專利名稱：一種基于生物芯片檢測核酸結(jié)合蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸結(jié)合蛋白的檢測方法，特別是涉及一種基于生物芯片檢測核酸結(jié)合蛋白的方法。
背景技術(shù)：
核酸結(jié)合蛋白包括雙鏈DNA結(jié)合蛋白，單鏈DNA結(jié)合蛋白和RNA結(jié)合蛋白等。
雙鏈DNA結(jié)合蛋白是一類可以與一段特定序列的雙鏈DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)分子或是蛋白質(zhì)分子復合物。雙鏈DNA結(jié)合蛋白主要包括原核生物中的阻遏子、操作子蛋白和真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子等。這些雙鏈DNA結(jié)合蛋白通過與特定序列的DNA雙鏈(operator/promoter)結(jié)合，從而激活、抑制、減弱或是增強特定基因的表達。原核生物中的阻遏子蛋白和操作子蛋白的功能相對簡單，可以調(diào)控編碼細胞代謝過程所需酶類、編碼抗生素耐受基因的表達，使得細胞的生理活動與外界的環(huán)境相適應；真核生物的轉(zhuǎn)錄因子的功能繁多，細胞周期、細胞凋亡、癌變等各種現(xiàn)象都與特定的轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)。在生物體，尤其是真核生物的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，編碼蛋白質(zhì)的基因的表達要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄因子介導的轉(zhuǎn)錄激活，轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后修飾(包括RNA的剪切、加帽和加尾)，翻譯，翻譯后修飾(包括磷酸化、糖基化、乙?；?等過程，在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后三個水平受到調(diào)控。
轉(zhuǎn)錄因子介導的轉(zhuǎn)錄激活作為整個基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的第一環(huán)是非常重要的。生物體對外界環(huán)境的應激反應大多是通過特定的轉(zhuǎn)錄因子開啟或是關(guān)閉一些特定的基因?qū)崿F(xiàn)的。研究表明，絕大多數(shù)的真核生物的基因的表達都受到一個或是一些特定的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。愈是復雜的生物體，編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因一般愈多，基因表達調(diào)控的機制也更為復雜。據(jù)預測，人類基因組中有超過5％的編碼蛋白質(zhì)的基因是編碼轉(zhuǎn)錄因子的。許多轉(zhuǎn)錄因子與癌癥密切相關(guān)。例如有些轉(zhuǎn)錄因子是一些僅僅在惡性腫瘤組織中才表達或是會增強表達的原癌基因的產(chǎn)物(如FOS和C-Myc)，而又有一些轉(zhuǎn)錄因子僅僅在惡性腫瘤組織中微弱表達或是沒有表達(如p53和E2F)。因此，如果可以檢測生物體某一時刻的部分轉(zhuǎn)錄因子或是全部轉(zhuǎn)錄因子的表達水平，再結(jié)合已知的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因的數(shù)據(jù)，就可以得到轉(zhuǎn)錄前水平的調(diào)控信息，可能用以診斷組織是否發(fā)生癌變，還可以篩選藥物靶點，研究一些細胞應激反應的機制，觀察細胞的信號通路的激活或是關(guān)閉等。
現(xiàn)有的cDNA微陣列技術(shù)可以給出全基因組水平所有轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的mRNA表達狀況的數(shù)據(jù)。但是只有具有活性的轉(zhuǎn)錄因子才可以調(diào)控基因的表達，而轉(zhuǎn)錄因子的活性往往受到磷酸化，乙?；?，糖基化等多種修飾方式的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子在細胞中的定位也會影響轉(zhuǎn)錄因子的活性，所以具有活性的轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量和轉(zhuǎn)錄因子的mRNA或是蛋白水平的表達狀況并不是直接相關(guān)的。例如在細胞周期各個階段中，轉(zhuǎn)錄因子Yin Yang 1(YY1)的mRNA和蛋白水平的表達幾乎是恒定的，但是具有活性的YY1數(shù)量是隨著細胞周期有規(guī)律變化。所以cDNA微陣列從理論上是不能給出生物學家感興趣的轉(zhuǎn)錄因子表達譜數(shù)據(jù)的。
常規(guī)的“活性”雙鏈DNA結(jié)合蛋白(轉(zhuǎn)錄因子)的檢測方法是凝膠滯留法(EMSAElectrophoretic Mobility Shift Assay，gel shift，band shift)。將待測蛋白質(zhì)樣品與已知的帶有同位素標記的DNA雙鏈分子混合反應后，在非變性的條件下進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。由于在電泳過程中，結(jié)合了蛋白質(zhì)的雙鏈核酸分子比沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的雙鏈核酸分子遷移的慢一些，電泳后通過放射自顯影，可以在膠片上得到分立的電泳條帶，從而可以判斷是否有預期的雙鏈核酸和結(jié)合蛋白的相互作用的發(fā)生。近年來，凝膠滯留技術(shù)也得到了一些改進，例如使用熒光或是化學放光技術(shù)替代同位素進行檢測。針對非特異結(jié)合現(xiàn)象，使用特異的雙鏈DNA結(jié)合蛋白的抗體進行DNA-結(jié)合蛋白復合物的檢測，稱為Super-shift。凝膠滯留法這項技術(shù)的出現(xiàn)極大地推動了DNA和蛋白質(zhì)相互作用的研究工作，但是它存在著明顯的缺點操作復雜；耗時耗力，往往需要一整天的時間進行實驗；檢測通量低，一次僅僅能對一種雙鏈核酸結(jié)合蛋白進行檢測，檢測多種雙鏈核酸結(jié)合蛋白時，需要的樣品量較多；檢測如果使用同位素，對人體有潛在的傷害，如果使用化學發(fā)光或是熒光，價格昂貴。
美國的BD Biosciences Clontech公司(Palo Alto，CA)推出了一種MercuryTM轉(zhuǎn)錄因子試劑盒(MercuryTMTranscription Factor Kit)。該試劑盒給出了用以檢測轉(zhuǎn)錄因子的96孔板。96孔板上的每個孔里包被有帶有可以與一種轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的核酸序列的雙鏈DNA探針。將待檢測樣品加入孔中進行反應，探針就會與待測樣品中對應的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。清洗后，再加入特異識別該轉(zhuǎn)錄因子的一抗，再加入酶標記的二抗與一抗結(jié)合，進行化學發(fā)光檢測。該技術(shù)大大縮短了傳統(tǒng)的凝膠滯留方法的實驗時間，使用化學發(fā)光技術(shù)替代了可能對人體產(chǎn)生傷害的同位素。但是仍然存在通量較低的問題，即一次(一個孔中進行的反應)僅僅能對一種轉(zhuǎn)錄因子進行檢測；檢測多種雙鏈核酸結(jié)合蛋白時，需要的樣品量較多；反應需要使用特異識別轉(zhuǎn)錄因子的抗體，而大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子并沒有滿足上述方法需要的商業(yè)化的一抗。
生物體內(nèi)還有一些序列特異的單鏈DNA結(jié)合蛋白和RNA結(jié)合蛋白，它們大多可以調(diào)節(jié)生物體的生理活動。此外，通過體外進化(in vitro evolution)的方法，可以篩選出與靶標蛋白分子特異結(jié)合的類似于抗體的核酸配體，這些核酸結(jié)合蛋白還沒有相應的高通量的分析方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測通量高、靈敏特異的基于生物芯片檢測核酸結(jié)合蛋白的方法。
本發(fā)明所述提供的基于生物芯片檢測核酸結(jié)合蛋白的方法，包括如下步驟1)將含有若干組核酸捕獲探針的溶液加入到含有若干待檢核酸結(jié)合蛋白的生物樣品體系中，形成核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物，所述核酸捕獲探針的核酸序列含有至少一段能與目的核酸結(jié)合蛋白相結(jié)合的結(jié)合序列；2)分離出所述核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物，然后回收核酸捕獲探針；3)將步驟2)所回收核酸捕獲探針與固定在生物芯片基質(zhì)上，且與所述核酸捕獲探針對應的若干條單鏈固定化探針進行雜交，所述固定化探針的核酸序列與其對應的所述核酸捕獲探針或核酸捕獲探針中的一條鏈互補；4)檢測雜交結(jié)果。
其中，步驟2)所述分離出所述核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物按如下五種過程進行a)將步驟1)所得混合樣品用常規(guī)凝膠電泳分離，經(jīng)切膠、用試劑盒分離或用電洗脫得到所述核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物。b)將步驟1)所得混合樣品采用色譜柱方法分離得到核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物。c)將步驟1)所得混合樣品通過濾膜，分離得到核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物，所述濾膜可以吸附蛋白。d)將步驟1)所得混合樣品中加入可以特異識別各個核酸結(jié)合蛋白的抗體，使用類似于抗體純化的方法(例如使用protein A/G包被的agarose珠體結(jié)合抗體)，分離得到核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物。e)將步驟1)所得混合樣品用毛細管電泳設(shè)備進行分離，自動收集所述核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物。
本發(fā)明方法可命名為“末端標記法”，可以用來檢測核酸結(jié)合蛋白，如雙鏈DNA結(jié)合蛋白，單鏈DNA結(jié)合蛋白，RNA結(jié)合蛋白(如HuB，HuC，ELAV等)等，通過體外進化方法篩選出來的非天然的可以結(jié)合蛋白分子的核酸配體(如凝血酶(thrombin)的核酸配體(aptamer)等)也可以應用本發(fā)明方法進行檢測。
在本發(fā)明中，所述核酸結(jié)合蛋白優(yōu)選為雙鏈DNA結(jié)合蛋白，更優(yōu)選的是轉(zhuǎn)錄因子，如AP1，Sp1，p53，E2F等。
在應用本發(fā)明方法進行檢測時，其中優(yōu)選的情況是所述核酸捕獲探針的核酸序列含有一段能與目的核酸結(jié)合蛋白相結(jié)合的結(jié)合序列；每組所述核酸捕獲探針的一條核酸鏈的一端均帶有一段突出端序列。
為了能提高核酸捕獲探針與固定化探針的雜交能力，所述固定化探針與其對應的所述核酸捕獲探針中的帶有突出端序列的核酸鏈完全互補。
為方便進行雜交信號檢測，所述核酸捕獲探針中的帶有突出端序列的核酸鏈的一端還帶有標記分子，其中，優(yōu)選為生物素，第高辛，熒光標記，量子點，金顆粒，納米顆粒。
為提高檢測靈敏度，可以對本發(fā)明方法進行如下改進(“雜交前進行單鏈擴增法”)每組所述核酸捕獲探針的一條核酸鏈的3’端還均帶有一段3’突出端序列，進行步驟3)所述雜交前，還利用一條引物對所述回收核酸捕獲探針進行擴增，所述引物能與所述核酸捕獲探針中的帶有3’突出端序列的核酸鏈雜交，以便于進行隨后的核酸擴增步驟。
其中，優(yōu)選的情況是每組所述核酸捕獲探針的一條帶有3’突出端序列的核酸鏈中的所述3’突出端序列均相同，所述引物的序列與所述3’突出端序列完全互補。
此時，為方便進行雜交信號檢測，可以在體系中加入標記分子，可以先使引物分子末端帶有標記分子再進行擴增，也可以在進行擴增時在擴增原料中摻有帶標記分子的核苷酸，其中，標記分子優(yōu)選為生物素，第高辛，熒光標記，量子點，金顆粒，納米顆粒。
為提高檢測靈敏度，可以對本發(fā)明方法進行另一種改進(“雜交前進行雙鏈擴增法”)每組所述核酸捕獲探針的一條核酸鏈的3’端和5’端還均分別帶有一段3’突出端序列和一段5’突出端序列；進行步驟3)所述雜交前，還利用兩條引物對所述回收核酸捕獲探針進行擴增，所述兩條引物中的一條能與所述核酸捕獲探針中的帶有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸鏈的3’突出端雜交，另外一條引物的序列和所述核酸捕獲探針中的帶有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸鏈的5’突出端一致。
其中，優(yōu)選的情況是所述核酸捕獲探針的帶有3’突出端序列和5’突出端的核酸鏈中的所述3’突出端序列均相同，所述核酸捕獲探針的帶有3’突出端序列和5’突出端的核酸鏈中的所述5’突出端序列均相同，所述兩條引物一條能與所述核酸捕獲探針中的帶有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸鏈的3’突出端雜交，另外一條引物的序列和所述核酸捕獲探針中的帶有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸鏈的5’突出端一致。
采用雙鏈擴增法進行檢測的操作流程如圖7所示，將捕獲探針1與目的蛋白3(圖中為圓形和三角形)混合反應，經(jīng)分離后得到核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物4，回收捕獲探針；用兩條引物6對所回收捕獲探針進行擴增，擴增后的產(chǎn)物與固定有固定化探針2的芯片5進行雜交，檢測雜交信號即可得到檢測結(jié)果。所用的捕獲探針、固定化探針和引物的優(yōu)選結(jié)構(gòu)如圖8所示捕獲探針含有一個目的蛋白的結(jié)合序列，其兩條鏈中的一條帶有3’突出端和5’突出端；引物1的序列與該3’突出端序列互補，引物2的序列和5’突出端一致；固定化探針序列與該結(jié)合序列一致。
同樣，為方便進行雜交信號檢測，可以在體系中加入標記分子，可以先使引物分子末端帶有標記分子再進行擴增，也可以在進行擴增時在擴增原料中摻有帶標記分子的核苷酸，其中，標記分子優(yōu)選為生物素，第高辛，熒光標記，量子點，金顆粒，納米顆粒。
本發(fā)明采用生物芯片方法進行核酸結(jié)合蛋白，特別是轉(zhuǎn)錄因子的檢測，通過捕獲探針與固定化探針的雜交信號檢測，具有檢測靈敏度高和檢測通量高的優(yōu)點；而且，當采用本發(fā)明的兩種改進方法(雜交前單鏈擴增、雜交前雙鏈擴增)時，可以先對引物進行預先標記，而不再需要對每組核酸捕獲探針進行分子標記修飾，能大大降低實驗成本。本發(fā)明方法可以廣泛用于疾病診斷、藥物靶標篩選、疾病機理等領(lǐng)域。


圖1為本發(fā)明的使用“末端標記法”檢測多種核酸結(jié)合蛋白的操作流程示意圖；圖2為本發(fā)明的使用“末端標記法”檢測多種核酸結(jié)合蛋白的探針結(jié)構(gòu)示意圖；圖3A為實施例1芯片點陣設(shè)計圖；圖3B為實施例1同時檢測三種結(jié)合蛋白的實驗結(jié)果；圖3C為實施例1同時檢測三種結(jié)合蛋白的實驗結(jié)果，結(jié)合反應體系中加入了AP1的競爭性結(jié)合探針；圖3D為實施例1同時檢測三種結(jié)合蛋白的實驗結(jié)果，結(jié)合反應體系中加入了NFkB的競爭性結(jié)合探針；圖3E為實施例1同時檢測三種結(jié)合蛋白的實驗結(jié)果，結(jié)合反應體系中加入了Sp1的競爭性結(jié)合探針；圖4為本發(fā)明的使用“單鏈擴增法”檢測多種核酸結(jié)合蛋白的操作流程示意圖；圖5為本發(fā)明的使用“單鏈擴增法”檢測多種核酸結(jié)合蛋白的探針、引物結(jié)構(gòu)示意圖；圖6A為實施例2使用“單鏈擴增法”同時檢測三種結(jié)合蛋白(AP1、NFkB、Sp1)的實驗結(jié)果；圖6B為實施例2采用與實施例1相同的“末端標記法”進行檢測的實驗結(jié)果；圖7為本發(fā)明的使用“雙鏈擴增法”檢測多種核酸結(jié)合蛋白的操作流程示意圖；圖8為本發(fā)明的使用“雙鏈擴增法”檢測多種核酸結(jié)合蛋白的探針、引物結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
實施例1、使用DNA芯片同時檢測3種核酸結(jié)合蛋白AP1，NFkB和Sp1(末端標記法)采用末端標記法進行檢測的操作流程如圖1所示，將捕獲探針1與目的蛋白3(圖中為圓形和三角形)混合反應，經(jīng)分離后得到核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物4，回收捕獲探針，然后與固定有固定化探針2的芯片5進行雜交，檢測雜交信號即可得到檢測結(jié)果。
其中，所用的捕獲探針和固定化探針的優(yōu)選探針結(jié)構(gòu)如圖2所示捕獲探針含有一個目的蛋白的結(jié)合序列，其兩條鏈中的一條帶有突出端和標記分子，圖中為生物素(biotin)；固定化探針與捕獲探針中的長鏈互補。
試驗材料轉(zhuǎn)錄因子AP-1(c-Jun)(#E3061)，NFkB(p50)(#E3770)和Sp1(#E6391)來自Promega公司(Madison，WI)。通用結(jié)合緩沖液的成分為10mM Tris-HCl(pH7.5)，4％甘油，1mM MgCl2，0.5mM EDTA，5mM DTT，50mM NaCl，0.05mg/mL poly(dI-dC)·(dI-dC)。使用的電泳緩沖液是0.5×TBE(0.9M Tris堿，0.9M硼酸，0.02M EDTA，pH8.0)。PBST(磷酸緩沖液，0.1％Tween 20)作為清洗液。電泳用瓊脂糖來自Biowest公司(Miami，F(xiàn)L)。牛血清白蛋白(BSA)購自Amresco公司(Solon，OH)。Cy3標記的鏈霉親和素購自Amersham Biosciences(Uppsala，Sweden)。
實驗步驟A.DNA探針的制備所有的探針都由上海博亞公司合成，探針的序列見表1(表中AP-1-IP為AP1的固定探針，AP-1-LP、AP-1-FP組成為AP1的捕獲探針，AP-1-CP和AP-1-FP組成為AP1的競爭性結(jié)合探針，其他探針的表示與此類似；本實施例LP探針的突出端序列為5’-CGGGA-3’。)。每組中的固定探針都先用水溶解，配置在50％二甲亞砜(DMSO)的溶液中，探針的終濃度為10微摩爾每升。蛋白捕獲探針都用水溶解，再把對應的探針(每組探針中的FP和LP探針)退火形成雙鏈，其中每組探針的終濃度都為60納摩爾每升。
B.DNA芯片的制作使用PixSys5500(Cartesian Technologies，Irvine，CA)機械手將上述的固定探針按照圖3A的點陣模式點制到氨基修飾的玻片上，點間距為350微米。點樣完畢后，玻片在80攝氏度的溫箱中烘烤1小時，再使用紫外膠連儀，在250毫焦的能量下膠連以固定點在玻片表面的核酸分子。圖3A中A1-A5為AP1固定探針，B1-B5為NFkB固定探針，C1-C5為Sp1固定探針，D1-D5為TFIID固定探針，E1-E5為NC固定探針，F(xiàn)1-F5為HC固定探針，A6、B6、C6、D6、E6、F6為點樣對照，該點樣對照是一種本身帶有熒光素的核酸分子，在點樣結(jié)束后掃描玻片，可以檢測到點樣對照，證明玻片點樣的步驟正確。
C.核酸—蛋白結(jié)合體系的配置將三種轉(zhuǎn)錄因子(1.0μg AP1，300ng NFkB和1.0μgSp1)和蛋白捕獲探針(就是LP和FP的退火產(chǎn)物)混合，加入通用結(jié)合緩沖液，使得緩沖液的終濃度達到1X。反應體系在室溫結(jié)合30分鐘。進行圖3C、圖3D、圖3E所描述的實驗時，在反應體系中還加有競爭性結(jié)合探針(CP)。
D.核酸—蛋白結(jié)合體系的分離預先配置2％的瓊脂糖凝膠和電泳用的TBE緩沖液，并預冷到4℃。將上述結(jié)合反應體系加入凝膠的加樣孔，在120伏電壓下電泳20分鐘。根據(jù)電泳緩沖液中溴酚蘭指示劑的位置，切出所需要的凝膠部分。
E.核酸的回收使用Qiagen公司的QIAGEN II型凝膠回收試劑盒回收上一步驟中得到的凝膠中的核酸，按照產(chǎn)品說明書進行。
F.芯片的雜交分析將上步得到的核酸，配置成15微升體系的雜交液(雜交液中還加有HC-LP探針)，其中含有3XSSC和0.1％的SDS，加到DNA芯片上，在65℃雜交1小時。然后使用0.2XSSC和0.1％SDS的清洗液清洗玻片，室溫10分鐘，再1000轉(zhuǎn)/分甩干玻片。在芯片上加入1％BSA進行封閉，反應條件為37℃30分鐘。使用PBST清洗玻片，室溫10分鐘，再1000轉(zhuǎn)/分甩干玻片。加15微升的1微克/毫升濃度的Cy3標記的鏈霉親和素到芯片表面，37℃反應1小時。使用PBST清洗玻片，室溫10分鐘，再1000轉(zhuǎn)/分甩干玻片。使用Scanarray 4000掃描儀進行圖像掃描，圖像使用GenePix進行分析處理。其中圖3A是芯片的點陣設(shè)計圖；圖3B是使用“末端標記法”在芯片上同時檢測3種核酸結(jié)合蛋白的實驗結(jié)果；圖3C是使用“末端標記法”在芯片上同時檢測3種核酸結(jié)合蛋白的實驗結(jié)果，結(jié)合反應體系中加入了核酸結(jié)合蛋白AP1的競爭性結(jié)合探針；圖3D是使用“末端標記法”在芯片上同時檢測3種核酸結(jié)合蛋白的實驗結(jié)果，結(jié)合反應體系中加入了核酸結(jié)合蛋白NFkB的競爭性結(jié)合探針；圖3E是使用“末端標記法”在芯片上同時檢測3種核酸結(jié)合蛋白的實驗結(jié)果，結(jié)合反應體系中加入了核酸結(jié)合蛋白Sp1的競爭性結(jié)合探針。結(jié)果表明，采用本發(fā)明的“末端標記方法”可以很明顯地檢測出三種轉(zhuǎn)錄因子，而NC中的序列來自于原核生物噬菌體的啟動子序列，和真核生物的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列差異很大，不能與任何一個上述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，所以NC探針的信號始終為陰性；HC是作為雜交對照，在雜交之前加入，用以對不同的點陣進行歸一化處理，所以HC信號始終為陽性。
表1.幾種轉(zhuǎn)錄因子的固定探針和捕獲探針的探針序列表


實施例2、使用DNA芯片同時檢測3種核酸結(jié)合蛋白AP1，NFkB和Sp1(單鏈擴增法)采用單鏈擴增法進行檢測的操作流程如圖4所示，將捕獲探針1與目的蛋白3(圖中為圓形和三角形)混合反應，經(jīng)分離后得到核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物4，回收捕獲探針；用引物6對所回收捕獲探針進行擴增，擴增后的產(chǎn)物與固定有固定化探針2的芯片5進行雜交，檢測雜交信號即可得到檢測結(jié)果。
其中，所用的捕獲探針、固定化探針和引物的優(yōu)選設(shè)計原理如圖5所示捕獲探針含有一個目的蛋白的結(jié)合序列，其兩條鏈中的一條帶有3’突出端；引物序列與該3’突出端互補；固定化探針與該結(jié)合序列一致。
試驗材料轉(zhuǎn)錄因子AP-1(c-Jun)(#E3061)，NFkB(p50)(#E3770)和Sp1(#E6391)來自Promega公司(Madison，WI)。通用結(jié)合緩沖液的成分為10mM Tris-HCl(pH7.5)，4％甘油，1mM MgCl2，0.5mM EDTA，5mM DTT，50mM NaCl，0.05mg/mL poly(dI-dC)·(dI-dC)。使用的電泳緩沖液是0.5×TBE(0.9M Tris堿，0.9M硼酸，0.02M EDTA，pH8.0)。PBST(磷酸緩沖液，0.1％Tween 20)作為清洗液。電泳用瓊脂糖來自Biowest公司(Miami，F(xiàn)L)。牛血清白蛋白(BSA)購自Amresco公司(Solon，OH)。Cy3標記的鏈霉親和素購自Amersham Biosciences(Uppsala，Sweden)。
實驗步驟A.DNA探針的制備探針都由上海博亞公司合成，探針的序列見表2(每組探針中的LFP和LP’探針組成為對應轉(zhuǎn)錄因子的捕獲探針；IP探針為固定探針)。每組中的固定探針制備方法同實施例1中的“DNA探針制備”部分。蛋白捕獲探針都用水溶解，再把對應的探針(每組探針中的LFP和LP’探針)退火形成雙鏈，其中每組探針的終濃度都為60納摩爾每升。
B.DNA芯片的制作同實施例1中的“DNA芯片的制作”部分。
C.核酸—蛋白結(jié)合體系的配置將三種轉(zhuǎn)錄因子(1.0μg AP1，100ng NFkB和0.1μgSp1)和蛋白捕獲探針混合，加入通用結(jié)合緩沖液，使得緩沖液的終濃度達到1X。反應體系在室溫結(jié)合30分鐘。
D.核酸—蛋白結(jié)合體系的分離預先配置2％的瓊脂糖凝膠和電泳用的TBE緩沖液，并預冷到4℃。將上述結(jié)合反應體系加入凝膠的加樣孔，在120伏電壓下電泳20分鐘。根據(jù)電泳緩沖液中溴酚蘭指示劑的位置，切出所需要的凝膠部分。
E.核酸的回收使用Qiagen公司的QIAGEN II型凝膠回收試劑盒回收上一步驟中得到的凝膠中的核酸，按照產(chǎn)品說明書進行。最后用20微升的洗脫液進行洗脫。
F.芯片的雜交分析將上步得到的核酸，真空抽干，加入5微升水重新溶解，加入dNTP和PCR的緩沖液，再加入帶有Cy3標記的T7 Pro的引物進行核酸擴增。PCR程序是95度5分鐘；95度30秒，53度30秒，72度20秒，重復40個循環(huán)；73度7分鐘。擴增產(chǎn)物真空抽干，用5微升水重新溶解，配置成15微升體系的雜交液(HC-LP探針也于此時加入到雜交液中)，其中含有3XSSC和0.1％的SDS，加到DNA芯片上，在65℃雜交1小時。然后使用0.2XSSC和0.1％SDS的清洗液清洗玻片，室溫10分鐘，再1000轉(zhuǎn)/分甩干玻片。使用Scanarray 4000掃描儀進行圖像掃描，圖像使用GenePix進行分析處理。
以采用實施例1的“末端標記法”進行本實施例三種蛋白的檢測，作為本實施例檢測結(jié)果的對照。
檢測結(jié)果分別如圖6A和圖6B所示，圖6A是采用“單鏈擴增法”進行檢測的實驗結(jié)果圖；圖6B為采用實施例1的“末端標記法”進行檢測的結(jié)果圖，圖中，A1-A5為AP1檢測結(jié)果點；B1-B5為NFkB檢測結(jié)果點；C1-C5為雜交對照點(HC點，HC-IP與HC-LP序列見表1)；D1-D5為Sp1檢測結(jié)果點。結(jié)果表明，采用單鏈擴增法進行檢測可以提高本發(fā)明方法的檢測靈敏度，使采用末端標記法不能檢測出來的信號點也能清楚、靈敏地檢測出來。
表2.帶3’突出端序列的探針序列表

權(quán)利要求
1.一種基于生物芯片檢測核酸結(jié)合蛋白的方法，包括如下步驟1)將含有若干組核酸捕獲探針的溶液加入到含有若干待檢核酸結(jié)合蛋白的生物樣品體系中，形成核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物，所述核酸捕獲探針的核酸序列含有至少一段能與目的核酸結(jié)合蛋白相結(jié)合的結(jié)合序列；2)分離出所述核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物，然后回收核酸捕獲探針；3)將步驟2)所回收核酸捕獲探針與固定在生物芯片基質(zhì)上，且與所述核酸捕獲探針對應的若干條單鏈固定化探針進行雜交，所述固定化探針的核酸序列與其對應的所述核酸捕獲探針或核酸捕獲探針中的一條鏈互補；4)檢測雜交結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述分離出所述核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物按如下過程進行將步驟1)所得混合樣品用凝膠電泳分離，經(jīng)切膠、用試劑盒分離或用電洗脫得到所述核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述分離出所述核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物按如下過程進行將步驟1)所得混合樣品采用色譜柱方法分離得到核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述分離出所述核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物按如下過程進行將步驟1)所得混合樣品通過濾膜，分離得到核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物，所述濾膜可以吸附蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述分離出所述核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物按如下過程進行將步驟1)所得混合樣品中加入可以特異識別各個核酸結(jié)合蛋白的抗體，使用抗體純化的方法，分離得到核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述分離出所述核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物按如下過程進行將步驟1)所得混合樣品用毛細管電泳進行分離，收集所述核酸捕獲探針—核酸結(jié)合蛋白復合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述核酸結(jié)合蛋白為雙鏈DNA結(jié)合蛋白，RNA結(jié)合蛋白，單鏈DNA結(jié)合蛋白或通過體外進化方法篩選出來的非天然的可以結(jié)合蛋白分子的核酸配體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述雙鏈DNA結(jié)合蛋白為轉(zhuǎn)錄因子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的方法，其特征在于所述核酸捕獲探針的核酸序列含有一段能與目的核酸結(jié)合蛋白相結(jié)合的結(jié)合序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于每組所述核酸捕獲探針的一條核酸鏈的一端均帶有一段突出端序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述固定化探針與其對應的所述核酸捕獲探針中的帶有突出端序列的核酸鏈完全互補。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述核酸捕獲探針中的帶有突出端序列的核酸鏈還帶有標記分子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述標記分子為生物素，第高辛，熒光標記，量子點，金顆粒或納米顆粒。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的方法，其特征在于每組所述核酸捕獲探針的一條核酸鏈的3’端還均帶有一段3’突出端序列，進行步驟3)所述雜交前，還利用一條引物對所述回收核酸捕獲探針進行擴增，所述引物能與所述核酸捕獲探針中的帶有3’突出端序列的核酸鏈雜交。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于每組所述核酸捕獲探針的一條帶有3’突出端序列的核酸鏈中的所述3’突出端序列均相同，所述引物的序列與所述3’突出端序列完全互補。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于所述利用一條引物進行擴增時所述引物中還摻有標記分子。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于所述引物分子的5’端帶有標記分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述標記分子為生物素，第高辛，熒光標記，量子點，金顆粒或納米顆粒。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于所述利用一條引物進行擴增時還在擴增原料中摻有帶標記分子的核苷酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于所述標記分子為生物素，第高辛，熒光標記，量子點，金顆?；蚣{米顆粒。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的方法，其特征在于每組所述核酸捕獲探針的一條核酸鏈的3’端和5’端還均分別帶有一段3’突出端序列和一段5’突出端序列；進行步驟3)所述雜交前，還利用兩條引物對所述回收核酸捕獲探針進行擴增，所述兩條引物中的一條能與所述核酸捕獲探針中的帶有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸鏈的3’突出端雜交，另外一條引物的序列和所述核酸捕獲探針中的帶有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸鏈的5’突出端一致。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于所述核酸捕獲探針的帶有3’突出端序列和5’突出端的核酸鏈中的所述3’突出端序列均相同，所述核酸捕獲探針的帶有3’突出端序列和5’突出端的核酸鏈中的所述5’突出端序列均相同，所述兩條引物一條能與所述核酸捕獲探針中的帶有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸鏈的3’突出端雜交，另外一條引物的序列和所述核酸捕獲探針中的帶有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸鏈的5’突出端一致。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于所述利用兩條引物進行擴增時所述引物中還摻有標記分子。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于所述引物分子的5’端帶有標記分子。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于所述標記分子為生物素，第高辛，熒光標記，量子點，金顆?；蚣{米顆粒。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于所述利用兩條引物進行擴增時還在擴增原料中摻有帶標記分子的核苷酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于所述標記分子為生物素，第高辛，熒光標記，量子點，金顆粒或納米顆粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于生物芯片檢測核酸結(jié)合蛋白的方法，包括如下步驟1)將含有若干組核酸捕獲探針的溶液加入到含有若干待檢核酸結(jié)合蛋白的生物樣品體系中，形成核酸捕獲探針－核酸結(jié)合蛋白復合物，所述核酸捕獲探針的核酸序列含有至少一段能與目的核酸結(jié)合蛋白相結(jié)合的結(jié)合序列；2)分離出所述核酸捕獲探針－核酸結(jié)合蛋白復合物，然后回收核酸捕獲探針；3)將步驟2)所回收核酸捕獲探針與固定在生物芯片基質(zhì)上，且與所述核酸捕獲探針對應的若干條單鏈固定化探針進行雜交，所述固定化探針的核酸序列與其對應的所述核酸捕獲探針或核酸捕獲探針中的一條鏈互補；4)檢測雜交結(jié)果。本發(fā)明可以廣泛用于疾病診斷、藥物靶標篩選、疾病機理等領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/68GK1635165SQ20041009042
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月18日
發(fā)明者邵威, 趙永超, 孫義民, 喬繼英, 魏華江, 楊衛(wèi)平, 周玉祥, 程京 申請人:北京博奧生物芯片有限責任公司, 清華大學