分)→B70%(3分)在本條件下,PB1在7.3分、PB3在7.8分洗脫。利用選擇離子檢測(SIMselected ion monitoring),根據(jù)m/z 579([M+H]+)的色譜圖中的面積,繪制校正曲線,進行定量。當樣品中含有的原花青素非常少時(等于或小于1ppm),用LC-MS定量是很有效的分析手段。
權利要求
1.對分析樣品中含有的原花青素(兒茶素n聚合體混合物的總稱;n≥1)及黃烷-3-醇類進行定量的方法,其含有以下過程a)用色譜柱將影響原花青素、黃烷-3-醇類分析的雜質(zhì)從分析樣品中除去的前處理過程;b)將經(jīng)a)前處理過程除去雜質(zhì)后的處理溶液中的原花青素、黃烷-3-醇類用高效液相色譜法(HPLC)分離、定量的過程。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法,其特征在于,雜質(zhì)是以下物質(zhì)組中的一種或多于一種咖啡因、可可堿、苯丙素類、黃酮醇類、及它們的糖苷類。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法,其特征在于,分析樣品是含有原花青素的茶飲料。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的方法,其特征在于,分析樣品是含有松樹皮提取物的茶飲料。
5.根據(jù)權利要求1~4任意一項所述的方法,其特征在于,在前處理過程中,用葡聚糖系或乙烯基聚合物系樹脂的色譜柱。
6.根據(jù)權利要求1~5任意一項所述的方法,其特征在于,作為前處理過程中的條件,利用水/乙醇的混合液,從而將原花青素及黃烷-3-醇類與雜質(zhì)分離。
7.根據(jù)權利要求1~6任意一項所述的方法,其特征在于,在前處理過程中,采用葡聚糖系樹脂的色譜柱,用水平衡后,負載樣品,用水和/或0%~40%乙醇洗脫雜質(zhì),然后用等于或大于60%的乙醇回收原花青素及黃烷-3-醇類。
8.根據(jù)權利要求1~5任意一項所述的方法,其特征在于,作為前處理過程中的條件,利用從水/甲醇的混合液、水/乙醇的混合液、水/乙腈的混合液、及水/丙酮的混合液中選擇的混合液,從而將原花青素及黃烷-3-醇類與雜質(zhì)分離。
9.根據(jù)權利要求1~8任意一項所述的方法,其特征在于,所述過程b)中使用的高效液相色譜法的色譜柱是反相色譜柱。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法,其特征在于,反相色譜柱具有從以下物質(zhì)組中選擇的填料硅膠載體上化學鍵合了十八烷基的填料(ODS)、化學鍵合了丁基的填料(C4)、化學鍵合了辛烷基的填料(C8)、化學鍵合了苯基的填料(Ph)、化學鍵合了C30烷基鏈的填料(C30)、合成聚合物上鍵合了十八烷基的填料(ODP)、反相合成聚合物載體、及酰胺鍵合反相載體。
11.根據(jù)權利要求1~10任意一項所述的方法,其特征在于,所述過程b)的高效液相色譜法分離中使用的流動相是乙腈和/或水,所述乙腈和/或水分別含有或不含TFA(三氟乙酸)。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法,其特征在于,流動相是乙腈和水,梯度洗脫,所述乙腈和水分別含有或不含TFA(三氟乙酸)。
13.根據(jù)權利要求1~10任意一項所述的方法,其特征在于,作為所述過程b)的高效液相色譜法分離中使用的流動相,其含有從以下物質(zhì)組中選擇的溶劑甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、及它們的混合溶劑。
14.根據(jù)權利要求13所述的方法,其特征在于,在所述過程b)的高效液相色譜法分離中使用的流動相中,含有TFA(三氟乙酸)、甲酸、乙酸、TCA(三氯乙酸)、高氯酸。
15.根據(jù)權利要求1~14任意一項所述的方法,其特征在于,待定量的原花青素是原花青素B1(Procyanidin B1PB1)。
16.根據(jù)權利要求1~15任意一項所述的方法,其特征在于,為了只對二聚體的原花青素進行定量,聯(lián)用質(zhì)量分析器。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對天然物質(zhì)、飲食物、醫(yī)藥品和/或化妝品中含有的原花青素及黃烷-3-醇類進行定量的新方法。本發(fā)明提供一種對天然物質(zhì)、飲食物、醫(yī)藥品和/或化妝品等分析樣品中含有的原花青素(兒茶素n聚合體混合物的總稱;n≥1)進行定量的方法,該方法含有a)用色譜柱將影響原花青素、黃烷-3-醇類分析的雜質(zhì)從分析樣品中除去的前處理過程;b)將經(jīng)上述a)前處理過程除去雜質(zhì)后的處理溶液中的原花青素、黃烷-3-醇類用高效液相色譜法(HPLC)分離、定量的過程。
文檔編號G01N30/14GK1892212SQ20061009072
公開日2007年1月10日 申請日期2006年6月28日 優(yōu)先權日2005年6月30日
發(fā)明者福井祐子 申請人:三得利株式會社