專利名稱：提高棉花花粉管通道導入基因轉化率的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種提高棉花花粉管通道導入基因轉化率的方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
利用花粉管通道導入基因的技術是一種借助植物的種質細胞或受精卵為轉化對象的直接轉化技術，該技術是我國周光宇先生創(chuàng)立并首先進行應用的(周光字等，Inheritance of exogenous DNA into cotton embryos，Methods inEnzymology，1983，101433-488)。1978年周光宇充分調查了國內外植物遠緣雜交變異后代，發(fā)現(xiàn)植物遠緣雜交后代可產生的表型變異，但觀察不到其染色體水平的形態(tài)變化，由此推測表型變異是DNA片段雜交的結果。根據(jù)植物受精過程的解剖學特性，認為外源DNA可以通過花粉管通道進入胚囊，轉化受精卵或者早期的胚胎細胞，該技術開創(chuàng)了整體植物活體轉化的新途徑(龔蓁蓁等，授粉后外源DNA導入植物技術-DNA通過花粉管道進入胚囊，中國科學(B輯)，1988(6)611-614。)。在早期進行的花粉管通道遺傳轉化研究中，利用的是含有目標性狀的總DNA進行遺傳轉化，無法用分子雜交的技術進行驗證，而導致國內外學者對該技術的可行性產生了質疑。直到20世紀九十年代，隨著基因克隆技術的完善和發(fā)展，克隆了大量的目的基因，這些目的基因通過花粉管通道技術導入棉花(謝道昕等，蘇云金芽孢桿菌(Bt)殺蟲晶體蛋白基因導入棉花獲得轉基因植株，中國科學，1991(4)367-373)、小麥(曾君祉等，花粉管通道(或運載)法轉化的植株后代遺傳表現(xiàn)及轉化機理的探討，科學通報，1998，43(6)561-566)和水稻(Luo Zhongxun，Wu Ray.，A simple method for thetransformation of rice via the pollen-tube pathway，Plant Mol Bio Rep，1988，6(3)165-174)等農作物中，利用分子雜交驗證了目的基因可以整合到植物的基因組中，從而使利用花粉管通道技術進行植物遺傳轉化的可行性得到了證實?；ǚ酃芡ǖ兰夹g簡單易行，成本低，可以克服組織培養(yǎng)和誘導植株再生等一套復雜的人工培養(yǎng)過程，避免了植物組織培養(yǎng)過程中對基因型的依賴和各種難以預測的體細胞變異。因此，花粉管通道技術在我國的農作物遺傳轉化中發(fā)揮著重要的作用。
棉花的花器官大、花期長且組織培養(yǎng)受基因型的限制，因此利用花粉管通道技術進行棉花遺傳轉化的研究開始比較早。目前利用該技術已將Bt殺蟲毒蛋白基因(郭三堆，崔洪志，中國轉基因抗蟲棉又取得新進展，中國農業(yè)科學，1998，31(6)91-94。郭三堆等，雙價抗蟲轉基因棉花研究，中國農業(yè)科學，1999，32(3)1-7)、蛋白酶抑制劑基因(李燕娥等，豇豆胰蛋白酶抑制劑轉基因棉花的獲得，棉花學報，1998，10(5)237-243)、幾丁質酶基因(王偉等，雙價抗蟲基因陸地棉轉化植株的獲得，植物學報，1999，41(4)384-388)和葡萄糖氧化酶基因(鞏萬奎等，葡萄糖氧化酶基因在棉花中的高效轉化，棉花學報，1999，11(5)241-246.)等導入不同的棉花品種中，并且選育出了生產上大面積應用的棉花品種(劉方等，中國棉花轉基因研究與應用，棉花學報，2002，14(4)249～253)。但是，由于影響棉花花粉管通道技術的因素多，導致該技術的轉化率低且不穩(wěn)定(在棉花中它的轉化率為1％左右)(王長海等，利用花粉管通道法將外源質粒DNA注入棉花的改良方法，棉花學報，1999，11(4)220～221)。提高棉花花粉管通道技術的轉化率是棉花遺傳轉化研究急需解決的問題之一。

發(fā)明內容本發(fā)明的目的是采取正交試驗設計，探討導入緩沖液不同成分、DNA濃度、和導入液的體積對棉花花粉管通道導入基因轉化率的影響，以篩選出提高棉花花粉管通道技術轉化率的緩沖液配方。
根據(jù)影響棉花花粉管通道導入基因轉化率主要因素，選取四種因子(因素)TE(Tris-HCl、EDTA-Na2和NaCl)(均為市售化學試劑)緩沖液的濃度、DNA的濃度、甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，簡稱EMS，Sigma公司產品)的濃度和導入液體的體積，每個因素分別選用三個水平，利用L9(34)的正交表，通過3年的多點、不同基因型棉花品種的試驗，獲得了提高棉花花粉管通道導入基因轉化率的緩沖液配方比，具體配方為TE緩沖液的適宜濃度為10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，0.5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)，10mmol/L氯化鈉(NaCl)。DNA的適宜濃度為當利用外源總DNA時，DNA的濃度為0.1-0.2μg·μl-1，當利用外源質粒DNA時，濃度為0.01-0.02μg·μl-1。EMS的適宜濃度為0.01μg·μl-1-0.05μg·μl-1。導入液體的總體積為10-15·μl。
本配方的關鍵是加入了適宜濃度的EMS，EMS作為化學誘變劑，在提高棉花花粉管通道導入基因轉化率方面具有2個作用一是使受體棉花DNA受到損傷，在棉花DNA復制時，有利于外源基因的整合；二是EMS具有抑制棉花自身核酸酶的作用，減少外源基因被受體棉花核酸酶的水解，從而保證了有足量的外源基因轉化受體棉花。但是，EMS的濃度不能過高，否則對受體棉花造成危害，也易降低花粉管通道導入基因的轉化率。


圖1提高棉花花粉管通道導入基因轉化率的程序示意圖1是配制10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)溶液2是配制0.5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)溶液3是配制10mmol/L氯化鈉(NaCl)溶液
4是將10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、0.5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)和10mmol/L氯化鈉(NaCl)混合形成TE緩沖液，用于稀釋的脫氧核糖核酸(DNA)5是配制甲基磺酸乙酯(EMS)6是配制轉化DNA溶液7是將DNA導入棉花花粉管通道具體實施方式
1、DNA的提取進行目的基因的遺傳轉化時，提取質粒DNA，然后在0.8％的瓊脂糖膠上電泳，檢測質粒DNA的純度和濃度，用TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，0.5mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl)稀釋質粒DNA到1μg·μl-1，根據(jù)實驗的需要，使用時分別稀釋至0.01-0.02μg·μl-1。進行總DNA的遺傳轉化時，提取植物的總DNA，DNA經純化后，TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，0.5mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl)稀釋總DNA到1μg·μl-1，根據(jù)實驗的需要，使用時分別稀釋至0.1-0.2μg·μl-1。
2、EMS溶液的配制甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，簡稱EMS)為Sigma公司產品，用磷酸緩沖液配成1mg·ml-1的母液，過濾滅菌，4℃保存。
3、轉化DNA溶液的配制利用花粉管通道導入基因進行轉化前，在溶解DNA的TE緩沖液中，加入EMS溶液，使最終EMS濃度為0.01μg·μl-1-0.05μg·μl-1；利用外源質粒時，質粒DNA濃度為0.01-0.02μg·μl-1，利用總DNA時，其濃度0.1-0.2μg·μl-1。
4、待轉化棉花的種植在進行棉花遺傳轉化時，要求稀植，每公頃30,000棵，在肥料、水條件較好的地塊進行，有利于提高轉化率。
5、花蕾的自交在棉花開花的前一天，選擇快速伸長、突出花萼、花冠顏色為淡黃色或乳白色的花蕾，將花冠的前端用細線扎緊，并將細線的另一端系于鈴柄，作為收獲時的標記。
6、轉化操作開花的次日，選擇每個果枝1-2節(jié)位、成鈴率較高的花朵作為轉基因操作的對象，以醫(yī)用50μl的微量進樣器作為轉基因注射的工具(使用前后用淡洗滌劑清洗，再用蒸餾水漂洗)。注射時，摘除或剝去花冠，抹平柱頭，防止損傷幼子房的表皮層。一只手持微量注射器，另一只手輕扶去除花冠的幼子房，從抹平花柱處沿子房的縱軸方向進針至子房長度的2/3處，并后退至約1/3處。輕輕操作微量注射器，將10μl轉基因液推入受精的子房，使每朵花中EMS的量為0.1μg-0.5μg，總DNA的量為1-2μg，質粒DNA的量為0.1-0.2μg。
7、轉化后處理在注射鈴的鈴柄基部涂抹40μg·l-1的赤霉素溶液，并掛牌進行標記，同時摘除注射鈴所在果枝的頂心，以提高成鈴率。收獲時對注射鈴要單獨收、軋和保持，供下一步檢測。
轉基因棉花的檢測對轉基因收獲的種子進行檢測時，以原品種作為對照。
(1)進行目的基因轉化的檢測根據(jù)構建載體上的標記基因，首先進行標記基因的檢測，然后進行目標性狀的檢測，最后，進行目的基因和表達的分子鑒定。
(2)進行總DNA轉化的檢測主要根據(jù)轉基因棉花與原品種的形態(tài)特征、生理特性的差異進行檢測。
以本發(fā)明的轉基因液，利用花粉管通道技術導入基因，于2002-2003連續(xù)2年，將含有IPT基因的表達載體pBG121分別導入不同的陸地棉品種中棉所10號、中棉所24號和中棉所36號中，同時，以TE緩沖液作為對照，中棉所10號、中棉所24號和中棉所36號兩年的平均轉化率分別為2.4％、3.8％和2.9％，而對照處理平均轉化率分別為0.7％、1.3％和1.2％。
權利要求
1一種提高棉花花粉管通道導入基因轉化率的方法，其特征在于導入基因緩沖液的組成成分為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)，氯化鈉(NaCl)、甲基磺酸乙酯(EMS)和脫氧核糖核酸(DNA)。
2根據(jù)權利要求1所述一種提高棉花花粉管通道導入基因轉化率的方法，其特征在于緩沖液Tris-HCl、EDTA-Na2和NaCl三者濃度分別為10、0.5和10mmol/L。
3根據(jù)權利要求1所述一種提高棉花花粉管通道導入基因轉化率的方法，其特征在于導入基因時EMS的濃度為0.01μg·μl-1-0.05μg·μl-1，每朵花的用量為0.1-0.5μg。
4根據(jù)權利要求1所述一種提高棉花花粉管通道導入基因轉化率的方法，其特征在于導入外源總DNA時濃度為0.1-0.2μg·μl-1，導入外源質粒DNA時濃度為0.01-0.02μg·μl-1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高棉花花粉管通道導入基因轉化率的方法，屬于生物技術領域。采取正交試驗設計，探討了不同緩沖液成分對棉花花粉管通道導入外源總DNA或者質粒DNA轉化率的影響，篩選出了適宜提高棉花花粉管通道導入基因轉化率的緩沖液配方，其主要成分是在TE緩沖液中加入0.01μg·μl
文檔編號C12N15/09GK1624125SQ200410036058
公開日2005年6月8日 申請日期2004年11月4日 優(yōu)先權日2004年11月4日
發(fā)明者沈法富, 韓秀蘭, 李靜 申請人:山東農業(yè)大學