專利名稱：海島棉花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及一種海島棉品質(zhì)改良技術(shù)，屬于植物基因工程和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本申請涉及海島棉花粉管通道轉(zhuǎn)基因方法，及用此方法得到的轉(zhuǎn)移外源目的基因的海島棉。
背景技術(shù)：
棉花在分類上屬于雙子葉植物綱，錦葵科，棉屬(Gossypium L.)，是世界上最重要的栽培農(nóng)作物之一。原產(chǎn)于高溫、干旱、短日照的熱帶和亞熱帶的荒漠草原，多年生。經(jīng)過人類長期栽培馴化，才逐步成為一年生的栽培作物。棉花是唯一由種子生產(chǎn)纖維的農(nóng)作物。棉纖維是紡織工業(yè)的主要原料；棉子含油分、蛋白質(zhì)，是食品工業(yè)的原料；棉短絨也是化學(xué)工業(yè)和國防工業(yè)的重要物資。
棉屬中包括許多棉種，其中有4個栽培種草棉、亞洲棉、陸地棉和海島棉。栽培最廣泛的是陸地棉，其產(chǎn)量約占世界棉花總產(chǎn)量的90％；海島棉約占5～8％；亞洲棉約占2～5％；草棉已很少栽培。
海島棉(G.barbadens L)起源于南美洲西北部秘魯?shù)鹊貐^(qū)。18世紀(jì)中葉引進(jìn)西印度群島種植，稱海島棉。經(jīng)過栽培馴化，出現(xiàn)一年生類型。海島棉因其優(yōu)異的纖維品質(zhì)，使其經(jīng)濟(jì)價值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它栽培種，是特紡工業(yè)和高檔織物不可缺少的原料。海島棉在全世界僅有埃及、美國、中國、中亞地區(qū)、秘魯?shù)壬贁?shù)國家可以種植。在中國，也僅有新疆有較大面積栽培。海島棉是常異花授粉作物，長期的人工馴化和雜交，使其遺傳背景越來越狹窄，已很難找到抗逆基因和品質(zhì)改良基因。近緣野生種雖具有一些抗逆基因和品質(zhì)改良基因，但栽培價值低，并且通過人工雜交實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，使雙親的遺傳組成在染色體水平上進(jìn)行交換和重組，效率低，育種周期長，因此傳統(tǒng)的棉花育種面臨著種質(zhì)資源匱乏，遠(yuǎn)緣雜交困難等難以克服的問題。而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將目的基因轉(zhuǎn)入海島棉，是在DNA分子水平上進(jìn)行重組和交換，可提高效率，縮短育種周期，無疑將在發(fā)展海島棉生產(chǎn)上和對海島棉品種進(jìn)行遺傳改良具有重要意義。
通過植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，將目的基因?qū)朊藁ㄊ敲藁ɑ蚬こ萄芯康幕经h(huán)節(jié)，在棉花基因轉(zhuǎn)移研究實(shí)踐中應(yīng)用較廣的方法是花粉管通道法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍轟擊法。后兩種方法的主要不足是必須建立一個良好的體細(xì)胞再生體系，但棉花是相對難以進(jìn)行植物體細(xì)胞組織培養(yǎng)的作物，胚胎發(fā)生具有明顯的基因型限制，體細(xì)胞再生系統(tǒng)在一般品種中難以建立；并且體細(xì)胞組織培養(yǎng)過程中容易發(fā)生基因型變異；轉(zhuǎn)化成本相對較高。花粉管通道法是一種借助于植物自身的種質(zhì)細(xì)胞卵細(xì)胞或受精卵為轉(zhuǎn)化對象的直接轉(zhuǎn)化技術(shù)，通過花粉管通道將外源總體DNA或外源基因在自花授粉前后的適當(dāng)時期導(dǎo)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞。此技術(shù)最早由我國學(xué)者周光宇提出(周光宇，龔蓁蓁，王自芬，遠(yuǎn)源雜交的分子基礎(chǔ)——DNA片段雜交假設(shè)的一個論證。遺傳學(xué)報，1979，6(4)405-412)，并在長期科學(xué)研究中不斷發(fā)展。周光宇等在充分調(diào)查國內(nèi)外植物遠(yuǎn)緣雜交的變異后，針對那些遠(yuǎn)緣雜交所產(chǎn)生的、而在染色體水平上觀察不到的表型變異，認(rèn)為這些表型變異是染色體水平以下的DNA片段雜交產(chǎn)生的結(jié)果，即DNA片段雜交假說。該假說認(rèn)為，盡管遠(yuǎn)源雜交親本間的染色體結(jié)構(gòu)從整體上來看是不能親和的，但從進(jìn)化的角度來分析，其部分基因間的結(jié)構(gòu)有可能保持一定的親和性。并結(jié)合植物開花受精過程的解剖學(xué)特征，認(rèn)為外源基因或DNA可以通過花粉管通道進(jìn)入受精胚囊，稱為″花粉管通道法(途徑)″(pollen-tube pathway)。已有的實(shí)驗(yàn)證明，遠(yuǎn)緣雜交后代基因組中確有DNA片段雜交現(xiàn)象存在，該技術(shù)的建立為花粉管導(dǎo)入外源基因的整合奠定了基礎(chǔ)，開創(chuàng)了整株植物活體基因轉(zhuǎn)化的新途徑。其優(yōu)點(diǎn)是不受基因型限制、易操作且成本較低?，F(xiàn)今利用此方法，已將外源基因?qū)胧荏w植物，經(jīng)Southern等分子檢測獲得了外源基因穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物，陸地棉是此技術(shù)首先成功的受體植物(Zhou G.Y.，Wengj.，Zheng Y.，et al，Introduction of exogenous DNAinto cotton embryos.Methods in Enzymolofy，1983，101433-448.)。我國于1993年開始，已成功地將主要作用于鱗翅目類害蟲的Bt基因、Bt+CPT1(豇豆胰蛋白酶抑制劑基因)雙價基因、對蚜蟲有控制作用的雪花蓮凝集素基因(sGNA)、抗真菌病害的幾丁質(zhì)酶基因、葡聚糖酶基因、葡萄氧化酶基因等數(shù)種功能基因，及其各種基因的組合，陸續(xù)導(dǎo)入我國棉花主栽陸地棉品種之中，如泗棉3號、中棉所12號、中棉所19號、中植372、蘇棉8號、蘇棉12號、泗棉167、泗陽168、石遠(yuǎn)321、新陸早4號、新陸早7號、新陸早8號、遼棉15和3517、541、916、C6524、Q0101、蘇引A等多個優(yōu)良品種(系)，獲得了目標(biāo)性狀穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，通過選育形成了不同類型的轉(zhuǎn)基因抗蟲、抗病陸地棉品系和品種。參見下表1。
表1.花粉管通道途徑轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因陸地棉



花粉管通道法在陸地棉上一般的操作方法為首先選擇次日將開放的花蕾進(jìn)行自交，在開花后12-24小時左右即開花次日，選擇果枝和花位較好的幼子房作為轉(zhuǎn)化對象。用50μl微量進(jìn)樣器作為注射的工具，注射時摘除或剝?nèi)セò辏ㄆ交ㄖ?，右手持微量進(jìn)樣器，左手輕扶摘除花瓣后的幼子房，從抹平花柱處沿子房的縱軸方向進(jìn)針至子房長度的約2/3處，并后退至1/3處，輕緩操作注射器，將DNA溶液推入受精子房中。若將這種操作應(yīng)用在生理特性更加敏感的海島棉上，會對幼嫩子房造成極大傷害，導(dǎo)致座鈴率幾乎為零。
由于海島棉與陸地棉相比，其生理特性更加敏感，自然落鈴率較高，并且子房較小(海島棉子房直徑為1-2cm，陸地棉子房直徑為2-3cm)，若受到外力作用，則更易脫落。再則一般陸地棉花粉管在授粉后16小時左右到達(dá)胚囊，而海島棉在授粉后12小時左右已伸入胚珠。因此，利用現(xiàn)有的花粉管通道轉(zhuǎn)基因技術(shù)，如文獻(xiàn)CN1229141A及CN1251862A所述，其轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陸地棉，幾乎為零。因此，此技術(shù)需針對不同的作物采用不同方法細(xì)則操作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種海島棉花粉管通道轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于包含以下步驟1)去除變成紫紅色的花冠，2)用微量注射器從斷面沿花柱中軸插入子房長度的約1/4處，再退回2毫米左右，3)注入含外源目的基因的緩沖液，4)進(jìn)行培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明提供的方法，其特征在于，另外包含在去除變成紫紅色的花冠后，剪去2/3柱頭的步驟。
本發(fā)明提供的方法，其特征在于，另外包含在注入含外源基因的緩沖液后，去處未處理的花的步驟。
本發(fā)明提供的方法，其中所述花冠位于海島棉中上部果枝第一或第二個果節(jié)位的花上。
本發(fā)明所提供的方法中，其中所述含外源基因的緩沖液在注入前于-20℃-0℃預(yù)冷卻，和所述注入是在開花授粉后8-16小時內(nèi)，于15-30℃的溫度下進(jìn)行。
本發(fā)明所提供的方法中，其中所述含外源基因的緩沖液中含有10PPM赤霉素。
本發(fā)明的目的在于提供一種用上述方法獲得的轉(zhuǎn)化了外源目的基因的海島棉。
用于本發(fā)明方法的外源基因可以為棉花或非棉花基因，來源可為種間，屬間，科間以至微生物。外源基因可以為各種品質(zhì)、抗性及其它有益性狀基因。例如蜘蛛絲基因，運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因，伸展蛋白基因等。
用于轉(zhuǎn)基因的受體為海島棉品種、品系或者中間材料。如海島棉品種新海5號，新海14號，新海15號，新海16號，新海17號，新海18號，新海19號，新海20號和新海21號等。
由于海島棉下部果枝的自然脫落率較高，故在進(jìn)行海島棉花粉管通道轉(zhuǎn)化時，選擇海島棉中上部果枝第一或第二個果節(jié)位的花，在開花授粉后8-16小時內(nèi)，天氣晴朗且氣溫在15-30℃時導(dǎo)入外源目的基因，以避開不利生理?xiàng)l件和環(huán)境條件的影響。
對受體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的生理時間為其自花授粉后8-16小時。
抗性檢測的選擇劑根據(jù)載體上所具有的標(biāo)記基因而定。如對于Npt II基因選用卡那霉素，對于Bar基因選用Basta除草劑，濃度為50-1000PPM，處理時間為3-5天。將經(jīng)選擇劑選擇后的抗選擇劑單株在幼苗期取葉片提取DNA做PCR等分子標(biāo)記檢測分析。對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行農(nóng)藝性狀鑒定篩選，株系、品系培育，獲得含目標(biāo)性狀的優(yōu)良種質(zhì)、品系或品種，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新和改良。
由于海島棉生理特性更加敏感，用于陸地棉的花粉管通道法會對幼嫩子房造成極大傷害，導(dǎo)致座鈴率幾乎為零。而本發(fā)明的方法涉及去除變成紫紅色的花冠，注意不損傷幼嫩子房的表皮層，露出柱頭，用小剪剪去2/3柱頭，用微量注射器(10或50μl)從斷面沿花柱中軸輕柔插入子房長度的約1/4處，再退回2毫米左右，小心注入在-20℃--0℃下預(yù)冷的10微升含外源目的基因的緩沖液，該操作有別于陸地棉現(xiàn)有應(yīng)用技術(shù)，是適應(yīng)海島棉本身的生理特性，并最大程度上減輕了對子房的機(jī)械傷害、滲透以及膨脹的傷害，盡可能地提高了成鈴率和轉(zhuǎn)基因種子的轉(zhuǎn)化效率。完成該操作后，掛牌標(biāo)記已轉(zhuǎn)基因的棉花幼鈴，并在牌子上記載編號或基因供體和時間。另外，在含外源目的基因緩沖液中加入10PPM的赤霉素，以防止和減少幼鈴的脫落。同時去除所作標(biāo)記果枝上其余未作處理和下部果枝的花，以保證所做處理的花有足夠的養(yǎng)分供給，進(jìn)一步提高座鈴率。
因此，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)勢1、具有獨(dú)創(chuàng)性。目前海島棉轉(zhuǎn)基因未見有任何方法轉(zhuǎn)化成功的報道，本發(fā)明是在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得到了花粉管通道轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用于海島棉的適宜條件，首次實(shí)現(xiàn)海島棉品種的轉(zhuǎn)化改良。
2、座鈴率和轉(zhuǎn)化率高。通過各種改良措施使座鈴率高達(dá)10-15％，轉(zhuǎn)化率達(dá)1--5％。
3、可操作性強(qiáng)?？稍谔镩g直接進(jìn)行，不需要特殊的設(shè)備，且無基因型依賴。
4、育種效率高。要獲得一個純系或品種，常規(guī)方法至少需要6-8年，本方法僅需要3-5年。可大大縮短育種周期。
5、成本低。與基因槍轟擊法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相比，不需要使用昂貴的設(shè)備和耗費(fèi)大量的組織培養(yǎng)化學(xué)藥品。
本發(fā)明的方法簡便、經(jīng)濟(jì)、有效，改變了現(xiàn)有花粉管通道技術(shù)在海島棉上轉(zhuǎn)化率低的現(xiàn)狀。用此方法向海島棉轉(zhuǎn)移各種來源的DNA分子，以達(dá)到有效改變海島棉遺傳組成，創(chuàng)造海島棉新種質(zhì)、改良海島棉品種的目的。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的方法具有轉(zhuǎn)化效率高、改良時間短、便于推廣等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為轉(zhuǎn)入運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因(GhABC1)的海島棉品種新海16號的照片，其中如圖中箭頭所示，抗性植株不出現(xiàn)黃斑，而非抗性植株出現(xiàn)黃斑。
圖2為轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定照片，其中(M)代表PCR的MARKER，(+)為以含目的基因GH的質(zhì)粒載體為模板的陽性對照，(-)代表陰性對照，4911-4、4911-5、4911-9、4911-12、4911-13、4911-17、4911-21均為檢測出的陽性株。
圖3為轉(zhuǎn)入伸展蛋白基因(Expansin gene)的海島棉品種新海17號的照片，其中如圖中箭頭所示，抗性植株不出現(xiàn)黃斑，而非抗性植株出現(xiàn)黃斑。
圖4為轉(zhuǎn)化伸展蛋白基因的轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定照片，圖中(M)代表PCR的MARKER，(+)為以含目的基因E的質(zhì)粒載體為模板的陽性對照，(-)代表陰性對照，(BLK)代表空白對照3284-1、3284-2、3284-5均為檢測出的陽性株。
具體實(shí)施例方式
以下根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。所述實(shí)施例僅是用于解釋本發(fā)明的目的，而不能以任何方式解釋為對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1.將運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因(GhABC1)轉(zhuǎn)入海島棉品種新海16號，培育纖維品質(zhì)改良的海島棉新品種將新海16號(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供)種植至開花，按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(金冬雁，黎孟楓等譯，J.薩姆布魯克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著?？茖W(xué)出版社，1992)提取含運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因的質(zhì)粒DNA。具體如下進(jìn)行。
含運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因的大腸桿菌菌株由中國科學(xué)院植物生理生化研究所提供，將該菌株接種到30ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中(Luria-Bertani)，配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml蒸餾水中加入胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，NaCl10克，搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，用5M NaOH調(diào)節(jié)PH7.0，加入蒸餾水至總體積1升，在1.034×105Pa高壓滅菌20分鐘)，37℃，300rpm培養(yǎng)8hr；取25ml加入含相同抗生素的500mlLB液體培養(yǎng)基中，于37℃，300rpm培養(yǎng)16hr；培養(yǎng)好的菌液于4℃以4000rpm離心15min，棄上清，加入100ml冰預(yù)冷的STE液(含0.1M NaCl，1mM EDTA，PH8.0；10mM Tric·HCl，PH8.0)洗滌沉淀；4000rpm，4℃離心15min，棄上清；加入18ml溶液I(50mM葡萄糖；25mM Tric·HCl，PH8.0；10mM EDTA PH8.0；配好后高壓滅菌)，在渦旋震蕩器上渦旋，使細(xì)菌沉淀充分散開；加40ml新配制的溶液II(0.2MNaOH，1％SDS)，蓋緊瓶蓋，緩慢顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，室溫放置6min；加20ml冰預(yù)冷的溶液III(5M乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)，封住瓶口，搖動離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，置冰上放置30min，形成白色絮狀沉淀；4℃，4000rpm離心15min，用四層滅菌紗布把上清過濾至另一離心瓶中，加0.6倍體積異丙醇，充分混勻，于室溫放置10min；室溫，5000rpm離心15min，回收核酸；小心倒掉上清，敞開瓶口倒置使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉淀和管壁，倒出乙醇，將瓶倒置放在紙巾上控干，在超凈工作臺上將瓶內(nèi)乙醇吹干。
用3ml TE(PH8.0)溶解核酸沉淀，轉(zhuǎn)入一個15ml離心管內(nèi)，加3ml冰預(yù)冷的5M Licl溶液，充分混勻；4℃，1000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)至另一個30ml離心管內(nèi)，加等量異丙醇，充分混勻，室溫下以10000rpm離心10min，回收沉淀的核酸；小心倒掉上清，控干，用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，敞開管口并將管倒置于紙巾上，在超凈工作臺上將管內(nèi)乙醇吹干。
用500ul含無DNA酶的胰RNA酶(20ul/ml)的TE(PH8.0)溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)至一微量離心管中，室溫放置30min；用酚、酚氯仿、氯仿各抽投一次，離心時間分別為12000rpm，6min，6min，10min；將水相轉(zhuǎn)到另一個1.5ml離心管中，加100ul 10M乙酸銨，充分混勻，加2倍體積(約1ml)乙醇，-20℃放置30min；4℃，12000rpm離心10min，回收沉淀的質(zhì)粒DNA；吸去上清，加200ul 4℃的70％乙醇，4℃ 12000rpm離心2min；吸去上清，在超凈工作臺上將管內(nèi)乙醇吹干；取其中1次的質(zhì)粒DNA用TE(PH8.0)稀釋后測量OD260，計算質(zhì)粒DNA的濃度，然后將質(zhì)粒DNA貯存于-20℃。經(jīng)電泳和紫外分光光度計測定質(zhì)粒的濃度、純度(濃度為0.02μg/μl，純度為OD260/OD280在1.8-2.0之間)。保存于0℃--20℃。于盛花期，在6:00--10:00的時間，選擇授粉后8-16小時，變成紫紅色的花，去除整個花冠，剪下2/3柱頭，用微量注射器從斷面沿花柱中軸輕柔插入子房長度的約1/4處，再退回2mm左右，小心注入10微升加有10PPM赤霉素的在-20℃--0℃下預(yù)冷的含上述外源目的基因的緩沖液。去除所作標(biāo)記果枝上其余未作處理和下部果枝的花，以保證所做處理的花有足夠的養(yǎng)分供給。做好標(biāo)記和記載。
按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)，在棉纖維成熟時，按標(biāo)記進(jìn)行收獲、人工剝籽，得到轉(zhuǎn)化棉籽。
將收獲后的種子種植在海南，從幼苗展開第3片真葉時，根據(jù)目的基因所攜帶的選擇標(biāo)記基因，使用卡那霉素作為選擇劑，濃度0.005-0.01g/ml，在葉片上用脫脂棉球棒進(jìn)行涂抹，五天后觀察變色情況。不抗者出現(xiàn)黃斑，抗者不出現(xiàn)黃斑。第四、第五片真葉依此操作，選擇出抗性植株(參見圖1)。
按常規(guī)方法，取抗性植株葉片提取DNA，進(jìn)行PCR分析。
棉葉總DNA提取采用CTAB法。稱取7-10mg棉花鮮葉片，液氮研磨至粉末狀，加入1mlBuffer I(50mM Tris-HCl pH8.0，5mMEDTA pH8.0，350mM山梨醇，0.1％β-巰基乙醇，10％PEG6000)，混勻后轉(zhuǎn)入2ml離心管中，4℃，12000rpm離心5分鐘。去掉上清后用500μl的Buffer II(50mMTris-HCl pH8.0，5mM EDTA pH8.0，350mM山梨醇，0.1％β-巰基乙醇，1％SDS，710mM NaCl，0.1％CTAB)重懸沉淀，60℃保溫10分鐘。分別用等體積的苯酚和氯仿各抽提一次。將上清滴入等體積的異丙醇中進(jìn)行沉淀。4℃，12000rpm離心去除異丙醇。DNA沉淀用70％乙醇洗后，干燥待用。
PCR特異引物由上海生工生物工程有限公司合成，其引物序列為第一輪上游P正(E6-81) 5`--CAC CAT TCA CCA CTT GCTC--3` 19bp(SEQ IDNO1)下游NOS1(AS1) 5`--CGA ATT CCC GAT CTA GTA AC-3` 20bp(SEQ IDNO2)第二輪上游P3(E6-S2) 5`--GCT CCT AAT TGA GTT GAA ATC TTT-3`24bp(SEQID NO3)下游93400(AS) 5`--TTC CCA ATA ACA GTA TCA GCG C-3` 22bp(SEQID NO4)PCR反應(yīng)條件為
10×PCR Buffer2μl4×dNTP(2mM) 2μlTaq DNA(5u/μl) 0.4μl模板 100ng加水至20μl反應(yīng)程序?yàn)榈谝惠? 94℃5m 1個循環(huán) 3 72℃10m 1個循環(huán)第二輪1 94℃2m 1個循環(huán) 3 72℃10m1個循環(huán)在進(jìn)行完P(guān)CR反應(yīng)之后，取反應(yīng)混合物產(chǎn)物，通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及特異性(參見圖2)。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(GHABC)片段大小約650bp。經(jīng)上述試驗(yàn)證實(shí)獲得了轉(zhuǎn)基因植株(參見圖1)。
將轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行農(nóng)藝性狀和纖維品質(zhì)鑒定篩選(通過田間觀察記載，收獲考種鑒定株型，株高，鈴數(shù)，單鈴重，籽棉產(chǎn)量，衣分等農(nóng)藝性狀。同時利用HVI檢測皮棉纖維品質(zhì))，獲得了纖維品質(zhì)(強(qiáng)度、長度)發(fā)生改變的轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)株系品系培育，獲得含目標(biāo)性狀的優(yōu)良種質(zhì)、品系或品種，實(shí)現(xiàn)海島棉的創(chuàng)新和改良。
實(shí)施例2.將伸展蛋白基因(Expansin gene)轉(zhuǎn)入海島棉品種新海17號，培育纖維品質(zhì)改良海島棉新品種將新海17號(新疆農(nóng)一師阿拉爾農(nóng)科所提供，)種植至開花，按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》提取含伸展蛋白基因的質(zhì)粒DNA。具體如下。
含伸展蛋白基因的大腸桿菌由中國科學(xué)院微生物研究所提供，將該菌株接種到30ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中(Luria-Bertani)，配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml蒸餾水中加入胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，NaCl10克，搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，用5MnaOH調(diào)節(jié)PH7.0，加入蒸餾水至總體積1升，在1.034×105Pa高壓滅菌20分鐘)，37℃，300rpm培養(yǎng)8hr；取25ml加入含相同抗生素的500mlLB液體培養(yǎng)基中，于37℃，300rpm培養(yǎng)16hr；培養(yǎng)好的菌液于4℃以4000rpm離心15min，棄上清，加入100ml冰預(yù)冷的STE液(含0.1M NaCl，1mM EDTA，PH8.0；10mM Tric·HCl，PH8.0)洗滌沉淀；4000rpm，4℃離心15min，棄上清；加入18ml溶液I(50mM葡萄糖；25mM Tric·HCl，PH8.0；10mM EDTA PH8.0；配好后高壓滅菌)，在渦旋震蕩器上渦旋，使細(xì)菌沉淀充分散開；加40ml新配制的溶液II(0.2MNaOH，1％SDS)，蓋緊瓶蓋，緩慢顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，室溫放置6min；加20ml冰預(yù)冷的溶液III(5M乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)，封住瓶口，搖動離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，置冰上放置30min，形成白色絮狀沉淀；4℃，4000rpm離心15min，用四層滅菌紗布把上清過濾至另一離心瓶中，加0.6倍體積異丙醇，充分混勻，于室溫放置10min；室溫，5000rpm離心15min，回收核酸；小心倒掉上清，敞開瓶口倒置使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉淀和管壁，倒出乙醇，將瓶倒置放在紙巾上控干，在超凈工作臺上將瓶內(nèi)乙醇吹干。
用3ml TE(PH8.0)溶解核酸沉淀，轉(zhuǎn)入一個15ml離心管內(nèi)，加3ml冰預(yù)冷的5M Licl溶液，充分混勻；4℃，1000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)至另一個30ml離心管內(nèi)，加等量異丙醇，充分混勻，室溫下以10000rpm離心10min，回收沉淀的核酸；小心倒掉上清，控干，用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，敞開管口并將管倒置于紙巾上，在超凈工作臺上將管內(nèi)乙醇吹干。
用500ul含無DNA酶的胰RNA酶(20ul/m1)的TE(PH8.0)溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)至一微量離心管中，室溫放置30min；用酚、酚氯仿、氯仿各抽投一次，離心時間分別為12000rpm，6min，6min，10min；將水相轉(zhuǎn)到另一洐個1.5ml離心管中，加100ul 10M乙酸銨，充分混勻，加2倍體積(約1ml)乙醇，-20℃放置30min；4℃，12000rpm離心10min，回收沉淀的質(zhì)粒DNA；吸去上清，加200ul 4℃的70％乙醇，4℃12000rpm離心2min；吸去上清，在超凈工作臺上將管內(nèi)乙醇吹干；取其中1次的質(zhì)粒DNA用TE(PH8.0)稀釋后測量OD260，計算質(zhì)粒DNA的濃度，然后將質(zhì)粒DNA貯存于-20℃。，經(jīng)電泳和紫外分光光度計測定質(zhì)粒的濃度、純度(濃度為0.02μg/μl，純度為OD260/OD280在1.8-2.0之間)，保存于0℃--20℃。
于盛花期，在6:00--11:00的時間，選擇授粉后8-16小時，變成紫紅色的花，去除整個花冠，剪下2/3柱頭，用微量注射器從斷面沿花柱中軸輕柔插入子房長度的約1/4處，再退回2mm左右，小心注入10微升加有10PPM赤霉素的在-20℃--0℃下預(yù)冷的含外源目的基因的緩沖液。去除所作標(biāo)記果枝上其余未作處理和下部果枝的花，以保證所做處理的花有足夠的養(yǎng)分供給。做好標(biāo)記和記載。
按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)，在棉纖維成熟時，按標(biāo)記進(jìn)行收獲、人工剝籽，得到轉(zhuǎn)化棉籽。
將收獲后的種子種植在海南，從幼苗展開第3片真葉時，根據(jù)目的基因所攜帶的選擇標(biāo)記基因，使用卡那霉素作為選擇劑，濃度0.005-0.01g/ml，在葉片上用脫脂棉球棒進(jìn)行涂抹，五天后觀察變色情況。不抗者出現(xiàn)黃斑，抗者不出現(xiàn)黃斑。第四、第五片真葉依此操作，選擇出抗性植株(參見圖3)。
按常規(guī)方法，將抗性植株取葉片提取DNA，進(jìn)行PCR分析，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株(參見圖3)。
PCR特異引物由上海生工生物工程有限公司合成，其引物序列為exn55`--GCT AGC TCT TAC TCA AAT-3` 18bp(SEQ ID NO5)exn35`--GTC TTA AAA CTG GCC TCC-3` 18bp(SEQ ID NO6)PCR反應(yīng)條件為10×PCR Buffer 2μl4×dNTP(2mM)2μlTaq DNA(5u/μl) 0.4μl模板100ng加水至 20μl反應(yīng)程序?yàn)? 94℃3m 1個循環(huán) 3 72℃10m1個循環(huán)在進(jìn)行完P(guān)CR反應(yīng)之后，取反應(yīng)混合物產(chǎn)物，通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及特異性(參見圖4)。伸展蛋白基因(E)片段大小約814bp。
將轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行農(nóng)藝性狀和纖維品質(zhì)鑒定篩選(通過田間觀察記載，收獲考種鑒定株型，株高，鈴數(shù)，單鈴重，籽棉產(chǎn)量，衣分等農(nóng)藝性狀。同時利用HVI檢測皮棉纖維品質(zhì)。)，獲得了纖維品質(zhì)(強(qiáng)度、長度)發(fā)生改變的轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)株系品系培育，獲得含目標(biāo)性狀的優(yōu)良種質(zhì)、品系或品種，實(shí)現(xiàn)海島棉的創(chuàng)新和改良。
比較例花粉管通道法在陸地棉上一般的操作方法為首先選擇次日將開放的花蕾進(jìn)行自交，在開花后12-24小時左右即開花次日，選擇果枝和花位較好的幼子房作為轉(zhuǎn)化對象。用50μl微量進(jìn)樣器作為注射的工具，注射時摘除或剝?nèi)セò?，抹平花柱，右手持微量進(jìn)樣器，左手輕扶摘除花瓣后的幼子房，從抹平花柱處沿子房的縱軸方向進(jìn)針至子房長度的約2/3處，并后退至1/3處，輕緩操作注射器，將DNA溶液推入受精子房中。若將這種操作應(yīng)用在生理特性更加敏感的海島棉上，會對幼嫩子房造成極大傷害，導(dǎo)致座鈴率幾乎為零。
由于海島棉下部果枝的自然脫落率較高，故在進(jìn)行海島棉花粉管通道轉(zhuǎn)化時，選擇海島棉中上部果枝第一或第二個果節(jié)位的花，在開花授粉后8-16小時內(nèi)，天氣晴朗且氣溫在15-30℃時導(dǎo)入外源目的基因，以避開不利生理?xiàng)l件和環(huán)境條件的影響。首先，將變成紫紅色的花，去除整個花冠，剪下2/3柱頭，用微量注射器從斷面沿花柱中軸輕柔插入子房長度的約1/4處，再退回2mm左右，然后小心注入10微升加有10PPM赤霉素的在-20℃--0℃下預(yù)冷的含外源目的基因的緩沖液。最后去除所作標(biāo)記果枝上其余未作處理和下部果枝的花，以保證所做處理的花有足夠的養(yǎng)分供給。做好標(biāo)記和記載。
2002年分別用陸地棉所采用的花粉管通道法技術(shù)和本發(fā)明方法對海島棉受體材料新海5號、19號、16號和17號進(jìn)行了座鈴率和轉(zhuǎn)化效率的比較。具體結(jié)果見下表2。
表2.現(xiàn)有技術(shù)與本方法轉(zhuǎn)化效率的對比

從上述結(jié)果可以看出，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果是顯著改變了海島棉的轉(zhuǎn)化率，原有的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化率為零，而本發(fā)明的轉(zhuǎn)化率在3％左右，有時可達(dá)5％。
IN043754-序列表SEQUENCE LISTING<110>新疆溢達(dá)農(nóng)業(yè)科技有限公司<120>海島棉花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)<130>IN043754<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>1caccattcac cacttgctc 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2cgaattcccg atctagtaac 20<210>3<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>3gctcctaatt gagttgaaat cttt 24<210>4<211>22<212>DNA<213>人工合成
<400>4ttcccaataa cagtatcagc gc 22<210>5<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>5gctagctctt actcaaat18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>6gtcttaaaac tggcctcc18
權(quán)利要求
1.一種海島棉花粉管通道轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于包含以下步驟1)去除變成紫紅色的花冠，2)用微量注射器從斷面沿花柱中軸插入子房長度的約1/4處，再退回2毫米左右，3)注入含外源目的基因的緩沖液，4)進(jìn)行培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因植株。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，另外包含在去除變成紫紅色的花冠后，剪去2/3柱頭的步驟。
3.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，另外包含在注入含外源基因的緩沖液后，去處未處理的花的步驟。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述花冠位于海島棉中上部果枝第一或第二個果節(jié)位的花上。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述含外源基因的緩沖液在注入前于-20℃-0℃預(yù)冷卻，和所述注入是在開花授粉后8-16小時內(nèi)，于15-30℃的溫度下進(jìn)行。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述含外源基因的緩沖液中含有10PPM赤霉素。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述外源基因是棉花或非棉花基因，和來源于種間，屬間，科間或微生物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述外源基因是品質(zhì)、抗性或其他有益性狀基因。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述外源品質(zhì)基因包括但不僅限于蜘蛛絲基因，運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因或伸展蛋白基因。
10.一種用權(quán)利要求1的方法轉(zhuǎn)化現(xiàn)有海島棉品種所產(chǎn)生的新的海島棉新品系和新品種。
11.權(quán)利要求10的現(xiàn)有海島棉品種，包括但不僅限于海島棉品種新海5號，新海14號，新海15號，新海16號，新海17號，新海18號，新海19號，新海20號和新海21號。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海島棉品質(zhì)改良技術(shù)。更具體地，本發(fā)明涉及一種海島棉花粉管通道轉(zhuǎn)基因方法，該方法簡便、經(jīng)濟(jì)、有效，改變了現(xiàn)有花粉管通道技術(shù)在海島棉上轉(zhuǎn)化率低的現(xiàn)狀。另外，本發(fā)明涉及用此方法獲得的轉(zhuǎn)化了外源目的基因的海島棉。
文檔編號C12N15/89GK1769466SQ20041009010
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月2日
發(fā)明者張玉高, 萬旭中, 劉霞, 楊克銳, 黃全生, 王冬梅, 黃樂平, 李建平 申請人:新疆溢達(dá)農(nóng)業(yè)科技有限公司