專利名稱：海水養(yǎng)殖真鯛的hepcidin抗菌肽基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種從海水養(yǎng)殖真鯛(Pagrus major)中克隆的hepcidin抗菌肽基因。
背景技術：
海水養(yǎng)殖真鯛，英文名Red Seabream，拉丁名Pagrus major，屬于輻鰭亞綱，鱸形目，鯛科，真鯛屬，俗稱紅鱗加吉魚；近年來在我國廣東、福建等沿海省份對真鯛的人工養(yǎng)殖面積增大，已成為主要的海水養(yǎng)殖經濟魚類，是出口日本、韓國及東南亞國家主要的名貴食用經濟魚類之一。近20年來，隨著真鯛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛，高密度集約化養(yǎng)殖帶來了多種負因子影響，其病害種類、發(fā)病頻率及其危害性亦逐年增加，特別是細菌性疾病不斷發(fā)生，給整個真鯛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失。尤其是海水養(yǎng)殖業(yè)大量應用抗生素，造成水產品中含有過量違禁的抗生素藥物，使產品質量下降，養(yǎng)殖環(huán)境惡化，出口受阻，已嚴重影響到水產業(yè)的健康發(fā)展。
抗菌肽(Antibacterial Peptides，ABP)是一類具有很強的廣譜抗細菌活性的天然小肽類物質，被認為是魚、蝦、貝類等動物非特異性免疫防御系統(tǒng)的主要成分之一，當魚體受到損傷或病原微生物侵襲時，能迅速產生抗菌肽以預防和殺傷病原微生物的入侵，其合成速度快、在體內擴散迅速、靈活的特點是其他大分子蛋白質(如抗體等)和免疫細胞所不具備的，在防御海水性細菌和病毒入侵方面起著重要作用。Hepcidin抗菌肽是近年來發(fā)現(xiàn)的另一類具有獨特性質的抗菌肽，2000年Krause A等(Krause A，et al.，F(xiàn)EBS Lett.，2000，480(2-3)147-150)從人的血液濾液分離到LEAP-1(liver-expressed antimicrobial peptide，肝臟表達的抗菌肽)、2001年Park等從人尿液中分離出一個富含半胱氨酸的肽，因為它來源于肝且有抗菌特性，所以首先命名為hepcidin(Park CH，et al.，Biol，Chem.，2001，276(11)7806-7810)，繼之從鼠(Mus musculus)分離到同家族的2個hepcidin前體肽(PigeonC，et al.，J.Biol.Chem，2767811-7819；IlyinG，et al.，F(xiàn)EBS Lett.，2003，54222-26)。Shiker等于2002年首次報道從雜交斑紋鱸魚(Morone chrysops×M.saxatilis)分離到一個hepcidin成熟肽(Shike H，et al.，Eur.J.Biochem.，2002，2692232-2237)，初步研究發(fā)現(xiàn)hepcidin抗菌肽與其它報道的抗菌肽一樣，具有抗菌作用。研究證明，不同種屬來源的hepcidin抗菌肽基因家族在成熟肽同一位點上含有典型特征的八個半胱氨酸殘基的保守序列，有抗各種真菌和革蘭氏陽性、陰性菌的活性。在魚類，除已報道從雜交斑紋鱸魚、斑馬魚(zebrafish)、美洲擬鰈(winter flounder)、鮭魚(salmon)等分離出hepcidin基因片斷外(Shike H，et al.，Dvelopment and Comparatvive Immunology.，2004，28747-745；Douglas SE，et al.，Dvelopment and Comparatvive Immunology.，2001，25137-147；Douglas SE，et al.，Dvelopment and Comparatvive Immunology.，2003，27587-601)，還報道從其他魚類如日本比目魚(Paralichthys olivaceus)、大西洋鮭(Salmo salar)和蝦虎魚(Gillichthys mirabilis)等的基因文庫中通過表達序列標簽(EST)分析發(fā)現(xiàn)具有hepcidin基因序列。
抗菌肽基本的抗菌機理是抗菌肽分子破壞細菌的細胞膜結構，引起胞內水溶性物質大量滲出，導致細菌停止生長或死亡。其抗菌機理不同于傳統(tǒng)抗生素，由于分子量小，極易擴散到感染部位，使用后不存在產生耐藥性問題，且進入機體后無有害殘留。因此，抗菌肽在海水養(yǎng)殖魚類的疾病防治上將是一種應用前景廣闊的抗菌藥物；但通過魚類直接提取或利用化學方法人工合成天然的抗菌肽，受動物來源和化學合成方法的局限，很難獲得足夠量的抗菌肽，且費用昂貴，因而分離克隆抗菌肽基因，利用基因工程方法體外大量生產抗菌肽，是獲得高產量的抗菌肽并保證其在水產養(yǎng)殖業(yè)大面積推廣應用的前提。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的旨在提供一種從海水養(yǎng)殖真鯛(Pagrus major)中克隆的hepcidin抗菌肽基因。該基因可與畢赤酵母等構建真核表達載體建立高效表達hepcidin的基因工程菌株，體外大量生產真鯛hepcidin抗菌肽，作為飼料免疫添加劑可替代傳統(tǒng)飼料中的某些抗生素；還可以作為替代某些耐藥性抗生素的有效抗菌藥物。
本發(fā)明所說的海水養(yǎng)殖真鯛hepcidin抗菌肽基因cDNA共有586nt(不包括poly(A))，其中含有5’端非編碼區(qū)長94nt(5’UTR)，1個閱讀框長264nt，3’非編碼翻譯區(qū)長243nt(3’UTR)。其GenBank系列號為AY557619。其序列如下序列表一海水養(yǎng)殖真鯛(Pagrus major)的hepcidin抗菌肽全長cDNA序列10 20 30 40 50 60aaccatcaga caggagaaga agtgaaagga gctgacgaga gtcaccaaaa gaatcaaagg70 80 90100110120actgaacaag ttaaagcagt caaagcctcc taagatgaag acattcagtg ttgcagttgc130140150160170180agtggccgtc gtgctcacct ttatttgcct tcaggagagc tctgctgcct cagttactga190200210220230240ggtgcaagag ctggaggagc caatgagcaa tggcagtcca gttgctgcac atgaagagat250260270280290300gccagaggag tcctggaaga tgccgtataa caacagacac aagcgcagcc ctgctggctg310320330340350360
tcgcttttgc tgcggttgct gtcctaacat gattggatgt ggtgtctgct gcaggttc 370 380390400410 420 tgattcctg ctgcagcctg ggatttacac aacaaccact aaatatatct ttgtcaagat430440450460470480ttttacttta aaagcagttt tacgtctttc agttgtggct gttaatatct gaggatgttt490500510520530540ttgaatttgg taatgctgca gagaatgtgt gctcactgat gtgactgtat catctacaca550560570580590600cactactaca gtgtattgtc acaataaact ttaggtttac tcatgcaaaa aaaaaaaaaa601a序列表二海水養(yǎng)殖真鯛的hepcidin抗菌肽cDNA預測編碼蛋白氨基酸序列10 20 30 40 50 60MKTFSVAVAV AVVLTFICLQ ESSAASVTEV QELEEPMSNG SPVAAHEEMP EESWKMPYNN7080 88RHKRSPAGCR FCCGCCPNMI GCGVCCRF*序列表三 海水養(yǎng)殖真鯛的hepcidin抗菌cDNA讀碼框及預測蛋白氨基酸序列1A ACC ATC AGA CAG GAG AAG AAG TGA AAG GAG CTG ACG AGA GTC ACC AAA AGA ATC AAA 5859 GGA CTG AAC AAG TTA AAG CAG TCA AAG CCT CCT AAGATGAAG ACA TTC AGT GTT GCA GTT 1181Met Lys Thr Phe Ser Val Ala Val 8119 GCA GTG GCC GTC GTG CTC ACC TTT ATT TGC CTT CAG GAG AGC TCT GCT GCC TCA GTT ACT1789 Ala Val Ala Val Val Leu Thr Phe Ile Cys Leu Gln Glu Ser Ser Ala Ala Ser Val Thr 28179 GAG GTG CAA GAG CTG GAG GAG CCA ATG AGC AAT GGC AGT CCA GTT GCT GCA CAT GAA GAG23829 Glu Val Gln Glu Leu Glu Glu Pro Met Ser Asn Gly Ser Pro Val Ala Ala His Glu Glu 48239 ATG CCA GAG GAG TCC TGG AAG ATG CCG TAT AAC AAC AGA CAC AAG CGC AGC CCT GCT GGC29849 Met Pro Glu Glu Ser Trp Lys Met Pro Tyr Asn Asn Arg His Lys Arg Ser Pro Ala Gly 68299 TGT CGC TTT TGC TGC GGT TGC TGT CCT AAC ATG ATT GGA TGT GGT GTC TGC TGC AGG TTC35869 Cys Arg Phe Cys Cys Gly Cys Cys Pro Asn Met Ile Gly Cys Gly Val Cys Cys Arg Phe 88359 TGA TTC CTG CTG CAG CCT GGG ATT TAC ACA ACA ACC ACT AAA TAT ATC TTT GTC AAG 41889 *** ---89419 ATT TTT ACT TTA AAA GCA GTT TTA CGT CTT TCA GTT GTG GCT GTT AAT ATC TGA GGA TGT478479 TTT TGA ATT TGG TAA TGC TGC AGA GAA TGT GTG CTC ACT GAT GTG ACT GTA TCA TCT ACA538
539 CAC ACT ACT ACA GTG TAT TGT CACAAT AAACTT TAG GTT TAC TCA TGC AAA AAA AAA AAA598599 AAA海水養(yǎng)殖真鯛hepcidin cDNA基因克隆過程如下1)參考雜交斑紋鱸魚hepcidin的基因序列(Shike H，et al.，Eur.J.Biochem.，2002，2692232-2237)，通過優(yōu)化選擇設計合成特異引物S1(上游引物起始密碼子ATG前段序列24個bp(含ATG)+2個修飾堿基CG)CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGA TG，Al(下游引物終止密碼子TGA前段序列25個bp)GAA CCT GCA GCA GAC ACC ACA TCC G，以細菌感染后海水養(yǎng)殖真鯛肝臟總RNA為模板進行RT-PCR擴增，得到約300bp特異擴增cDNA條帶，經測序得到287bp的基因片段hepc；在NCBI網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)通過Blast分析證實得到的287bp基因hepc具有包括起始密碼子在內的編碼區(qū)，與雜交斑紋鱸魚的抗菌肽hepcidin有較高的同源性(＞85％)，并且該基因推導的氨基酸序列C末端也富含hepcidin基因家族特有的八個半胱氨酸的保守序列。
2)根據(jù)獲得的hepc片段設計合成特異引物A2(密碼子ATG下游105bp-82bp)作為下游引物TGG CTC CTC CAG CTC TTG CAC CTC，利用5′-CDS引物(Clontech.)5′-(T25)N-1N-3′，N＝A、C、G或T；N-1＝A、G或C和SMART II A oligo(SMARTTMRACE cDNA AmplificationKit，Clontech.)(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG做為上游引物，以細菌感染后真鯛肝臟總RNA為模板，進行5`race；從真鯛肝組織中擴增出一條約200bp cDNA條帶，測序得到一條包含5’UTR和一部分編碼區(qū)在內的202bp的hepc5`端cDNA片段。
3)利用特異性上游引物S1和Oligo dT-3sites Adaptor Primer(3’-Full RACE CoreSet，TaKaRa Bio)，以細菌感染后真鯛肝臟總RNA為模板，進行3`race及PCR擴增出約500bp大小的cDNA條帶，測序得到肝hepcidin序列為530bp 3`端cDNA片段，包含起始密碼子在內的完整的hepcidin編碼區(qū)及3’UTR。將5’race和3’race的測序結果經過序列拼接和堿基校對，最終得到601bp的真鯛全長hepcidin cDNA。
本發(fā)明以攻毒真鯛肝臟總RNA為模板，參考雜交斑紋鱸魚hepcidin的基因序列，通過優(yōu)化選擇設計的特異性引物，利用RT-PCR、5`race和3`race等分子生物學技術手段，成功地克隆到海水養(yǎng)殖真鯛hapcidin cDNA全長序列，該基因屬于hepcidin基因家族的新組員。該基因其前體序列與Shike H等發(fā)表的雜交斑紋鱸魚的hepcidin基因序列同源性高于85％，且推導的氨基酸序列在C末端成熟肽同一位置上都富含八個半胱氨酸的保守序列，兩者預測的氨基酸序列信號肽切點、結構域切點都一致，分別在“SSA”、“RHKR”序列處。但從推導的氨基酸序列(如下Hepc為海水養(yǎng)殖真鯛，Bass為雜交斑紋鱸魚)
HepcMKTFSVAVAVAVVLTFICLQESSAASVTEVQELEEPMSNGSPVAAHEEMPEESWKMPYNN 60BassMKTFSVAVAVAVVLAFICLQESSAVPVTEVQELEEPMSNEYQEMPVE-----SWKMPYNN 55Hepc61 RHKRSPAG--CRFCCGCCPNMIGCGVCCRF 88Bass56 RHKRHSSPGGCRFCCNCCPNMSGCGVCCRF 85與國外報道的雜交斑紋鱸魚氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明克隆的真鯛前體蛋白序列含有88個氨基酸，雜交斑紋鱸魚85個氨基酸，兩者氨基酸差異主要表現(xiàn)在成熟肽序列，共有8個氨基酸差異；與其它種類的抗菌肽相比，Hepc序列區(qū)別于以前發(fā)現(xiàn)的所有其他種類抗菌肽，具有獨特的結構，該抗菌肽不僅具有抗真菌和革蘭氏陽性、陰性菌的活性，而且還是一種與鐵代謝密切相關的重要的鐵調節(jié)激素，可與畢赤酵母等構建真核表達載體建立高效表達hepcidin的基因工程菌株，體外大量生產真鯛hepcidin抗菌肽，作為飼料免疫添加劑可替代傳統(tǒng)飼料中的某些抗生素，用于海水養(yǎng)殖業(yè)，實現(xiàn)綠色養(yǎng)殖，減少乃至消除抗生素在水產品中的蓄積，提高水產品質量；也可以作為某些耐藥性抗生素的有效替代品，用于水產養(yǎng)殖業(yè)中耐藥性細菌的防治藥物。另外，該基因還可以用于轉基因魚的育種研究。


圖1為提取攻毒真鯛的肝總RNA電泳圖。
圖2為RT-PCR電泳圖。
圖3為5`race電泳圖。
圖4為3`race電泳圖。
具體實施例方式
實施例1.攻毒真鯛肝RNA的提取真鯛肝組織總RNA的提取取50mg的真鯛肝組織分別放入研缽，加液氮研磨成粉，轉至1.5mL無核酸酶(DEPC處理)的eppendorf管中，加入1mLTrizol，充分混勻，室溫靜置5min；4℃12000g離心10min，棄去不溶團塊；加入0.2mL氯仿，震蕩混勻，室溫靜止2min；4℃12000g離心15min，取上層水相于新的eppendorf管中；加入0.5mL異丙醇，混勻后室溫靜置10min；4℃12000g離心10min，棄上清；加入1mL 75％乙醇洗滌沉淀，4℃7500g離心10min；棄清液，室溫干燥10min；用無核酸酶水(DEPC處理水)溶解沉淀即得總RNA提取液。測OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm，于1％瓊脂糖凝膠電泳上分析(見圖1)。
2.RT-PCR擴增目的片段hepc2.1 cDNA第一鏈合成RT-PCR參考雜交斑紋鱸魚hepcidin的基因序列(Shike H，et al.，Eur.J.Biochem.，2002，2692232-2237)，通過優(yōu)化選擇設計合成特異引物S1(上游引物起始密碼子ATG前段序列24個bp(含ATG)+2個修飾堿基CG)CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGA TG，A1(下游引物終止密碼子TGA前段序列25個bp)GAA CCT GCA GCA GAC ACC ACA TCC G，取總RNA 1～3μg，加入下游引物A1 10pmol，加DEPC水至10μL，70℃孵育5min，立即置于冰上5min；加入下列試劑5×AMV buffer5.0μL，_，10mM each dNTPs 1μL，RNasin(40U/μL)0.5μL，AMV反轉錄酶(10U/μL)3.0μL，加DEPC處理水至總反應體積為25μL；42℃孵育60min反轉錄；95℃孵育5min，滅活AMV反轉錄酶，置于冰上。
2.2 PCR反應取2.1反應的1μL RT-PCR反應液作為模板，分別加入10×Mg2+free buffer2.5μL、MgCl2(25mM)2.0μL、10mM each dNTPs 0.25μL、上下游引物(S1、A1)各10pmol、Taq DNA聚合酶0.7U，用無核酸酶水補齊至總體積25μL。94℃預變性2min；94℃變性30sec，60℃復性30sec，72℃延伸60sec，30個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5min結束反應。得到約300bp特異擴增cDNA條帶(見圖2)，經測序得到287bp的基因片段hepc；在NCBI網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)通過Blast分析證實得到的287bp基因hepc可連續(xù)編碼，與雜交斑紋鱸魚的抗菌肽hepcidin同源性高于85％，并且該基因推導的氨基酸序列C末端也富含hepcidin基因家族特有的八個半胱氨酸的保守序列；為獲得該基因全長cDNA序列，進行3’、5’race。
3.5′RACE3.1反轉錄反應根據(jù)獲得的hepc片段設計合成特異引物A2(密碼子ATG下游105bp-82bp)作為下游引物TGG CTC CTC CAG CTC TTG CAC CTC，利用5’-CDS引物((Clontech.))5′-(T25)N-1N-3′，N＝A、C、G或T；N-1＝A、G或C和SMART II A oligo(SMART RACE cDNA AmplificationKit，Clontech.)(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG做為上游引物，取總RNA～1μg，1.0μL5′-CDS引物和1.0μL SMART II A oligo，加DEPC處理水至終體積25μL，70℃孵育2min，立即置于冰上；再依次加入下列試劑5×First-StrandBuffer2.0μL、DTT(20mM)1.0μL、dNTP(10mM)1.0μL、PowerScript ReverseTranscriptasel.0μL至總體積10μL。42℃孵育1.5hr進行反轉錄反應，再加入Tricine-EDTA Buffer 20μL稀釋第一鏈反應產物，72℃孵育7min滅活酶，5℃，5min，冰上放置。
3.2 PCR反應利用UPM(Clontech.)(5′)CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAA CGC AGA GT和A2進PCR。取3.1反應產物2.5μL第一鏈反應產物作為模板，加入10×Advantage PCR 5.0μL、dNTP(10mM)1.0μL、50×Advantage Polymerase mix 1.0μL、UMP(2.0μM)1.0μL、A2 10pmol，用無核酸酶水補齊至50μL。94℃預變性3min；94℃變性30sec，72℃2min，5個循環(huán)；94℃30s，70℃30s，72℃2min，5個循環(huán)；94℃30s，68℃30s，72℃2min，25個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5min。擴增得到大約200bp cDNA條帶(見圖3)，測序得202bp的hepc5`端cDNA片段。
4.3′-RACE4.1反轉錄反應取總RNA 1～3μg，加入0.2mL的離心管中，70℃溫育10min，立即置于冰上。在上管中加入10×RNA PCR Buffer2.0μL、MgCl2(25mM)4.0μL、dNTPs(10mM)2.0μL、RNasin(40U/μL)0.5μL、Oligo dT-3sites Adaptor Primer(2.5μM)1.5μL、AMV反轉錄酶(10U/μL)1.0μL，用無核酸酶的水補齊至總體積為20μL。30℃退火10min；42℃延伸50min；95℃，5min滅活酶；5℃，5min，冰上放置。
4.2 PCR反應取上步反應產物1μL第一鏈反應液作為模板，分別加入10×Mg2+free buffer2.5μL、MgCl2(25mmol/L)2μL，10mM each dNTPs 0.25μL，3sites Adaptor Primer 5pmol、S1(CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGA TG)5pmol，Taq DNA聚合酶(1.0U/μL)0.7U，用無核酸酶的水補齊至25μL。94℃預變性2min；94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5min。擴增得到500bp左右的cDNA條帶(見圖4)；測序得到肝hepcidin序列為530bp 3`端cDNA片段。
5.序列分析與基因確定擴增獲得的cDNA產物由上海博亞生物技術有限公司進行DNA核苷酸序列測定。序列同源性比對和相似性搜索用NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)BLAST在線軟件進行；多序列比較用DNAssist2.0軟件；以BLAST2軟件輔助進行序列拼接；信號肽預測用SIGNALP在線查找(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。
權利要求
1.海水養(yǎng)殖真鯛的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所說的海水養(yǎng)殖真鯛hepcidin抗菌肽基因cDNA共有586nt(不包括poly(A))，其中含有5’端非編碼區(qū)長94nt(5’UTR)，1個閱讀框長264nt，3’非編碼翻譯區(qū)長243nt(3’UTR)，其GenBank系列號為AY557619，全長cDNA序列如下10 20 30 40 50 60aaccatcaga caggagaaga agtgaaagga gctgacgaga gtcaccaaaa gaatcaaagg70 80 90100110120actgaacaag ttaaagcagt caaagcctcc taagatgaag acattcagtg ttgcagttgc130140150 160170180agtggccgtc gtgctcacct ttatttgcct tcaggagagc tctgctgcct cagttactga190200210220230240ggtgcaagag ctggaggagc caatgagcaa tggcagtcca gttgctgcac atgaagagat250260270280290300gccagaggag tcctggaaga tgccgtataa caacagacac aagcgcagcc ctgctggctg310320330340350360tcgcttttgc tgcggttgct gtcctaacat gattggatgt ggtgtctgct 370380390400410 420 ctgcagcctg ggatttacac aacaaccact aaatatatct ttgtcaagat430 440450460470480ttttacttta aaagcagttt tacgtctttc agttgtggct gttaatatct gaggatgttt490500510520530540ttgaatttgg taatgctgca gagaatgtgt gctcactgat gtgactgtat catctacaca550560570580590600cactactaca gtgtattgtc acaataaact ttaggtttac tcatgcaaaa aaaaaaaaaa601a
2.如權利要求1所述的海水養(yǎng)殖真鯛的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所說的海水養(yǎng)殖真鯛的hepcidin抗菌肽cDNA預測編碼蛋白氨基酸序列如下10 20 30 40 50 60MKTFSVAVAV AVVLTFICLQ ESSAASVTEV QELEEPMSNG SPVAAHEEMP EESWKMPYNN70 80 88RHKRSPAGCR FCCGCCPNMI GCGVCCRF*
3.如權利要求1所述的海水養(yǎng)殖真鯛的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所說的海水養(yǎng)殖真鯛的hepcidin抗菌cDNA讀碼框及預測蛋白氨基酸序列如下1 A ACC ATC AGA CAG GAG AAG AAG TGA AAG GAG CTG ACG AGA GTC ACC AAA AGA ATC AAA 5859 GGA CTG AAC AAG TTA AAG CAG TCA AAG CCT CCT AAGATGAAG ACA TTC AGT GTT GCA GTT 1181 Met Lys Thr Phe Ser Val Ala Val 8119 GCA GTG GCC GTC GTG CTC ACC TTT ATT TGC CTT CAG GAG AGC TCT GCT GCC TCA GTT ACT1789 Ala Val Ala Val Val Leu Thr Phe Ile Cys Leu Gln Glu Ser Ser Ala Ala Ser Val Thr 28179 GAG GTG CAA GAG CTG GAG GAG CCA ATG AGC AAT GGC AGT CCA GTT GCT GCA CAT GAA GAG23829 Glu Val Gln Glu Leu Glu Glu Pro Met Ser Asn Gly Ser Pro Val Ala Ala His Glu Glu 48239 ATG CCA GAG GAG TCC TGG AAG ATG CCG TAT AAC AAC AGA CAC AAG CGC AGC CCT GCT GGC29849 Met Pro Glu Glu Ser Trp Lys Met Pro Tyr Asn Asn Arg His Lys Arg Ser Pro Ala Gly 68299 TGT CGC TTT TGC TGC GGT TGC TGT CCT AAC ATG ATT GGA TGT GGT GTC TGC TGC AGG TTC35869 Cys Arg Phe Cys Cys Gly Cys Cys Pro Asn Met Ile Gly Cys Gly Val Cys Cys Arg Phe 88359 TGA TTC CTG CTG CAG CCT GGG ATT TAC ACA ACA ACC ACT AAA TAT ATC TTT GTC AAG41889 *** 89419 ATT TTT ACT TTA AAA GCA GTT TTA CGT CTT TCA GTT GTG GCT GTT AAT ATC TGA GGA TGT478479 TTT TGA ATT TGG TAA TGC TGC AGA GAA TGT GTG CTC ACT GAT GTG ACT GTA TCA TCT ACA538539 CAC ACT ACT ACA GTG TAT TGT CACAAT AAACTT TAG GTT TAC TCA TGC AAA AAA AAA AAA 598599 AAA
4.如權利要求1所述的海水養(yǎng)殖真鯛的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所說的特異上游引物S1為起始密碼子ATG前段序列24個bp(含ATG)+2個修飾堿基CG。
5.如權利要求1所述的海水養(yǎng)殖真鯛的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所說的特異下游引物A1為終止密碼子TGA前段序列25個bp。
6.如權利要求1所述的海水養(yǎng)殖真鯛的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所說的特異引物A2為密碼子ATG下游105bp-82bp。
7.海水養(yǎng)殖真鯛的hepcidin抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于其步驟為1)通過優(yōu)化選擇設計合成特異引物S1(上游引物)CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGATG，A1(下游引物)GAA CCT GCA GCA GAC ACC ACA TCC G，以細菌感染后海水養(yǎng)殖真鯛肝臟總RNA為模板進行RT-PCR擴增，得到287bp的特異擴增cDNA條帶hepc；2)根據(jù)獲得的hepc片段設計合成特異引物A2作為下游引物TGG CTC CTC CAG CTC TTGCAC CTC，利用5′-CDS引物(Clontech.)5′-(T25)N-1N-3′，N＝A、C、G或T；N-1＝A、G或C和SMART II A oligo(SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit，Clontech.)(5′)AAG CAGTGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG做為上游引物，以細菌感染后真鯛肝臟總RNA為模板，進行5`race；從真鯛肝組織中擴增出一條包含5’UTR和一部分編碼區(qū)在內的202bp的hepc5`端cDNA片段；3)利用特異性上游引物S1和Oligo dT-3sites Adaptor Primer(3’-Full RACE CoreSet，TaKaRa Bio)，以細菌感染后真鯛肝臟總RNA為模板，進行3`race及PCR擴增出530bp 3`端cDNA片段，包含起始密碼子在內的完整的hepcidin編碼區(qū)及3’UTR，將5’race和3’race的測序結果經過序列拼接和堿基校對，最終得到601bp的真鯛全長hepcidin cDNA。
全文摘要
海水養(yǎng)殖真鯛的hepcidin抗菌肽基因，涉及一種從海水養(yǎng)殖真鯛中克隆的hepcidin抗菌肽基因。以攻毒真鯛肝臟總RNA為模板，參考雜交斑紋鱸魚hepcidin的基因序列，設計合成特異引物，利用RT－PCR、5`race和3`race等手段，屬hepcidin基因家族新組員。具有抗真菌和革蘭氏陽性、陰性菌的活性，是一種與鐵代謝密切相關的鐵調節(jié)激素，可與畢赤酵母等構建真核表達載體建立高效表達hepcidin的基因工程菌株，體外大量生產真鯛hepcidin抗菌肽，作為飼料免疫添加劑，減少乃至消除抗生素在水產品中的蓄積，提高水產品質量；作為某些耐藥性抗生素的有效替代品，用于水產養(yǎng)殖業(yè)中耐藥性細菌的防治藥物及轉基因魚的育種研究。
文檔編號C12N15/12GK1624127SQ20041009029
公開日2005年6月8日 申請日期2004年11月3日 優(yōu)先權日2004年11月3日
發(fā)明者王克堅, 楊明, 周紅玲 申請人:廈門大學