本發(fā)明涉及生物組織工程支架技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種藥物/因子控釋薄膜支架及其制備方法。

背景技術(shù)：

慢性牙周炎會(huì)導(dǎo)致牙齦炎癥、牙周組織破壞、牙槽骨丟失，甚至牙齒的脫落，是造成健康人失牙的最主要因素之一。2005年全國(guó)第三次口腔流行病學(xué)調(diào)查公布的數(shù)字顯示，35～44歲牙齦牙周疾病的總患病率為97.2％，而67～74歲牙齦牙周疾病總患病率高達(dá)99.4％。

牙周疾病不僅是引起成年人牙齒脫落的首要原因，更是影響心臟、肺、腎等重要臟器功能的重要因素。據(jù)國(guó)外研究報(bào)道，牙周炎患者發(fā)生冠心病和中風(fēng)的幾率分別為牙周正常者的1.4倍和2.1倍。牙周炎患者發(fā)生慢性肺部感染及肺功能降低的幾率是健康人的2倍。

目前,我國(guó)已逐漸步入老齡化社會(huì)，牙周疾病成為嚴(yán)重危害人民口腔健康和生命質(zhì)量的致病因素；因牙周組織缺損造成的牙齒缺失是危害人民健康的普遍問(wèn)題，嚴(yán)重影響人們的飲食、發(fā)音、美觀和身心健康。

臨床上獲得牙周組織再生的研究重點(diǎn)是支架材料的使用，這種支架材料的作用是組織種子細(xì)胞在牙根表面定植，并且給牙周組織的再生留有一定的空間。牙周組織再生過(guò)程中，種子細(xì)胞成骨分化分為三個(gè)階段，細(xì)胞增殖、胞外基質(zhì)分泌和胞外基質(zhì)礦化?，F(xiàn)有引導(dǎo)牙周組織再生的支架材料，有些通過(guò)緩釋細(xì)胞因子促進(jìn)成骨，但是并不能引導(dǎo)種子細(xì)胞的增殖。

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞是能促進(jìn)牙周組織再生的種子細(xì)胞。研究表明，血小板衍生因子能夠促進(jìn)其細(xì)胞增殖和組織血管化，辛伐他汀能夠促進(jìn)其成骨分化，降低炎癥因子產(chǎn)生，有利于牙周組織再生。

想獲得理想的牙周組織再生必須把這些關(guān)鍵因素聯(lián)合起來(lái)。我們?cè)O(shè)計(jì)因子表層/藥物芯層的膜狀仿生支架材料，表層因子早期控釋促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織血管化，芯層藥物隨支架降解緩釋促進(jìn)抗炎和成骨分化，從而分期控釋，促進(jìn)牙周組織再生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種新型的可用于臨床牙周治療的支架材料，即、因子表層/藥物芯層的膜狀支架材料，以期實(shí)現(xiàn)活性因子和藥物的控釋，促進(jìn)種子細(xì)胞的增殖和成骨分化，從而將組織再生研究中種子細(xì)胞、支架材料和調(diào)節(jié)因子三要素有機(jī)結(jié)合，促進(jìn)牙周修復(fù)，對(duì)于牙周組織工程研究有促進(jìn)作用。

本發(fā)明提供的一種藥物/因子控釋薄膜支架，其特征在于：包括膜狀仿生支架、血小板衍生因子涂層和緩釋層；

血小板衍生因子涂層設(shè)置于膜狀仿生支架的外側(cè)；

緩釋層設(shè)置于血小板衍生因子涂層的外側(cè)；

其中，膜狀仿生支架由對(duì)細(xì)胞成骨分化具有促進(jìn)作用的藥劑、牙骨質(zhì)和牙周膜內(nèi)含有的I型膠原(Col-I)、生物可降解聚合物或高分子材料的混合物，通過(guò)靜電紡絲技術(shù)獲得。

進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及的一種藥物/因子控釋薄膜支架料，還具有這樣的特點(diǎn)：即、血小板衍生因子涂層和緩釋層為多層結(jié)構(gòu)。

進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及的一種藥物/因子控釋薄膜支架料，還具有這樣的特點(diǎn)：即、該生物可降解高分子材料選自可降解人工合成聚酯類聚合物或天然生物可降解高分子材料中的一種或多種的混合物。

進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及的一種藥物/因子控釋薄膜支架料，還具有這樣的特點(diǎn)：即、生物可降解聚合物或高分子材料選自聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、改良?xì)ぞ厶侵械囊环N或多種的混合物。

進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及的一種藥物/因子控釋薄膜支架料，還具有這樣的特點(diǎn)：即、膜狀仿生支架由辛伐他汀、Col-I、聚己內(nèi)酯的混合物，通過(guò)靜電紡絲技術(shù)獲得。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了上述藥物/因子控釋薄膜支架料的制備方法，其特征在于：通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備膜狀仿生支架材料后，通過(guò)層層自組裝技術(shù)在膜狀仿生支架材料表面負(fù)載血小板衍生因子涂層和緩釋層(即、通過(guò)阻隔的方式起到緩釋的效果)。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了上述藥物/因子控釋薄膜支架料的制備方法，還具有這樣的特點(diǎn)：即、具體工藝步驟如下所示：

步驟一、將對(duì)細(xì)胞成骨分化具有促進(jìn)作用的藥劑、牙骨質(zhì)和牙周膜內(nèi)含有的I型膠原、生物可降解聚合物或高分子材料混合攪拌至均勻的靜電紡絲溶液；

步驟二、將靜電紡絲溶液注入靜電紡絲設(shè)備中，通過(guò)控制靜電紡絲流量注射泵的流速在0.01-5ml/min，靜電紡絲高壓發(fā)生儀的電壓在5-70KV范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，控制空間溫度10-85℃、濕度在20％以下，收集距離為5-55cm的載體上的膜狀支架材料；

步驟三、將上述制備好的膜狀支架材料浸入交聯(lián)用溶液中，交聯(lián)0.5-3小時(shí)，用醇和去離子水洗滌多次后，于惰性氣體環(huán)境下干燥待用；

步驟四、配置各種包含有涂層和緩釋層材料的溶液；

步驟五、按需，將膜狀支架材料在各種溶液中分別浸涂5-30分鐘，每次浸涂后用去離子水洗滌至少一次。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了上述藥物/因子控釋薄膜支架料的制備方法，還具有這樣的特點(diǎn)：即、上述牙骨質(zhì)和牙周膜內(nèi)含有的I型膠原的用量參照正常人牙周膜中所含該物質(zhì)的比例；

該I型膠原的用量占支架材料的質(zhì)量百分比含量為10-60％，優(yōu)選為40-50％；

上述對(duì)細(xì)胞成骨分化具有促進(jìn)作用的藥劑的添加量為所述牙骨質(zhì)和牙周膜內(nèi)含有的I型膠原的添加量的1-10％；即、該藥劑的添加量為支架材料總質(zhì)量的0.001-0.6％，優(yōu)選為0.04-0.5％；

余量為生物可降解聚合物或高分子材料。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了上述藥物/因子控釋薄膜支架材料的制備方法，還具有這樣的特點(diǎn)：即、上述牙骨質(zhì)和牙周膜內(nèi)含有的I型膠原、生物可降解聚合物或高分子材料的質(zhì)量比為3-1:10-0.5；優(yōu)選地，該比例為3:7-1:1。

上述對(duì)細(xì)胞成骨分化具有促進(jìn)作用的藥劑的添加量為牙骨質(zhì)和牙周膜內(nèi)含有的I型膠原及生物可降解聚合物或高分子材料的質(zhì)量總和的0.1-5％，優(yōu)選為0.1-1％。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了上述藥物/因子控釋薄膜支架料的制備方法，還具有這樣的特點(diǎn)：即、在步驟一中，將對(duì)細(xì)胞成骨分化具有促進(jìn)作用的藥劑、牙骨質(zhì)和牙周膜內(nèi)含有的I型膠原、生物可降解聚合物或高分子材料溶解于有機(jī)溶劑后形成靜電紡絲溶液；

其中，上述有機(jī)溶劑選自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四氫呋喃、乙醇、甲醇、丙酮、二氯甲烷、氯仿、丙酮、二乙醇二甲醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、二甲基亞砜等等溶劑、六氟異丙醇等常規(guī)可用于靜電紡絲技術(shù)的有機(jī)溶劑；

上述靜電紡絲溶液中各溶質(zhì)總和的質(zhì)量濃度為5-15％。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了上述藥物/因子控釋薄膜支架料的制備方法，還具有這樣的特點(diǎn)：即、上述靜電紡絲流量注射泵的流速優(yōu)選為0.1-1ml/min；

上述靜電紡絲高壓發(fā)生儀的電壓優(yōu)選為5-35KV；

上述空間溫度優(yōu)選為25-35℃；

上述載體優(yōu)選為方形鋁箔；

上述收集距離優(yōu)選為10-35cm；

上述交聯(lián)用溶液優(yōu)選為1-10％的EDC水溶液；

上述包含有涂層材料的溶液選自濃度為1-5mg/ml聚苯乙烯磺酸(PSS)溶液、濃度為1-5mg/ml聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)溶液、濃度為0.1-1mg/ml海藻酸鈉(ALG)溶液、濃度為0.1-1mg/ml膠原(COL)溶液，濃度為0.01-10ug/ml的涂層因子溶液(如：血小板生長(zhǎng)因子等)；

其中，上述涂層因子溶液為生長(zhǎng)因子分散在含有0.1-0.5％人血清白蛋白、濃度為1-4mM的鹽酸溶液中；

上述聚苯乙烯磺酸(PSS)、聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)、海藻酸鈉(ALG)溶液、膠原(COL)溶液中氯化鈉的含量為0.1-0.5M，并調(diào)整pH值至6.5。

本發(fā)明的作用和效果：

本發(fā)明通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備含有藥物的膜狀支架材料，將靜電紡絲作為一種良好緩釋藥物的載體；通過(guò)層層自組裝技術(shù)，在支架材料表面修飾因子納米涂層和緩釋層實(shí)現(xiàn)因子的緩釋，以期通過(guò)因子表層-藥物芯層的膜狀支架材料的結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)因子和藥物的序貫緩釋。

具體地，在本發(fā)明的研究中，通過(guò)對(duì)新型的膜狀支架材料的構(gòu)建，旨在促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞成骨分化。一般來(lái)說(shuō)，間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化分為三個(gè)階段，細(xì)胞增殖、胞外基質(zhì)分泌和胞外基質(zhì)礦化。因子能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和遷移，在成骨分化的早期階段，這有利于促進(jìn)種子細(xì)胞的有絲分裂、增殖和遷移。藥物能夠上調(diào)牙周膜干細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)，在成骨分化后期，促進(jìn)胞外基質(zhì)礦化。本發(fā)明通過(guò)研究成骨分化的不同階段的特點(diǎn)，從而采用因子-藥物序貫釋放的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的增殖和胞外基質(zhì)礦化，促進(jìn)成骨分化的效果。

此外，在本發(fā)明的研究中發(fā)現(xiàn)，如將多種藥物/因子加載于整個(gè)支架材料的不同部位，能夠?qū)崿F(xiàn)不同活性因子和藥物的序貫釋放。故而，在本發(fā)明中，采用構(gòu)建因子表層-藥物芯層的膜狀支架材料，除了材料降解時(shí)按照先表層后芯層實(shí)現(xiàn)序貫釋放，還可以通過(guò)分別調(diào)整表層和/或芯層選用的各材料之間比例來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)降解速率的控釋，從而使得藥物在緩釋的過(guò)程中，變得更為可控和進(jìn)行局部調(diào)整。

此外，在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，通過(guò)層層自組裝技術(shù)構(gòu)建的[PSS/PAH]/[COL/ALG]_n自組裝涂層，能夠顯著改善本發(fā)明制造的靜電紡絲支架材料的親水性，促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞在支架材料上的黏附、增殖。同時(shí)通過(guò)對(duì)n的層數(shù)的調(diào)整，來(lái)進(jìn)一步調(diào)整其緩釋的濃度和速度。

此外，在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，還可通過(guò)調(diào)控材料表面因子負(fù)載的層數(shù)來(lái)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)控釋的效果。

此外，在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，選用聚已內(nèi)酯(PCL)作為芯材的材料之一，該材料是一種半結(jié)晶性的脂肪族聚酯，在生物體內(nèi)降解速率較低，能夠避免因材料快速降解產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物堆積及局部無(wú)菌性炎癥反應(yīng)，因此選用該材料進(jìn)行基礎(chǔ)支架的制造。

此外，在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，選用了辛伐他汀作為芯材的主材之一，該藥物對(duì)細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用的同時(shí)還具有改善血管內(nèi)皮功能、抗炎和抗氧化作用，在本發(fā)明的研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度辛伐他汀即能夠上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞中骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein,BMP-2)的表達(dá)，促進(jìn)成骨分化。

此外，在本發(fā)明的研究中發(fā)現(xiàn)含有PCL的靜電紡絲支架，其親水性欠佳，將會(huì)影響牙周膜干細(xì)胞的黏附效率，故而，在本發(fā)明的基礎(chǔ)支架中，還加入了I型膠原，用于改進(jìn)材料的機(jī)械性能，并有利于間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附和增殖。即、改善支架材料的親水性的同時(shí)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)SMV低濃度緩釋效果。

附圖說(shuō)明

圖1、控釋PDGF/SMV的膜狀支架材料的構(gòu)建示意圖。

具體實(shí)施方式

如圖1所示，為了獲得一種PDGF/SMV能實(shí)現(xiàn)序貫緩釋的支架，具體構(gòu)建方法如下所示：

實(shí)施例一、

步驟一、采用靜電紡絲技術(shù)，制備SMV/Col-I/PCL膜狀仿生支架材料。

參照正常人牙周膜中所含Col-I比例，以Col-I、PCL為主要原料并加入適量SMV，其中，SMV的添加量為Col-I質(zhì)量的15％(或?yàn)?％，5％，10％；25％等不同添加量)，其他為PCL；將上述材料混合后，加入三氯甲烷(或不采用任何有機(jī)溶劑)后，置于磁力攪拌器上攪拌至溶液呈無(wú)色透明黏稠狀的紡絲溶液，溶液的質(zhì)量濃度為6％(或?yàn)?5％、20％、35％；45％等不同的濃度)。

控制靜電紡絲流量注射泵的流速在(0.01-0.02ml/min)，靜電紡絲高壓發(fā)生儀的電壓在(5-15KV)范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，控制空間溫度30-35℃、濕度20％以下，將其收集在方形鋁箔上，收集距離在10-15cm之間。

步驟二、采用層層自組裝技術(shù)，在SMV/Col-I/PCL膜狀支架材料表面負(fù)載PDGF控釋納米涂層。

將上述膜狀支架材料浸入5％EDC水溶液中，室溫下交聯(lián)1小時(shí)，用乙醇和去離子水洗滌多次后，氮?dú)飧稍锎谩?/p>

配制濃度為1mg/mlPAH和PAA聚電解質(zhì)溶液，溶液中NaCl含量為0.15M。將PDGF重新分散在含有0.1％人血清白蛋白濃度為4mM的HCl溶液中，濃度為10ug/ml。

靜電紡絲薄膜在上述每種溶液中浸涂時(shí)間為10分鐘，每次浸涂后用去離子水洗滌2-3次。具體涂覆層數(shù)和順序可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行調(diào)節(jié)，形成PDGF表層/SMV芯層的膜狀支架材料。

實(shí)施例二、

步驟一、采用靜電紡絲技術(shù)，制備SMV/Col-I/PCL膜狀仿生支架材料。

以Col-I、PCL為主要原料并加入適量SMV，其中，Col-I、PCL的質(zhì)量比為1:1(或?yàn)?:0.01；1:0.1；1:0.5；1:2；1:5；1:10；1:100等不同比例)，SMV的添加量為Col-I和PCL總質(zhì)量的25％(或?yàn)?％，5％，10％；35％；55％等不同添加量)；混合后，加入丙酮(或不采用任何有機(jī)溶劑)置于磁力攪拌器上攪拌至溶液呈無(wú)色透明黏稠狀的紡絲溶液，該溶液中溶質(zhì)總和的質(zhì)量百分比濃度為11％(或?yàn)?％、20％、35％；45％等不同的濃度)。

控制靜電紡絲流量注射泵的流速在(0.01-0.02ml/min)，靜電紡絲高壓發(fā)生儀的電壓在(5-15KV)范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，控制空間溫度30-35℃、濕度20％以下，將其收集在方形鋁箔上，收集距離在10-15cm之間。

步驟二、采用層層自組裝技術(shù)，在SMV/Col-Ⅰ/PCL膜狀支架材料表面負(fù)載PDGF(血小板生長(zhǎng)因子)控釋納米涂層。

將上述膜狀支架材料浸入8％EDC水溶液中，室溫下交聯(lián)0.5小時(shí)，用乙醇和去離子水洗滌多次后，氮?dú)飧稍锎谩?/p>

配制濃度為1mg/mlPAH和PAA聚電解質(zhì)溶液，溶液中NaCl含量為0.15M。將BMP-2重新分散在含有0.1％人血清白蛋白濃度為4mM的HCl溶液中，濃度為10ug/ml。

靜電紡絲薄膜在上述每種溶液中交疊浸涂5次，每次8分鐘，每次浸涂后用去離子水洗滌2-3次，形成PDGF表層/SMV芯層的膜狀支架材料。

作為上述實(shí)施例的變形例：

可將SMV替換為其他對(duì)細(xì)胞成骨分化具有促進(jìn)作用的藥劑；

可將PCL替換為聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、改良?xì)ぞ厶?、或膠原，或?yàn)槠浠旌衔?，如：為PCL與聚乳酸-羥基乙酸共聚物質(zhì)量比為1:0.1的混合物，或PCL與膠原質(zhì)量比為1:1的混合物等等。