專利名稱：含有肽載體和表皮生長因子的融合蛋白和核酸及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表皮生長因子的修飾。具體地，本發(fā)明涉及具有強穿透能力的經(jīng)修飾表皮生長因子、其編碼核酸、含有它們的組合物和它們的用途。
背景技術(shù)：
表皮生長因子是1962年Cohen(Life Sci.1965，4(17)1625-33)在小鼠頜下腺中發(fā)現(xiàn)、提取和分離出來的，由53個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，多肽中沒有丙氨酸，苯丙氨酸和賴氨酸。它有三個二硫鍵，這些二硫鍵是它具有生物活性所必需的。EGF通過傳導(dǎo)信號，引起細胞內(nèi)一系列生化變化，啟動與細胞分裂有關(guān)的基因，使靜止細胞進入細胞分裂周期，從而使細胞增殖。極微量即能強烈促進細胞的分裂和生長。EGF不易穿透皮膚，也不易穿透粘膜，故只適合創(chuàng)口及粘膜表面，限制了其深層組織及全身用藥的可能性。本發(fā)明將具有極強穿透能力的肽載體與之結(jié)合，克隆表達出人EGF融合蛋白，巧妙地解決了這一問題。
肽載體是人們近年來發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)功能域，它能夠引領(lǐng)其所承載的蛋白質(zhì)穿過漿膜，并在細胞內(nèi)積累，所以把它們稱為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domain，PTD)(Schwarze SR，DowdySF，Trends Pharmacol Sci.2000，21(2)45-8，F(xiàn)awell，Proc NatlAcad Sci USA.1994 Jan 18；91(2)664-8.)?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種PTD，分別來自果蠅的同源異型轉(zhuǎn)錄蛋白Antp(Derossi D，et al.TheJournal of Biological chemistry.1996，27(30)18188-18193.)、單純皰疹病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP22(Elliott C，Ohare P.Cell.1997，88223-233)和人類I型免疫缺陷病毒的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(Trans-activator transcription，TAT)(Fawell S.，Proc Natl AcadSci USA.1994 Jan 18；91(2)664-8.)及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST)(Shigeyuki Namiki etc，Biochemical and Biophysical Research Communication 2003，305592-7)。人類免疫缺陷病毒編碼的反式激活蛋白TAT(86個氨基酸殘基組成)在結(jié)構(gòu)上可被劃分為五個功能區(qū)(1)N端區(qū)域(氨基酸1-21)；(2)富含半胱氨酸的區(qū)域(氨基酸22-37)；(3)核心區(qū)域(氨基酸38-48)；(4)基礎(chǔ)區(qū)域(氨基酸48-57)；(5)可變長度的C端。對TAT通過細胞膜的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用研究發(fā)現(xiàn)，TAT分子中一個富含堿性氨基酸，有較多正電荷的多肽片段與跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，因而被稱為PTD，即蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
目的蛋白與PTD融合后，就可以很容易地將目的蛋白帶入細胞中去。PTD的作用有以下特點(1)速度快；(2)溫度適應(yīng)性廣；(3)目的蛋白進入細胞的數(shù)量依賴于培養(yǎng)液中融合蛋白的濃度；(4)融合蛋白幾乎能夠進入所有的培養(yǎng)細胞；(5)將融合蛋白注射入動物的腹腔，可以在很短時間內(nèi)，到達所有的組織和器官；(6)能夠被PTD帶入細胞和機體的物質(zhì)品種繁多，小分子化學(xué)物質(zhì)、多肽、分子量從幾千的多肽到幾十萬的蛋白質(zhì)和核酸等都可被其引導(dǎo)進入細胞，甚至直徑40納米的鐵珠和直徑200納米的脂質(zhì)體等也能被帶進細胞(Steven RS，Alan Ho，Adamina V et al.Science，1999，2851569-1572)。
PTD介導(dǎo)穿越細胞膜的機制與受體、轉(zhuǎn)運蛋白都沒有關(guān)系。PTD首先通過其自身的正電荷與細胞膜表面的負電荷相互作用，使融合蛋白依附在細胞膜上，然后通過α-螺旋的穿越作用使融合蛋白進入細胞。被PTD帶入細胞的分子仍保留其原有的性質(zhì)。PTD融合分子可以穿越皮膚、粘膜、甚至血腦屏障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面涉及包含肽載體序列和表皮生長因子(EGF)的融合蛋白。優(yōu)選地，肽載體序列是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。
在本發(fā)明中，表皮生長因子(EGF)可以是天然存在的，也可以是重組產(chǎn)生的或者合成產(chǎn)生的。在一個實施方案中，EGF是人EGF，例如重組人EGF。在一個具體實施方案中，表皮生長因子具有SEQ ID NO2所示的序列。
本發(fā)明的EGF包含等位基因變體和物種同系物，還包括突變體和變異體，它們保持EGF活性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，可以對EGF序列和肽載體序列例如本文公開的序列進行適當(dāng)修飾，例如增加、替換、缺失一個或多個(如不超過20個，優(yōu)選不超過15個，更優(yōu)選不超過10個，8個，5個，甚至更優(yōu)選不超過4個、3個、2個、1個)氨基酸，而仍然保留其活性。因此，本發(fā)明包括這些修飾的變異體在內(nèi)。例如，本發(fā)明的EGF和肽載體包括具有與SEQ ID NO2或4或6具有至少70％的同一性(identity)并保留其活性的氨基酸序列的變異體。優(yōu)選地，所示氨基酸序列與SEQ ID NO2或者4或者6具有至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，至少95％甚至98％、99％的同一性。更優(yōu)選地，本發(fā)明EGF具有SEQ ID NO2的序列。同樣，優(yōu)選地，本發(fā)明肽載體序列具有SEQ ID NO4或6的序列。
在本發(fā)明融合蛋白中，肽載體序列優(yōu)選位于EGF的N-端，也可以位于EGF的C-端或蛋白分子的其它位置。肽載體序列優(yōu)選緊鄰EGF，也可以通過間隔氨基酸序列和EGF相連。在優(yōu)選的實施方案中，肽載體序列和EGF的前后順序和連接方式(直接相連或者通過間隔氨基酸序列相連)分別使得肽載體序列能夠有效地促進EGF穿越細胞膜。間隔氨基酸序列的選擇以不損壞或降低肽載體序列和EGF的功能為準，因此是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，間隔氨基酸序列通常用于將融合蛋白兩個成分分開，使它們在空間上不相互干擾。間隔氨基酸序列的長度可以是1-20個氨基酸或者更長，例如1-10個。
本發(fā)明的肽載體包括能夠引領(lǐng)其所承載的蛋白質(zhì)穿過漿膜的任何氨基酸序列，它可以天然的，也可以是人工合成的。
在一個實施方案中，肽載體序列選自果蠅的同源異型轉(zhuǎn)錄蛋白Antp、單純皰疹病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP22、人類I型免疫缺陷病毒的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(TAT)的PTD或者谷胱甘-S-轉(zhuǎn)移酶；優(yōu)選人類I型免疫缺陷病毒的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(TAT)及GST的PTD，特別地，具有SEQ ID NO4所示的序列。
在一個實施方案中，EGF是人EGF，例如重組人EGF。
本發(fā)明的融合蛋白還可以含有其它序列，例如間隔序列，有利于純化的附加序列，例如在N端或C端含有6個組氨酸的標(biāo)簽。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白具有SEQ ID NO8所示的序列。
在另一方面，本發(fā)明涉及核酸分子，其具有選自以下核苷酸序列的序列(1)編碼上述融合蛋白的核苷酸序列；(2)與(1)的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
本發(fā)明的核酸分子包含編碼肽載體和表皮生長因子的核苷酸序列。還可以包含編碼間隔序列、附加序列等氨基酸序列的核苷酸序列。
本發(fā)明編碼肽載體和表皮生長因子的核苷酸序列可以是任何能夠編碼具有活性的肽載體和表皮生長因子的核苷酸序列，包括天然序列和合成序列。包括等位基因變體和物種同系物，還包括突變體和變異體。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，可以對EGF和肽載體的編碼序列例如本文公開的序列進行適當(dāng)修飾，例如增加、替換、缺失一個或多個(如不超過60個，優(yōu)選不超過45個，更優(yōu)選不超過30個，10個，5個，4個、3個、2個、1個)核苷酸，而仍然保留其編碼能力。因此，本發(fā)明包括這些修飾的變異體在內(nèi)。例如，本發(fā)明的編碼序列包括具有與SEQ ID NO1或者3或者5有至少70％的同一性(identity)并編碼EGF或肽載體的核苷酸序列的變異體。優(yōu)選地，所示核苷酸序列與SEQ ID NO1或3或5具有至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，至少95％甚至98％、99％的同一性。在一個實施方案中，本發(fā)明的EGF編碼序列具有SEQ ID NO1的序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明的肽載體編碼序列具有SEQ ID NO3或5的序列。
優(yōu)選地，所述核酸分子包含根據(jù)宿主細胞偏愛的密碼子設(shè)計的編碼EGF的核苷酸序列或其互補序列。更優(yōu)選地，所述核酸分子包含根據(jù)原核生物例如大腸桿菌偏愛的密碼子設(shè)計的編碼EGF的核苷酸序列或其互補序列，或者根據(jù)植物例如番茄偏愛的密碼子設(shè)計的編碼EGF的核苷酸序列或其互補序列。
本發(fā)明的核酸分子可以是DNA或者RNA，例如合成DNA，包括DNA類似物。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明核酸分子選自具有SEQ ID NO7所示序列的編碼所述融合蛋白的核酸分子，在SEQ ID NO7中增加、替換、缺失一個或多個(如不超過60個，優(yōu)選不超過45個，更優(yōu)選不超過30個，10個，5個，4個、3個、2個、1個)核苷酸而仍然保留其編碼能力的核酸分子，與SEQ ID NO7有至少70％的同一性(identity)而仍然保留其編碼能力的變異體，和它們的互補序列。優(yōu)選地，所述核酸分子與SEQ ID NO1或3或5具有至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，至少95％甚至98％、99％的同一性。
在另一方面，本發(fā)明還涉及含有上述的核酸分子的載體。該載體可以是克隆載體，也可以是表達載體，或者穿梭載體。
優(yōu)選地，本發(fā)明的載體含有適于所述融合蛋白目的宿主細胞中表達的、與所述核酸分子可操作地連接的調(diào)控元件。
在另一方面，本發(fā)明還涉及含有上述載體的宿主細胞，例如真核宿主細胞如動物細胞(優(yōu)選哺乳動物例如人細胞)或者昆蟲細胞或者真菌細胞，或者原核宿主細胞如大腸桿菌細胞。本發(fā)明還涉及含有該細胞的生物體。
在另一方面，本發(fā)明還涉及組合物，其含有本發(fā)明的融合蛋白或者核酸分子或者載體或者其一個或多個的任何組合。任選地，所述組合物還含有賦形劑、稀釋劑、或者輔助物質(zhì)。優(yōu)選地，所述組合物是藥物組合物(用于預(yù)防或者治療EGF相關(guān)疾病)，保健品組合物，或者化妝品組合物。
在另一方面，本發(fā)明還涉及肽載體序列(優(yōu)選蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD))在制備本發(fā)明融合蛋白或者核酸分子中的用途。
在另一方面，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的融合蛋白或者核酸分子或者載體在制備藥物、保健品或者化妝品中的用途。
在另一方面，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的融合蛋白或者核酸分子或者載體在EGF的任何用途中的用途。本發(fā)明的融合蛋白或者核酸分子或者載體可以用來在EGF的任何用途中適當(dāng)?shù)靥娲鶨GF。
本發(fā)明還涉及核酸分子，其具有根據(jù)宿主細胞偏愛的密碼子設(shè)計的編碼EGF的核苷酸序列或其互補序列。在一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子具有根據(jù)植物例如番茄偏愛的密碼子設(shè)計的編碼EGF的核苷酸序列，或其互補序列，例如SEQ ID NO1所示的序列，或者根據(jù)原核生物例如大腸桿菌偏愛的密碼子設(shè)計的編碼EGF的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了核酸分子，其核苷酸序列與SEQ ID NO1或3或5或7具有至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，最優(yōu)選至少95％甚至98％、99％的同一性。優(yōu)選地，所述核酸分子具有SEQ IDNO1或3或5或7的序列。
本發(fā)明另一方面還提供了多肽，其氨基酸序列與SEQ ID NO2或者4或者6或者8具有至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，最優(yōu)選至少95％甚至98％、99％的同一性。優(yōu)選地，所述多肽具有SEQ ID NO2或者4或者6或者8的氨基酸序列。
附圖簡述

圖1表達載體pPTD-hEGF結(jié)構(gòu)示意圖。
T7PT7啟動子PTD蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域EGF表皮生長因子Term終止子圖2SDS-PAGE分析PTD-hEGF表達M為低分子量蛋白標(biāo)準，Control對照質(zhì)粒表達，PTD-hEGF重組質(zhì)粒融合表達。
圖3SDS-PAGE確定表達蛋白的存在形式M蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準，1菌體裂解液的上清液，2-5菌體裂解液的沉淀分別以2，4，6和8M尿素處理后上清，6裂解液沉淀的清洗液，7裂解液沉淀物。
圖4SDS-PAGE分析純化的PTD-hEGF融合蛋白M為蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準，1為以150mM咪唑洗脫液純化的融合蛋白。
圖5重組質(zhì)粒pGEX-hEGF的酶切鑒定MDNA分子質(zhì)量標(biāo)準；1.重組質(zhì)粒。
圖6SDS-PAGE分析GST融合蛋白的表達M蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(97.4，66，42，31，14.4)kD；1.pGEX-hEGF全菌裂解液；2.對照菌pGEX-4T-1全菌裂解液。
圖7表達產(chǎn)物的Western blot分析1.BL21/pGEX-4T-1裂解液；2.BL21/pGEX-hEGF裂解液上清；3.BL21/pGEX-hEGF裂解液沉淀。
圖8GST-hEGF表達形式的確定及在不同濃度尿素中的溶解度1.菌體裂解液沉淀；2.菌體裂解液上清液；3-6.菌體裂解液的沉淀分別以2，4，6和8M尿素處理后上清；M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(97.4，66，42，31，14.4)kD。
圖9SDS-PAGE分析純化的GST-hEGF融合蛋白M蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(97.4，66，42，31，14.4)kD；1.純化的GST-hEGF蛋白圖10MTS法測定標(biāo)準hEGF和重組PTD-hEGF的生物活性圖11MTS法測定標(biāo)準hEGF和重組GST-hEGF的生物活性具體實施方式
本發(fā)明在一個具體方面涉及一種依賴植物偏愛的密碼子設(shè)計的編碼人重組表皮生長因子(EGF)的核酸分子；該分子的核苷酸序列結(jié)構(gòu)與人EGF核苷酸的結(jié)構(gòu)不完全相同，但所編碼的蛋白質(zhì)序列卻是完全相同的。
本發(fā)明還涉及肽載體核苷酸序列的應(yīng)用。可將肽載體核苷酸序列置于人表皮生長因子核酸序列的5’端，構(gòu)成一融合表達的基因結(jié)構(gòu)序列。
本發(fā)明還涉及含有所述核酸分子的表達載體pPTD-hEGF和pGEX-hEGF；在大腸桿菌BL21中表達出了含有肽載體序列的人表皮生長因子，融合蛋白的表達不僅限于BL21，還應(yīng)擴展到一切有利于融合蛋白表達的其他一切生物反應(yīng)器，如原核的枯草桿菌、短肽桿菌以及其他的原核生物；真核生物如酵母菌(釀酒酵母、畢赤酵母及漢森酵母等)，動植物細胞等。
本發(fā)明還涉及重組人EGF融合蛋白的應(yīng)用。肽載體人EGF融合蛋白有廣泛的應(yīng)用，在疾病預(yù)防和治療方面用作藥物，如預(yù)防和治療口腔及消化道潰瘍、醫(yī)治皮膚物理性、化學(xué)性及炎性損傷、噴霧或吸入防治呼吸道損傷等；在保健方面可活化糖酵解作用以增加呼吸代謝，增強體力，提高免疫功能及抗衰老等；在化妝品應(yīng)用上可深入皮膚深層，改善皮膚細胞的營養(yǎng)，使衰老的皮膚及時脫落，祛除色斑，持久保持皮膚紅潤、光滑、細膩有彈性，同時能夠去除縐紋，達到護膚養(yǎng)顏的目的，并且可以增強皮膚抵御能力，防止外來刺激，修復(fù)受損皮膚，加速傷口愈合。
肽載體人EGF融合蛋白可以多種劑型進行應(yīng)用，如含片、貼片、噴劑、滴劑及液體注射劑等?？傊鲜鰟┬屯?，EGF融合蛋白還可以各種方便的其他制劑形式應(yīng)用于臨床、保健和化妝品行業(yè)。
本發(fā)明的融合蛋白可以以類似于EGF蛋白的劑量施用。由于本發(fā)明融合蛋白的生物活性高于EGF，因此，優(yōu)選地，本發(fā)明融合蛋白的施用劑量低于常規(guī)EGF的施用劑量。例如，本發(fā)明融合蛋白的施用劑量不超過常規(guī)EGF的施用劑量的80％，優(yōu)選不超過70％、60％、或50％，更優(yōu)選不超過常規(guī)EGF的施用劑量的40％、30％、20％、甚至10％。
本發(fā)明應(yīng)用的肽載體為人類免疫缺陷病毒編碼的反式激活蛋白TAT的PTD序列或GST序列。EGF的引導(dǎo)將不僅限于上述的PTD序列，還應(yīng)擴展到一切具備此功能的肽載體序列，其中包括人工合成的肽載體結(jié)構(gòu)。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明涉及一種依據(jù)植物偏愛的密碼子設(shè)計的編碼人表皮生長因子的核酸分子。發(fā)明人人工合成了該核酸的全部核苷酸序列，該序列與天然的人表皮生長因子核苷酸序列并不完全相同，但所編碼的蛋白質(zhì)序列卻完全相同。上述編碼人表皮生長因子的核酸的核苷酸序列和對應(yīng)的人表皮生長因子氨基酸序列如下atg aat agc gat tct gaa tgt cca ctt tcc cac gac gga tac tgcM N S D S E C P L S H D G Y Cttg cat gat ggt gtt tgc atg tac att gag gct ttg gac aag tatL H D G V C M Y I E A L D K Ygca tgc aac tgt gtt gtg ggt tac atc gga gag aga tgt caa tacA C N C V V G Y I G E R C Q Ycgt gac ctt aaa tgg tgg gaa ctt cgt taa tag (SEQ ID NO1)R D L K W W E L R * * (SEQID NO2)本發(fā)明的另一個方面涉及PTD的運用。優(yōu)先涉及HIV-ITAT蛋白PTD和GST。HIV-ITAT蛋白PTD的核心序列由11個氨基酸組成，其序列為YGRKKRRQRRR。我們利用大腸桿菌偏愛的密碼子設(shè)計出這一氨基酸序列的核苷酸序列并進行人工全合成。HIV-ITAT蛋白PTD的一個示例性編碼核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列如下5’tac ggc cgc aag aaa cgc cgc cag cgc cgc cgc3’(SEQ ID NO3)Y G R K K R R Q R R R (SEQ ID NO4)一個示例性的編碼GST的核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列如下1atg tcc cct ata cta ggt tat tgg aaa att aag ggc ctt gtg caa451Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln15
46 ccc act cga ctt ctt ttg gaa tat ctt gaa gaa aaa tat gaa gag 9016 Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu 3091 cat ttg tat gag cgc gat gaa ggt gat aaa tgg cga aac aaa aag 13531 His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys 45136 ttt gaa ttg ggt ttg gag ttt ccc aat ctt cct tat tat att gat 8046 Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp 60181 ggt gat gtt aaa tta aca cag tct atg gcc atc ata cgt tat ata 22561 Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile 75226 gct gac aag cac aac atg ttg ggt ggt tgt cca aaa gag cgt gca 27076 Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala 90271 gag att tea atg ctt gaa gga gcg gtt ttg gat att aga tac ggt 31591 Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly 105316 gtt tcg aga att gca tat agt aaa gac ttt gaa act ctc aaa gtt 360106 Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val 120361 gat ttt ctt agc aag cta cct gaa atg ctg aaa atg ttc gaa gat 405121 Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp 135406 cgt tta tgt cat aaa aca tat tta aat ggt gat cat gta acc cat 450136 Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His 150451 cct gac ttc atg ttg tat gac gct ctt gat gtt gtt tta tac atg 495151 Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met 165496 gac cca atg tgc ctg gat gcg ttc cca aaa tta gtt tgt ttt aaa 540166 Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys 180541 aaa cgt att gaa gct atc cca caa att gat aag tac ttg aaa tcc 585181 Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser 195586 agc aag tat ata gca tgg cct ttg cag ggc tgg caa gcc acg ttt 630196 Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe 210
將PTD的核苷酸序列置于人EGF基因的5’端，構(gòu)建了能在大腸桿菌BL21中高效表達的表達載體pPTD-hEGF和pGEX-hEGF。pPTD-hEGF載體是由pET系列構(gòu)建而來，含有T7啟動子啟動融合基因的表達，在融合蛋白的5’端含有6個組氨酸標(biāo)簽，以及有利于親和層析純化的一些附加結(jié)構(gòu)。
一個示例性融合蛋白的全長氨基酸和核苷酸序列如下CAT CAT CAT CAT CAT CATGGT ATG GCT AGC ATG ACT GGT GGA CAGHis His His His His HisGly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly GlnCAA ATG GGT CGG GAT CTG TAC GAC GAT GAC GAT AAG GAT CGA TGGGln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Arg TrpGGA TCC AAG CTT GGC TAC GGC CGC AAG AAA CGC CGC CAG CGC CGCGly Ser Lys Leu Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg ArgCGC GGT GGA TCC ACC ATG TCC GGC TAT CCA TAT GAC GTC CCA GACArg Gly Gly Ser Thr Met Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro AspTAT GCT GGC TCC ATG GCC GGT ACC ATG AAT AGC GAT TCT GAA TGTTyr Ala Gly Ser Met Ala Gly Thr Met Asn Ser Asp Ser Glu CysCCA CTT TCC CAC GAC GGA TAC TGC TTG CAT GAT GGT GTT TGC ATGPro Leu Ser His Asp Gly Tyr Gys Leu His Asp Gly Val Cys MetTAC ATT GAG GCT TTG GAC AAG TAT GCA TGC AAC TGT GTT GTG GGTTyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val GlyTAC ATC GGA GAG AGA TGT CAA TAC CGT GAC CTT AAA TGG TGG GAATyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp GluCTT CGT TAA TGA (SEQ ID NO7)Leu Arg End End (SEQ ID NO8)劃線處為6個His序列，黑體為PTD序列，斜體為依據(jù)番茄偏好的密碼子設(shè)計的EGF編碼序列和所表達的氨基酸序列。其余部分為間隔序列或修飾序列。
pGEX-hEGF來源于pGEX-4T-1載體(購自北京天為時代公司)，在融合蛋白的5’端含有GST蛋白序列。
該載體通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到大腸桿菌BL21中，于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至一定濃度，加入IPTG誘導(dǎo)可得到高表達量的融合蛋白PTD-hEGF和GST-hEGF。
利用本發(fā)明的重組菌株BL21/pPTD-hEGF和BL21/pGEX-hEGF生產(chǎn)重組人表皮生長因子的方法具體如下1.種子液制備將10ul菌種接種于盛有3ml LB培養(yǎng)液的試管中，37℃培養(yǎng)過夜(一般為16小時左右)，當(dāng)OD600達到0.6左右時即可進行發(fā)酵，上述所用種子液培養(yǎng)基加入100mg/L氨芐青霉素。
2.發(fā)酵在無菌條件下將上述培養(yǎng)好的種子液按30ml/L的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上；發(fā)酵培養(yǎng)基的成分組成為(g/L)Trypt one(蛋白胨)10g，Yeast extract(酵母提取物)5g，NaCl 5g，氨芐青霉素0.1g；用去離子水溶解定容，高壓滅菌。發(fā)酵條件為溫度28-37℃，pH7.0，發(fā)酵至OD600達到1.0左右時加入IPTG(異丙硫代-β-D-半乳糖苷)100mM進行誘導(dǎo)，3-4個小時后離心收集菌體，收取的菌體可放于-20℃冰箱中，待分離純化。
3.重組人表皮生長因子的分離純化(1)PTD-hEGF的純化將上述收集的菌體細胞用磷酸緩沖液PBS(pH7.6)洗滌1-2次；每100ml細菌培養(yǎng)液用50ul細菌裂解液(pH7.6)懸浮，加入溶菌酶1mg/ml，RNase 20ug/ml，超聲破碎，10000rpm離心10分鐘，棄上清液，用8M的尿素溶解沉淀得粗提液；經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測表明，用本法得到的融合蛋白絕大部分為包函體，可得到表達量達40％以上的融合蛋白。大部分溶解于8M的尿素中。本法粗提rhEGF簡單易行，規(guī)?？呻S意擴大，可變因素少，重復(fù)性很好。
表達的融合蛋白可通過Ni2+柱一步純化，最后用含有150mM的咪唑洗脫液洗脫。
(2)GST-hEGF的純化每mL細菌裂解上清加100μl Glutathione Sepharose 4B，室溫30min，500g離心5min，棄上清，用PBS洗3次，沉淀中加入1倍體積的谷胱甘肽緩沖液，室溫輕輕攪動10min，離心后收集上清。Lowrry法測定收集液中蛋白的含量。
4.促細胞生長活性鑒定在96孔板培養(yǎng)的人胚腎HEK-293細胞中加入純化的PTD-hEGF和GST-hEGF，分為0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2ng/ml不同的濃度，48小時后加入MTS繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時，于酶聯(lián)儀上492nm處測定光密度值。與標(biāo)準EGF相比有很好的生物活性。
5.應(yīng)用可作為化妝品的原料添加到普通化妝品中；防治口腔及消化道潰瘍；促進各種皮膚創(chuàng)傷的愈合；防治呼吸道損傷等多種用途。
實施例實施例1表達載體pPTD-hEGF的構(gòu)建與鑒定將合成的EGF基因(SEQ ID NO1)連接于pBS-T載體(購于北京天為時代公司)上，用Kpn I+EcoR I從T載體上切下目的基因，回收純化；同時用Kpn I+EcoR I雙酶切表達載體pPTD(將合成的PTD的核苷酸序列(SEQ ID NO3)連接到載體pRSET(購于Invitrogen，San Diego，CA)上構(gòu)建成的)，回收純化載體片段；將回收的目的基因片段與目的載體片段取適當(dāng)比例，在T4DNA連接酶的作用下，16℃連接過夜，取適當(dāng)連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞TOP10(購于北京天為時代公司)，從篩選培養(yǎng)基上長出的克隆菌斑中挑選幾個進行培養(yǎng)鑒定。
提取重組菌落的質(zhì)粒，在Kpn I+EcoR I雙酶切作用下，電泳圖譜中出現(xiàn)了預(yù)期的目的片段，即目的基因片段和載體片段，將這些重組質(zhì)粒測序證明構(gòu)建的表達載體是正確的。表達載體pPTD-hEGF結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。
實施例2PTD-hEGF融合蛋白的表達提取上述構(gòu)建正確的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取多個克隆進行誘導(dǎo)表達，圖2是其中一個典型克隆的表達情況，從圖中可以看出，該質(zhì)粒進行了有效的表達。經(jīng)生物軟件分析，表達量占細菌總蛋白的40％。
實施例3重組蛋白表達形式的確定經(jīng)誘導(dǎo)表達的菌體離心收集后，用PBS緩沖液清洗，再將清洗后的菌體溶解于適當(dāng)?shù)牧呀庖褐?，超聲波破碎菌體，離心分離上清液與沉淀，SDS-PAGE分析結(jié)果表明，上清液中目標(biāo)蛋白含量很少，大部分都以不溶形式的包涵體存在。分別取等量的裂解物沉淀溶于2，4，6，8M尿素中，電泳分析可知，該包涵體在8M尿素中溶解度最大(圖3)。
實施例4PTD-hEGF融合蛋白的純化以PTD-hEGF融合基因進行的表達，可溶性的蛋白很少，絕大多數(shù)是以不溶性的包函體形式存在，因此我們將表達產(chǎn)物溶解在8M的尿素中，然后進行Ni2+-NTA親和層析。分別以10-150mM的咪唑洗脫液洗脫，在較低濃度的咪唑洗脫液中雜質(zhì)較多，目的蛋白的含量很少，濃度升高到150mM時出現(xiàn)了較明顯的目的蛋白條帶。用含咪唑150mM的洗脫液洗脫結(jié)合了融合蛋白的介質(zhì)，回收洗脫液(圖4)。Ni2+-NTA親和層析純化得到的融合蛋白純度達99.5％以上實施例5pGEX-hEGF表達載體的構(gòu)建和鑒定合成hEGF基因(SEQ NO1)，在其5’端添加了限制性內(nèi)切酶BamH I酶切位點和ATG啟始密碼子；在其3’端添加了終止密碼子TAA和TGA，緊接著與NOS終止子序列和EcoR I酶切位點相連。BamH I和EcoR I雙酶切hEGF和pGEX-4T-1(購自天為時代公司，該載體在多克隆位點上游包含GST編碼區(qū)，用于表達N端融合了GST的融合蛋白)，回收目的基因片段和載體片段，取適當(dāng)比例混合，在T4DNA連接酶的作用下16℃連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞TOP10，提取陽性克隆質(zhì)粒后以BamH I和EcoR I雙酶切鑒定，結(jié)果切出了500bp的目的基因片段和4900bp的載體片段(圖5)。將重組載體送交博亞生物公司測序，結(jié)果證明所構(gòu)建的表達載體基因的核苷酸序列完全正確。
實施例6pGEX-hEGF表達載體在大腸桿菌BL21中的表達重組質(zhì)粒pGEX-hEGF轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，在Ampr瓊脂平板上挑選單菌落接種于3ml LB/amp培養(yǎng)液中，33℃培養(yǎng)到OD600＝0.5左右時，加入IPTG至終濃度0.5mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)2h，收集菌體，PBS洗滌2次，按每mL細菌培養(yǎng)液加50μl細胞裂解液重懸菌體，超聲裂解，離心后收集上清和菌體碎片。SDS-PAGE檢測，于33kD處出現(xiàn)了一條明顯的蛋白條帶，而對照菌(含空質(zhì)粒pEGX-4T-1)在27kD處出現(xiàn)了一條蛋白條帶。合成的人表皮生長因子含有54個氨基酸，分子量大小為6kD，GST大小為27kD，因此33kD處的蛋白應(yīng)是GST-hEGF的融合蛋白。證明GST-hEGF融合蛋白在大腸桿菌中得到了表達，經(jīng)生物軟件分析表達量占總蛋白含量的34％。SDS-PAGE分析融合蛋白的表達情況見圖6。
菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，分別對其裂解液的上清和沉淀進行SDS-PAGE分析，然后轉(zhuǎn)至尼龍膜上，以兔抗hEGF為一抗，羊抗兔抗體為二抗進行Western印跡檢測，結(jié)果見圖7所示。該菌的裂解液上清和沉淀泳道都顯示出了特異的條帶，其位置與考馬斯亮藍染色的蛋白表達條帶位置一致，而對照菌的泳道卻未顯示任何條帶，說明表達產(chǎn)物為GST-hEGF的融合蛋白。
實施例7GST-hEGF表達形式的確定為確定hEGF在E.coli中的表達形式，將離心收集的菌體用PBS充分洗滌后，超聲波破碎(或液氮冷凍破碎)離心分離上清與沉淀。沉淀分別用含有2M，4M，6M，8M尿素的PBS緩沖液溶解，離心后取10μl與等體積的上樣緩沖液混勻，95℃變性5min，SDS-PAGE電泳可以看出，沉淀和上清液中均含有融合蛋白，說明表達的蛋白既有可溶性的形式，也有不溶性的包涵體，包涵體中含有的量更多一些。尿素溶解證明在8M的尿素中GST-hEGF溶解度最大(圖8)。
實施例8GST-hEGF融合蛋白的純化每mL細菌裂解上清加100μl Glutathione Sepharose 4B，室溫30min，500g離心5min，棄上清，用PBS洗3次，沉淀中加入1倍體積的谷胱甘肽緩沖液，室溫輕輕攪動10min，離心后收集上清。對純化后的蛋白上清經(jīng)Lowry法測蛋白濃度。每100ml菌液最終可獲得6.3mg的GST-hEGF融合蛋白。SDS-PAGE電泳觀察僅留下大小為33kD的一條帶(圖9)。
實施例9促細胞增殖活性分析將標(biāo)準rhEGF和純化后的融合蛋白(根據(jù)hEGF在融合蛋白中所占的比例換算成hEGF的實際含量)，經(jīng)過濾除菌，用含0.5％FBS的RPMI 1640稀釋至0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4ng/ml。取無菌96孔板一塊，以1號孔為空白，2號孔為對照，加入含0.5％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基50ul。從3號開始向右依次加入上述對半稀釋的培養(yǎng)液各50ul，每一樣品設(shè)3個平行組。選對數(shù)生長期細胞一瓶，胰酶消化，細胞收集后用含0.5％FBS的培養(yǎng)基調(diào)整細胞數(shù)到所需濃度(每孔加5000個左右細胞)，每孔加入細胞懸液50ul。37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時。每空加入20ul MTS溶液，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時，用酶聯(lián)免疫檢測儀測OD值，λ＝492nm。
(1)重組PTD-hEGF融合蛋白的促細胞增殖活性以人胚腎293細胞做實驗，標(biāo)準品rhEGF和PTD-hEGF都顯示了對培養(yǎng)細胞有明顯的生物活性，在0.1-0.4ng/ml范圍內(nèi)隨濃度的升高而增強，但PTD-hEGF又表現(xiàn)出與標(biāo)準不同的性質(zhì)，達到最大活性值用量更小(圖10)。
原核表達的融合蛋白PTD-hEGF主要形成了包涵體，包涵體是變性蛋白質(zhì)的聚集體，沒有生物活性，而培養(yǎng)細胞中添加后表現(xiàn)出了明顯的促細胞生長活性，這一現(xiàn)象說明包涵體進行了活性恢復(fù)。雖然本發(fā)明不限于具體的理論，但是，其機制應(yīng)該是PTD-hEGF進入了細胞內(nèi)部，在細胞內(nèi)發(fā)生了重新折疊，由無活性的形式變?yōu)橛猩砘钚缘男问健Ｔ诩毎囵B(yǎng)中hEGF的濃度在0.1-0.4ng/ml時，其促細胞生長作用有明顯的量效關(guān)系，但PTD-hEGF的促細胞生長活性又明顯比標(biāo)準hEGF的活性高，其原因可能是hEGF在PTD的牽引下進入了細胞核內(nèi)，由于PTD序列中帶有核定位信號肽(GRKKR)，其跨膜轉(zhuǎn)運后主要積聚于細胞，尤其是胞核內(nèi)，Schwarze等(Schwarze SR，Ho A.Vocero-AkbamA，Dowdy SF.Science，1999；285(5433)1569-1572)證明PTD轉(zhuǎn)導(dǎo)的外源性蛋白質(zhì)具有細胞核聚集的特點。hEGF在核內(nèi)聚集，直接調(diào)控了DNA，RNA和蛋白質(zhì)的合成。
(2)重組GST-hEGF融合蛋白的促細胞增殖活性用MTS法對GST-hEGF融合蛋白的生物活性進行了檢測。表明GST-hEGF樣品與標(biāo)準品rhEGF具有相似ED50(Effective dose 50使細胞生長量達到最大植一半時EGF的濃度)值。且重組GST-hEGF樣品比標(biāo)準品hEGF具有更高的生物活性(圖11)。
GST-hEGF融合蛋白能明顯促進HEK-293細胞的分裂和生長。在0.1-0.8ng/mL濃度范圍內(nèi)融合蛋白的活性高于標(biāo)準rhEGF，這一奇特現(xiàn)象提示hEGF的作用機理除和其細胞膜上的受體結(jié)合引起一系列反應(yīng)外，還可能被GST帶入細胞內(nèi)部起作用(Namiki S，Tomida T，Tanabe M，IinoM，Hirose K.Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，305592 597.)，或者到達細胞核內(nèi)與染色體相連，直接促使DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成。
GST-hEGF融合蛋白所顯示的生物活性提示hEGF的利用可以不需要去除融合蛋白的GST部分，這樣給表達和純化帶來了極大的方便，可降低生產(chǎn)成本，使hEGF得到更加廣泛的利用。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所<120>含有肽載體和表皮生長因子的融合蛋白和核酸及其用途<130>IDC040097<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>168<212>DNA<213>人工<220>
<223>依據(jù)植物偏愛的密碼子設(shè)計的編碼人表皮生長因子的核酸分子<220>
<221>CDS<222>(1)..(168)<400>1atg aat agc gat tct gaa tgt cca ctt tcc cac gac gga tac tgc ttg48Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu1 5 10 15cat gat ggt gtt tgc atg tac att gag gct ttg gac aag tat gca tgc96His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys20 25 30aac tgt gtt gtg ggt tac atc gga gag aga tgt caa tac cgt gac ctt144Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu35 40 45aaa tgg tgg gaa ctt cgt taa tag168Lys Trp Trp Glu Leu Arg50<210>2<211>54
<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成結(jié)構(gòu)<400>2Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu1 5 10 15His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys20 25 30Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu35 40 45Lys Trp Trp Glu Leu Arg50<210>3<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>人工合成的HIV-I TAT蛋白PTD編碼核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(33)<400>3tac ggc cgc aag aaa cgc cgc cag cgc cgc cgc 33Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1 5 10<210>4<211>11<212>PRT
<213>人工<220>
<223>合成結(jié)構(gòu)<400>4Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1 5 10<210>5<211>678<212>DNA<213>人工<220>
<223>編碼GST的核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(678)<400>5atg tcc cct ata cta ggt tat tgg aaa att aag ggc ctt gtg caa ccc48Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1 5 10 15act cga ctt ctt ttg gaa tat ctt gaa gaa aaa tat gaa gag cat ttg96Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30tat gag cgc gat gaa ggt gat aaa tgg cga aac aaa aag ttt gaa ttg144Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45ggt ttg gag ttt ccc aat ctt cct tat tat att gat ggt gat gtt aaa192Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys50 55 60tta aca cag tct atg gcc atc ata cgt tat ata gct gac aag cac aac240Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65 70 75 80atg ttg ggt ggt tgt cca aaa gag cgt gca gag att tca atg ctt gaa288
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu85 90 95gga gcg gtt ttg gat att aga tac ggt gtt tcg aga att gca tat agt336Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser100 105 110aaa gac ttt gaa act ctc aaa gtt gat ttt ctt agc aag cta cct gaa384Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125atg ctg aaa atg ttc gaa gat cgt tta tgt cat aaa aca tat tta aat432Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140ggt gat cat gta acc cat cct gac ttc atg ttg tat gac gct ctt gat480Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145 150 155 160gtt gtt tta tac atg gac cca atg tgc ctg gat gcg ttc cca aaa tta528Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175gtt tgt ttt aaa aaa cgt att gaa gct atc cca caa att gat aag tac576Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr180 185 190ttg aaa tcc agc aag tat ata gca tgg cct ttg cag ggc tgg caa gcc624Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala195 200 205acg ttt ggt ggt ggc gac cat cct cca aaa tcg gat ctg gtt ccg cgt672Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg210 215 220gga tcc678Gly Ser225<210>6<211>226<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成結(jié)構(gòu)<400>6Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1 5 10 15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys50 55 60Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65 70 75 80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu85 90 95Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser100 105 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg210 215 220Gly Ser225<210>7<211>372<212>DNA<213>人工<220>
<223>一個示例性融合蛋白的核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(372)<400>7cat cat cat cat cat cat ggt atg gct agc atg act ggt gga cag caa48His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln1 5 10 15atg ggt cgg gat ctg tac gac gat gac gat aag gat cga tgg gga tcc96Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Arg Trp Gly Ser20 25 30aag ctt ggc tac ggc cgc aag aaa cgc cgc cag cgc cgc cgc ggt gga144Lys Leu Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly35 40 45tcc acc atg tcc ggc tat cca tat gac gtc cca gac tat gct ggc tcc192Ser Thr Met Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser
50 55 60atg gcc ggt acc atg aat agc gat tct gaa tgt cca ctt tcc cac gac240Met Ala Gly Thr Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp65 70 75 80gga tac tgc ttg cat gat ggt gtt tgc atg tac att gag gct ttg gac288Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp85 90 95aag tat gca tgc aac tgt gtt gtg ggt tac atc gga gag aga tgt caa336Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln100 105 110tac cgt gac ctt aaa tgg tgg gaa ctt cgt taa tga372Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg115 120<210>8<211>122<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成結(jié)構(gòu)<400>8His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln1 5 10 15Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Arg Trp Gly Ser20 25 30Lys Leu Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly35 40 45Ser Thr Met Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser50 55 60Met Ala Gly Thr Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp
65 70 75 80Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp85 90 95Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln100 105 110Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg115 120
權(quán)利要求
1.包含肽載體序列(優(yōu)選蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST))和表皮生長因子(EGF)的融合蛋白；優(yōu)選地，其中肽載體序列位于EGF的N-端，優(yōu)選緊鄰EGF，也可以通過間隔序列和EGF相連；優(yōu)選地，其中肽載體序列選自果蠅的同源異型轉(zhuǎn)錄蛋白Antp、單純皰疹病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP22或者人類I型免疫缺陷病毒的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(TAT)的PTD或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)；優(yōu)選人類I型免疫缺陷病毒的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(TAT)的PTD，特別地，具有SEQ ID NO4所示的序列、優(yōu)選地，其中EGF是人EGF，優(yōu)選重組人EGF；優(yōu)選地，其中所述融合蛋白還含有有利于純化的附加序列，例如在N端或C端含有6個組氨酸的標(biāo)簽；優(yōu)選地，所述融合蛋白具有SEQ ID NO8所示的序列。
2.核酸分子，其具有選自以下核苷酸序列的序列(1)編碼權(quán)利要求1-6任一項的融合蛋白的核苷酸序列；(2)與(1)的核苷酸序列互補的核苷酸序列；優(yōu)選地，所述核酸分子包含根據(jù)植物例如番茄偏愛的密碼子設(shè)計的編碼EGF的核苷酸序列或其互補序列(如SEQ ID NO1所示序列)，或者根據(jù)原核生物例如大腸桿菌偏愛的密碼子設(shè)計的編碼EGF的核苷酸序列或其互補序列。特別地，所述核酸分子是DNA，例如具有SEQ ID NO7所示的序列。
3.含有權(quán)利要求2的核酸分子的載體；優(yōu)選地，其含有適于所述融合蛋白在目的宿主細胞中表達的、與所述核酸分子可操作地連接的調(diào)控元件。
4.含有權(quán)利要求9或者10的載體的宿主細胞，例如真核宿主細胞如動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞或者真菌細胞，或者原核宿主細胞如大腸桿菌細胞。
5.組合物，其含有權(quán)利要求1-6任一項的融合蛋白或者權(quán)利要求7或8的核酸分子或者權(quán)利要求9或10的載體或者其一個或多個的任何組合；任選地，所述組合物還含有賦形劑、稀釋劑、或者輔助物質(zhì)；優(yōu)選地，所述組合物是藥物組合物(用于預(yù)防或者治療EGF相關(guān)疾病)，保健品組合物，或者化妝品組合物。
6.肽載體序列(優(yōu)選蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD))在制備權(quán)利要求1-6任一項的融合蛋白或者權(quán)利要求7或8的核酸分子中的用途。
7.權(quán)利要求1-6任一項的融合蛋白或者權(quán)利要求7或8的核酸分子或者權(quán)利要求9或10的載體在制備藥物、保健品或者化妝品中的用途。
8.核酸分子，其具有根據(jù)植物例如番茄偏愛的密碼子設(shè)計的編碼EGF的核苷酸序列，或其互補序列，例如SEQ ID NO1所示的序列，或者根據(jù)原核生物例如大腸桿菌偏愛的密碼子設(shè)計的編碼EGF的核苷酸序列。
9.核酸分子，其具有如下核苷酸序列所述核苷酸序列與SEQ IDNO1或3或5或7具有至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，最優(yōu)選至少95％甚至98％、99％的同一性；優(yōu)選地，所述核酸分子具有SEQ ID NOI或3或5或7的序列。
10.多肽，其具有如下氨基酸序列所述氨基酸序列與SEQ IDNO2或者4或者6或者8具有至少80％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，最優(yōu)選至少95％甚至98％、99％的同一性；優(yōu)選地，所述多肽具有SEQ ID NO2或者4或者6或者8的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及人表皮生長因子的修飾。本發(fā)明公開了包含肽載體序列(優(yōu)選蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD))和表皮生長因子(EGF)的融合蛋白、其編碼核酸、含有它們的組合物和它們的用途。本發(fā)明的化合物和組合物可以用作藥物、保健品和化妝品的活性成分或添加劑。
文檔編號C12N15/63GK1765929SQ200410090159
公開日2006年5月3日 申請日期2004年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月29日
發(fā)明者智慶文, 李前, 王玉霞, 李仕貴, 孫曼霽 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所