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對溶血磷脂酸特異性識別的多肽探針及其制備與應(yīng)用的制作方法

文檔序號:12092121閱讀:418來源:國知局
對溶血磷脂酸特異性識別的多肽探針及其制備與應(yīng)用的制作方法與工藝
本發(fā)明涉及腫瘤診斷的藥物領(lǐng)域,具體涉及的是卵巢癌早期血清標(biāo)志物溶血磷脂酸(LPA)和對其特異性識別的多肽探針及多肽探針的制備與應(yīng)用,該LPA多肽探針為新型多肽探針,通過特異性結(jié)合細(xì)胞、血清或者活體中的LPA來檢測LPA含量,并可進一步用于檢測卵巢癌。
背景技術(shù)
:卵巢惡性腫瘤(卵巢癌)由于發(fā)病隱匿,被形容為最致命的癌癥之一。卵巢癌的早期癥狀很不明顯,初期癥狀只是腹部疼痛或膨脹、腸胃消化不良,而未引起足夠的重視。僅2004年,美國約有24,000名婦女患卵巢癌,而有14,000名婦女死于卵巢癌。全世界范圍內(nèi),估計每年有190,000新增病例,有114,000例死亡病例。如果能在早期診斷將會提高治愈率,不幸的是,卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)到了晚期,四例卵巢癌病人中三例在晚期才被診斷,延誤了病情。傳統(tǒng)的治療方法,包括手術(shù)、化學(xué)藥物治療、放射治療及綜合治療等,仍難以治愈卵巢癌,其存活率小于20%,并容易舊病復(fù)發(fā)。因此,提高卵巢癌的早期診斷水平、監(jiān)測其治療效果是新近婦科腫瘤研究關(guān)注的熱點。目前使用CA125標(biāo)志物的檢測方法能夠診斷出末期的卵巢癌,但不能夠非常有效地診斷出初期的卵巢癌,且有時還會呈現(xiàn)“誤導(dǎo)性”的結(jié)果。CA125是一種腫瘤表面抗原。上皮組織產(chǎn)生病變,體內(nèi)就會產(chǎn)生CA125,因此上皮組織的癌癥一般會使血液 中的CA125上升。但與其他多數(shù)腫瘤標(biāo)記物一樣,CA125沒有百分百的“標(biāo)準(zhǔn)值”,即不是只有癌癥才會使CA125上升,子宮內(nèi)膜異位癥、骨盆腔發(fā)炎時,也會導(dǎo)致CA125上升,所以利用CA125來診斷是否患有癌癥,并不是那么準(zhǔn)確。此外,不是每一種卵巢癌都是屬于上皮細(xì)胞腫瘤,有些是胚胎組織或腺體細(xì)胞的腫瘤,因此CA125不會出現(xiàn)變化。使用CA125標(biāo)志物的檢測方法不可避免的存在一些缺陷。因此,迫切需要一個特異性和敏感性較強的標(biāo)志物來提高卵巢癌的診斷水平。溶血磷脂酸(LPA)這一新的標(biāo)志物在良性腫瘤及正常組織中含量較低,但在卵巢癌中含量很高。之前研究結(jié)果也顯示,LPA用于卵巢癌的早期診斷優(yōu)于CA125。更多的實驗可以證明LPA是一個非常有診斷意義的腫瘤標(biāo)記物,也有報道稱LPA在卵巢癌中高表達(dá),而在其他癌癥中未見表達(dá)。目前世界上對于卵巢癌的診斷用的最多的還是檢測CA125,已建立的方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),免疫熒光法(FAT)和化學(xué)發(fā)光(CLIA)。其中,ELISA方法和FAT方法由于受其靈敏度和特異性的限制,無論是檢測抗原還是抗體,都很難滿足早期診斷的需要。技術(shù)實現(xiàn)要素:針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題和實際需求,本發(fā)明的目的在于提供一種卵巢癌早期血清標(biāo)志物溶血磷脂酸(LPA)和一種對其特異性識別的多肽探針及多肽探針的制備與應(yīng)用,該多肽探針是一類新型的用于制備具有卵巢癌早期診斷作用的多肽探針,該多肽探針具有對卵巢癌早期血清標(biāo)志物L(fēng)PA特異性識別,在體外對細(xì)胞、血清中LPA特異性識別發(fā)出增強的熒光,在體內(nèi)對LPA特異性識別特異性結(jié)合濃聚到腫瘤部位,利用近紅外活體成像技術(shù)檢測體內(nèi)卵巢癌早期血清標(biāo)志物L(fēng)PA,為實現(xiàn)卵巢癌的早期診斷提供了重要的臨床判斷依據(jù)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:本發(fā)明提供一種對溶血磷脂酸(LPA)特異性識別的多肽探針由多肽Peptide、連接基團Linker、近熒光基團Dye通過酰胺基連接而成。發(fā)明提供一種對卵巢癌早期血清標(biāo)志物溶血磷脂酸(LPA)特異性識別的多肽探針的結(jié)構(gòu)為:Peptide-Linker-Dye。所述多肽Peptide為靶向腫瘤的RGD、NGR多肽,所述多肽Peptide序列中含有RGD或NGR多肽,多肽序列可以是一條或多條,優(yōu)選一條或兩條。進一步,所述多肽Peptide的單條多肽的氨基酸數(shù)目為3-15個氨基酸。本發(fā)明所述的對卵巢癌早期血清標(biāo)志物溶血磷脂酸(LPA)特異性識別的多肽探針,多肽Peptide優(yōu)選自,如下表格:表1:多肽序列:多肽序列氨基酸數(shù),名稱受體靶向組織RGD3,RGD整合素腫瘤KRGDK5,KRGD整合素腫瘤CDCRGDCFC9,RGD-4C整合素腫瘤CRGDK/RGPD/EC5,iRGD整合素腫瘤cyclo-RGDf/k/y5,cRGD整合素腫瘤NGR3,NGRCD13受體腫瘤新生血管CNGRC5,NGRCD13受體腫瘤新生血管CNGRCVSGCAGRC13,NGRCD13受體腫瘤新生血管本發(fā)明所述的對卵巢癌早期血清標(biāo)志物溶血磷脂酸(LPA)特異性識別的多肽探針,多肽Peptide優(yōu)選KRGDK和CNGRC多肽序列。一是為了增強肽鏈的水溶性,二 是為了增強卵巢癌細(xì)胞對LPA多肽探針的攝入,增強LPA多肽探針在腫瘤組織中的積累。根據(jù)本發(fā)明所述的對溶血磷脂酸特異性識別的多肽探針,所述連接基團Linker為一個或多個肽核酸單體、一個或多個聚乙二醇單體、一個或多個氨基酸。進一步,所述連接基團Linker為1-4個肽核酸單體、1-4個聚乙二醇單體、1-4個氨基酸。本發(fā)明所述的對卵巢癌早期血清標(biāo)志物溶血磷脂酸(LPA)特異性識別的多肽探針,連接基團Linker優(yōu)選的是鳥嘌呤肽核酸單體GB,甘氨酸G和聚乙二醇PEG2,其中鳥嘌呤肽核酸單體GB通過其氫鍵相互作用增強熒光猝滅效果,降低起始熒光強度。具體地說,本發(fā)明所述連接基團Linker優(yōu)選的是:其中:R1為氫、堿基;R2為Fmoc保護基團。本發(fā)明所述的對LPA特異性識別的多肽探針,所述熒光基團Dye為任意一種熒光基團。所述的對LPA特異性識別的多肽探針選取熒光染料Dye的目的是在特定波長激發(fā)下能發(fā)出熒光便于檢測,只要能實現(xiàn)該功能的其他染料都可以。進一步,所述熒光基團Dye優(yōu)選的是近紅外方酸菁染料,成本低、熒光穿透組織能力強,降低組織背景熒光干擾;在600-700nm激發(fā)下,在700-800nm發(fā)出強烈的熒 光,實現(xiàn)近紅外熒光檢測。更進一步具體地說,本發(fā)明所述熒光基團Dye優(yōu)選自R1,R2=(CH2)n,n=1-15;R3=H,OH,OMe,SO3Na,SO3K;R4=CH,COOH其中:R1、R2為C2-C15的烷基鏈;R3為氫、-OH、-OMe、-SO3Na或-SO3K;R4為CN或COOH。本發(fā)明提供的對LPA特異性識別的多肽探針,優(yōu)選的多肽探針K(RGDK-GBGB-Dye)2,CDCRGDCFC-ABTB-Dye,K(RGDK-GG-Dye)2,CRGDKGBCBDye,cyclo-KRGDf-PEG2-Dye,K(CNGRC-PEG2-Dye)2,CNGRCNGRC-GG-Dye,CNGRCVSGCAGRC-PEG2-Dye,KRGDKGBGBDye,KRGDKGGDye,KRGDK-PEG2-Dye,CNGRC-GG-Dye,CNGRC-PEG2-Dye。本發(fā)明所述的對LPA特異性識別的多肽探針的制備,包括以下步驟:(1)將Rink酰胺樹脂和Fmoc起始氨基酸置于反應(yīng)瓶中,加入有機堿和縮合劑,在DMF溶液中,室溫條件下反應(yīng)3小時后,再脫除Fmoc保護基團,得到與賴氨酸偶 聯(lián)的樹脂;(2)依次重復(fù)步驟(1),其中原料氨基酸依次替換為其他氨基酸,最終得到與上述氨基酸依次偶聯(lián)的樹脂;(3)將步驟(2)得到與上述氨基酸依次偶聯(lián)的樹脂與連接基團Linker,置于反應(yīng)瓶中,加入有機堿和縮合劑,在DMF溶液中,室溫條件下反應(yīng)3小時后,得到進一步與帶有連接基團Linker偶聯(lián)的樹脂;(4)重復(fù)上述操作零到多次,所述多次為所需連接基團Linker的個數(shù);(5)重復(fù)上述操作,將原料連接基團Linker換成熒光基團Dye;(6)切割步驟(5)所得與氨基酸依次偶聯(lián)的樹脂,得到對LPA特異性識別的多肽探針。進一步,所述有機堿為N,N-二異丙基乙胺,所述耦合劑為六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基。本發(fā)明所述的對LPA特異性識別的多肽探針為藍(lán)色或綠色固體。本發(fā)明公開的對LPA特異性識別的多肽探針,進一步優(yōu)選的多肽探針Ⅰ-Ⅷ分別為:多肽探針Ⅰ:K(RGDKGBGBDye)2,如多肽探針1結(jié)構(gòu)式為:其中K代表賴氨酸,G代表甘氨酸,R代表精氨酸,D代表天冬氨酸,GB代表鳥嘌呤肽核酸單體,Dye代表一種熒光團(Sq-Naphthyl)。多肽探針Ⅱ:CDCRGDCFC-ABTB-Dye,如多肽探針2結(jié)構(gòu)式為:其中C代表半胱氨酸,D代表天冬氨酸,R代表精氨酸,G代表甘氨酸,F(xiàn)代表苯丙氨酸,AB代表腺嘌呤肽核酸單體,TB代表胸腺嘧啶肽核酸單體,Dye代表一種熒光團(Sq-OH)。多肽探針Ⅲ:K(RGDKGGDye)2,如多肽探針3結(jié)構(gòu)式為:其中K代表賴氨酸,G代表甘氨酸,R代表精氨酸,D代表天冬氨酸,Dye代表一種熒光團(Sq-Naphthyl)。多肽探針Ⅳ:CRGDKGBCBDye,如多肽探針4結(jié)構(gòu)式為:其中C代表半胱氨酸,R代表精氨酸,G代表甘氨酸,D代表天冬氨酸,K代表賴氨酸,GB代表腺嘌呤肽核酸單體,CB代表胸腺嘧啶肽核酸單體,Dye代表一種熒光團(Sq-OMe)。多肽探針Ⅴ:cyclo-KRGDf-PEG2-Dye,如多肽探針5結(jié)構(gòu)式為:其中K代表賴氨酸,G代表甘氨酸,R代表精氨酸,D代表天冬氨酸,F(xiàn)代表苯丙氨酸,PEG2代表聚乙二醇,Dye代表一種熒光團(Sq-2OMe)。多肽探針Ⅵ:K(CNGRC-PEG2-Dye)2,如多肽探針6結(jié)構(gòu)式為:其中K代表賴氨酸,C代表半胱氨酸,N代表天冬酰胺,G代表甘氨酸,R代表精氨酸,PEG2代表聚乙二醇,Dye代表一種熒光團(Sq-SO3K)。多肽探針Ⅶ:CNGRCNGRC-GG-Dye,如多肽探針7結(jié)構(gòu)式為:其中C代表半胱氨酸,N代表天冬酰胺,G代表甘氨酸,R代表精氨酸,Dye代表一種熒光團(Sq)。多肽探針Ⅷ:CNGRCVSGCAGRC-PEG2-Dye,如多肽探針8結(jié)構(gòu)式為:其中C代表半胱氨酸,N代表天冬酰胺,G代表甘氨酸,R代表精氨酸,V代表纈氨酸,S代表絲氨酸,A代表丙氨酸,PEG2代表聚乙二醇,Dye代表一種熒光團(Sq-2OH)。在本發(fā)明中設(shè)計的對LPA特異性識別的多肽探針在反應(yīng)瓶中通過固相Fmoc法合成。所述溶血磷脂酸LPA可以作為卵巢癌早期血清標(biāo)志物及在卵巢癌早期診斷中的應(yīng)用;所述溶血磷脂酸LPA結(jié)構(gòu)如下:所述溶血磷脂酸LPA優(yōu)選的是LPA18:1,以下簡稱LPA。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供了一種卵巢癌早期血清標(biāo)志物溶血磷脂酸(LPA)和一種對其特異性識別的多肽探針及多肽探針的制備與應(yīng)用,在體外對細(xì)胞、血清中LPA特異性識別發(fā)出增強的熒光;在體內(nèi)對LPA特異性識別特異性結(jié)合濃聚到腫瘤部位,利用近紅外活體成像技術(shù)檢測體內(nèi)卵巢癌早期血清標(biāo)志物L(fēng)PA,為實現(xiàn)卵巢癌的早期診斷提供了重 要的臨床判斷依據(jù)。進一步本發(fā)明所述多肽探針可以在卵巢癌發(fā)生的早期從臨床樣品中準(zhǔn)確地檢測到LPA的存在,并且在活體中確定腫瘤位置。因此,本發(fā)明建立的用于卵巢癌血清標(biāo)志物L(fēng)PA特異性識別的多肽探針為實現(xiàn)卵巢癌的早期診斷提供了重要的臨床判斷依據(jù)。本發(fā)明為早期卵巢癌的診斷提供了一種高靈敏度、高特異性的檢測探針和檢測手段。附圖說明圖1為多肽探針1的高效液相色譜(HPLC)和飛行時間質(zhì)譜分析圖;圖2為當(dāng)LPA后,歸一化的多肽探針1的熒光光譜變化(激發(fā)波長700nm),多肽探針1對LPA具有熒光響應(yīng);圖3為多肽探針1在720nm處熒光工作曲線(激發(fā)波長700nm),多肽探針1對LPA的熒光響應(yīng)與LPA濃度正相關(guān);圖4為對LPA特異性識別的多肽探針1在正常卵巢IOSE80細(xì)胞與卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中的紅色熒光信號;圖5為對LPA特異性識別的多肽探針1在正常小鼠與卵巢癌小鼠血清中的熒光信號;圖6為對LPA特異性識別的多肽探針1在正常小鼠與卵巢癌小鼠體內(nèi)近紅外熒光信號。具體實施方式為了更好地理解本發(fā)明,下面結(jié)合附圖和實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容,但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施例。本發(fā)明所用試劑:試劑廠家純度DIC吉爾生化99%PyBOP吉爾生化99%Fmoc-Arg(Pbf)-OH吉爾生化99%Fmoc-Lys(Fmoc)-OH吉爾生化99%Fmoc-Lys(Boc)-OH吉爾生化99%Fmoc-Asp(OtBu)-OH吉爾生化99%Fmoc-Gly-OH吉爾生化99%Rink酰胺樹脂吉爾生化99%DMF國藥AR六氫哌啶國藥AR三氟乙酸國藥AR本發(fā)明所用儀器:儀器廠家高效液相色譜儀GE,AKTA微波多肽合成儀CEM基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀ABSCIE,4800Plus成像流式細(xì)胞儀默克密理博小動物活體成像系統(tǒng)珀金埃爾默制備實施例1:所述的對LPA特異性識別的多肽探針1的制備,包括以下步驟:(1)將Rink酰胺樹脂(309mg,0.810mmol/g,0.25mmol,1equiv.)和Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(0.75mmol,3.0equiv)置于反應(yīng)瓶中,加入有機堿(2.5mmol,10equiv)和縮合劑(0.75mmol,3.0equiv),在DMF溶液中,室溫條件下反應(yīng)3小時后,再脫除Fmoc保護基團,得到與賴氨酸偶聯(lián)的樹脂;(2)依次重復(fù)步驟(1),其中原料氨基酸依次替換為Fmoc精氨酸(1.5mmol,6.0equiv)、Fmoc甘氨酸(1.5mmol,6.0equiv)、側(cè)連帶有保護基的Fmoc天冬氨酸(1.5mmol,6.0equiv)、Fmoc賴氨酸(1.5mmol,6.0equiv),最終得到與上述氨基酸依次偶聯(lián)的樹脂;(3)將步驟(2)得到與上述氨基酸依次偶聯(lián)的樹脂和Fmoc-Aeg-G(Boc)2-OH(1.5mmol,6.0equiv),置于反應(yīng)瓶中,加入有機堿(5.0mmo,10equiv)和縮合劑(1.5mmol,6.0equiv),在DMF溶液中,室溫條件下反應(yīng)3小時后,得到進一步與帶有鳥嘌呤肽核酸 單體偶聯(lián)的樹脂;(4)重復(fù)上述操作一次;(5)重復(fù)上述操作,將原料鳥嘌呤肽核酸單體換成苯并吲哚方酸菁染料(Sq-Naphthyl)(1.5mmol,6.0equiv)。(6)10mL三氟乙酸:水:三異丙醇(95:5:5)切割步驟(5)所得與氨基酸依次偶聯(lián)的樹脂,產(chǎn)品經(jīng)C18制備柱分離制備,得到LPA多肽探針1,經(jīng)凍干機凍干處理得到藍(lán)綠色固體56mg。所述有機堿為N,N-二異丙基乙胺,所述耦合劑為六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基。進一步的,所述HPLC方法為使用GEAKTApurifier100系統(tǒng)配備C18制備柱(3cm×25cm,10μm),紫外220nm和400nm雙波長檢測,梯度淋洗50分鐘,流速17mL/min,其中流動相A為超純水(0.05%TFA),B為甲醇(0.05%TFA);起始濃度為30%A和70%B,線性梯度淋洗至100%B。本發(fā)明所涉及所有其它探針的制備均用上述方法制備,根據(jù)所制備的探針適應(yīng)性的調(diào)整所需的原料。效果實施例1.對LPA特異性識別的多肽探針1在體外正常卵巢IOSE80細(xì)胞與卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中的紅色熒光強度的比較。在細(xì)胞層面上檢測對LPA特異性識別的多肽探針1在卵巢癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中紅色熒光強弱。分別在卵巢癌SKOV-3細(xì)胞與正常卵巢IOSE80細(xì)胞中加入1mL濃度為10μM的多肽探針1,孵育60min,吸去孵育液,用磷酸緩沖液洗3次。然后將細(xì)胞置于ImageStreamXMarkII成像流式細(xì)胞儀下成像。實驗發(fā)現(xiàn),由于正常卵巢IOSE80細(xì)胞中LPA很少,多肽探針1紅色熒光沒有明顯增強,紅色熒光較弱,而卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中高表達(dá)LPA,故多肽探針1通過與LPA結(jié)合,卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中紅色熒光 明顯增強。參見圖5,卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中的熒光強度明顯高于正常卵巢IOSE80細(xì)胞的熒光強度。所以可通過細(xì)胞熒光成像的方法檢測LPA從而實現(xiàn)細(xì)胞水平上卵巢癌的檢測。效果實施例2.對LPA特異性識別的多肽探針1在正常小鼠與卵巢癌小鼠血清中的熒光信號的比較建立卵巢癌小鼠模型:大量培養(yǎng)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞,收集對數(shù)生長期的細(xì)胞,去除培養(yǎng)液用PBS洗劑兩次,將細(xì)胞密度調(diào)整到1×107/ml,約1ml,在10只裸鼠的背部右邊靠下面皮下注射0.2ml約2×106細(xì)胞,然后繼續(xù)飼養(yǎng),每天觀察裸鼠的生長情況,并觀察是否有實體瘤生成。確認(rèn)小鼠荷瘤后,腫瘤直徑達(dá)到0.8cm,荷瘤完成。通過比較卵巢癌小鼠與正常小鼠血清中加入多肽探針1后的熒光信號不同進行診斷。分別選取卵巢癌小鼠與正常小鼠血清,加入多肽探針1檢測其熒光信號。實驗發(fā)現(xiàn),由于卵巢癌小鼠的血清中含有LPA,故與多肽探針1結(jié)合時其熒光信號會增強,參見圖6,卵巢癌小鼠的血清的熒光信號均高于正常小鼠血清的熒光信號。說明對LPA特異性識別的多肽探針1具有較高的檢測LPA的靈敏性,具有用于卵巢癌血清早期診斷的潛力,且該方法靈敏,操作簡單。效果實施例3.對LPA特異性識別的多肽探針1在正常小鼠與卵巢癌小鼠體內(nèi)近紅外熒光信號的比較建立卵巢癌小鼠模型:大量培養(yǎng)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞,收集對數(shù)生長期的細(xì)胞,去除培養(yǎng)液用PBS洗劑兩次,將細(xì)胞密度調(diào)整到1×107/ml,約1ml,在10只裸鼠的背部右邊靠下面皮下注射0.2ml約2×106細(xì)胞,然后繼續(xù)飼養(yǎng),每天觀察裸鼠的生長情況,并觀察是否有實體瘤生成。確認(rèn)小鼠荷瘤后,腫瘤直徑達(dá)到0.8cm,荷瘤完成。通過比較卵巢癌小鼠與正常小鼠尾靜脈注射多肽探針1后的近紅外熒光信號不同進行診斷。分別選取卵巢癌小鼠與正常小鼠,尾靜脈注射多肽探針1檢測其熒光信號。 實驗發(fā)現(xiàn),由于卵巢癌小鼠的腫瘤中含有LPA,故與多肽探針1結(jié)合時其熒光信號會增強,參見圖6,卵巢癌小鼠的腫瘤中的近紅外熒光信號均高于正常小鼠相同位置的近紅外熒光信號。說明對LPA特異性識別的多肽探針1在體內(nèi)與LPA特異性結(jié)合濃聚到腫瘤部位,利用近紅外熒光活體成像技術(shù)檢測體內(nèi)LPA,可用于實現(xiàn)腫瘤的篩查和早期診斷,可識別高危人群和早期病變?nèi)巳?,提高了早期卵巢癌病人存活率。為了進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容,但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下表的實施例。其它多肽探針及其效果實施例見表2、3。下表中的多肽探針1-8均用上述制備方法制備,下表2、3中的效果實施例的詳細(xì)步驟均為上述效果實施例1-3的具體操作,此處不再贅述。表2:多肽探針1-8結(jié)構(gòu)式表3:多肽探針1-8實例效果當(dāng)前第1頁1 2 3 
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