專利名稱：：用于檢測副溶血弧菌的耐熱性溶血素基因的檢測試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于在臨床檢驗(yàn)、公共衛(wèi)生、食品檢查和食物中毒檢驗(yàn)中檢測副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的檢測試劑。
背景技術(shù)：
：副溶血弧菌通常被認(rèn)為是一種導(dǎo)致感染性食物中毒的致病微生物。從腸胃炎患者中分離的副溶血弧菌之95％或甚至更多為在Wagatsuma培養(yǎng)基上表現(xiàn)溶血活性的神奈川現(xiàn)象陽性菌株，與之不同，從魚類和水中分離的菌株99％都是神奈川現(xiàn)象陰性。因此，人們認(rèn)為在致病副溶血弧菌和神奈川現(xiàn)象之間存在密切聯(lián)系。隨后，這種神奈川現(xiàn)象的出現(xiàn)被確定為是由于副溶血弧菌向細(xì)菌細(xì)胞外釋放耐熱性溶血素(thermostabledirecthemolysin，TDH)所引起的，這導(dǎo)致對副溶血弧菌作為致病因子的關(guān)注的提升。目前TDH基因已知存在TDH1至TDH5五種類型。更近來，從一種盡管是神奈川現(xiàn)象陰性但顯示致病性的微生物株系中，鑒定出一種具有相似于TDH的堿基序列且具有部分共同抗原性的溶血素(TDH-相關(guān)溶血素[TRH])。目前該TRH基因已知存在TRH1和TRH2兩種類型。盡管涉及在擴(kuò)增培養(yǎng)或分離培養(yǎng)之后評價神奈川現(xiàn)象以檢測和鑒定副溶血弧菌的方法是已知的，但就檢測的靈敏度、快捷性和簡便性而言，優(yōu)選對副溶血弧菌基因或來自所述基因的RNA中存在的特定序列進(jìn)行擴(kuò)增后檢測該序列的方法。在檢測系統(tǒng)的自動化方面特別優(yōu)選恒溫下擴(kuò)增靶核酸的方法。已經(jīng)報(bào)道了一種檢測和鑒定副溶血弧菌的方法，其中在比較低的溫度(41℃)下特異性擴(kuò)增來自TDH基因的RNA(日本未審專利公開2001-258570和2001-340086)。在此方法中使用RNA擴(kuò)增法，其中以來自所述TDH基因的特定RNA序列為模板，通過RNA依賴型DNA聚合酶，使用具有與所述特定序列互補(bǔ)的序列的第一引物和具有與所述特定序列同源的序列的第二引物制備cDNA而形成雙鏈RNA-DNA，其中第一引物或第二引物在5’末端被添加了一段RNA聚合酶的啟動子序列，通過核糖核酸酶H降解雙鏈RNA-DNA中的RNA，從而獲得單鏈DNA，以所述的單鏈DNA作為模板，通過DNA依賴型DNA聚合酶合成具有啟動子序列的雙鏈DNA，其能轉(zhuǎn)錄成由前述RNA序列或該RNA序列的互補(bǔ)序列組成的RNA，其中所述的雙鏈DNA在RNA聚合酶存在下生成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所述的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板用于隨后的通過RNA依賴型DNA聚合酶的cDNA合成中。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，此RNA擴(kuò)增法在標(biāo)記有嵌入熒光染料的寡核苷酸的存在下進(jìn)行，并且通過測定反應(yīng)溶液的熒光強(qiáng)度來進(jìn)行檢測；其中，所述寡核苷酸的序列至少互補(bǔ)于RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的部分序列，并且在所述寡核苷酸與所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物發(fā)生互補(bǔ)結(jié)合的情況下，與沒有生成復(fù)合物的情況比較，反應(yīng)溶液的熒光性質(zhì)發(fā)生改變。然而，前述方法在靈敏度和速度方面存在問題。日本未審專利公開.2001-340086記載了，在起始RNA量為103拷貝時檢測TDHRNA，熒光強(qiáng)度比率隨時間的增長速度顯著慢于起始量為104拷貝時的情形。結(jié)果，即使用30分鐘的反應(yīng)時間，熒光強(qiáng)度比率至多為2.0。另外，甚至當(dāng)起始RNA量為0拷貝時，熒光強(qiáng)度比率也趨向增長，結(jié)果，即使用30分鐘的反應(yīng)時間，在102拷貝的起始RNA量下檢測TDHRNA時，也不能觀測到熒光強(qiáng)度比率的顯著增長。因此，本發(fā)明的目的是提供一種更靈敏和快捷的檢測TDHRNA的試劑。
發(fā)明內(nèi)容為了開發(fā)一種用于檢測副溶血弧菌耐熱性溶血素(TDH)的更靈敏和更快捷的檢測試劑，經(jīng)過深入研究，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了一種即使在20分鐘內(nèi)、102拷貝的起始RNA量下也能檢測TDH的試劑。本發(fā)明涉及一種用于檢測存在于樣品中的副溶血弧菌TDH基因的檢測試劑，其被用于使用包括以下步驟的RNA擴(kuò)增程序的檢測方法中使用來自所述TDH基因的RNA的一段特定序列，即，所述RNA的至少部分序列，作為模板，通過RNA依賴型的DNA聚合酶，應(yīng)用具有與所述特定序列互補(bǔ)的序列的第一引物和具有與所述特定序列同源的序列的第二引物，生成cDNA，從而形成雙鏈RNA-DNA，其中第一引物或第二引物的序列在其5’末端被添加了RNA聚合酶的啟動子序列；通過核糖核酸酶H降解雙鏈RNA-DNA中的RNA部分，從而產(chǎn)生單鏈DNA；和以所述的單鏈DNA作為模板，通過DNA依賴型的DNA聚合酶，合成具有所述啟動子序列的雙鏈DNA，該DNA能轉(zhuǎn)錄成由所述RNA特定序列或互補(bǔ)于所述的RNA特定序列的序列組成的RNA；其中，雙鏈DNA在RNA聚合酶存在下合成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所述的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板用于隨后的通過RNA依賴型DNA聚合酶的cDNA合成中；所述的試劑包括，第一引物，其為由SEQ.IDNo.2所示序列中至少10個連續(xù)堿基組成的寡核苷酸，或者在由SEQ.IDNo.2所示序列中至少10個連續(xù)堿基組成的寡核苷酸中缺失、替換或添加一個或多個核苷酸后能特異性結(jié)合到所述特定序列的寡核苷酸，或者在高嚴(yán)格條件下可以與由SEQ.IDNo.2所示序列中至少10個連續(xù)堿基組成的寡核苷酸雜交的、能特異性結(jié)合到所述特定序列的寡核苷酸；和第二引物，其為由SEQ.IDNo.1所示序列中至少10個連續(xù)堿基組成的寡核苷酸，或者在由SEQ.IDNo.1所示序列的至少10個連續(xù)堿基組成的寡核苷酸中缺失、替換或添加一個或多個核苷酸后能特異性結(jié)合所述特定序列之互補(bǔ)序列的寡核苷酸，或者在高嚴(yán)格條件下可以與由SEQ.IDNo.1所示序列中至少10個連續(xù)堿基組成的寡核苷酸雜交的、能特異地結(jié)合到所述特定序列之互補(bǔ)序列上的寡核苷酸。高嚴(yán)格條件指諸如在以下實(shí)施例中給出的在44℃溫度，60mMTris、17mM氯化鎂、110mM氯化鉀和1mMDTT存在下進(jìn)行雜交的雜交條件。優(yōu)選的，上述的第一引物可以是由SEQ.IDNo.2所示的序列組成的寡核苷酸，上述的第二引物可以是由SEQ.IDNo.1所示的序列組成的寡核苷酸。此外，在打算檢測與TDH基因來源的RNA互補(bǔ)的RNA時，具有自5’末端到3’末端序列倒轉(zhuǎn)時與上述的第一引物互補(bǔ)的序列的寡核苷酸被用作第一引物，具有自5’末端到3’末端序列倒轉(zhuǎn)時與上述的第二引物互補(bǔ)的序列的寡核苷酸被用作第二引物。優(yōu)選的，上述RNA擴(kuò)增程序在一段剪切寡核苷酸存在下進(jìn)行，該寡核苷酸可在上述特定序列的5’末端剪切上述靶RNA，并且具有互補(bǔ)于與所述特定序列的5’末端相鄰和重疊的區(qū)域的序列。所述的寡核苷酸優(yōu)選為由SEQ.IDNo.4，5或6所示的序列組成的寡核苷酸。更優(yōu)選的，上述的RNA擴(kuò)增程序在一段標(biāo)記有嵌入熒光染料的寡核苷酸的存在下進(jìn)行，而副溶血弧菌耐熱性溶血素的檢測通過測量反應(yīng)溶液的熒光強(qiáng)度來進(jìn)行。這里，所述寡核苷酸的序列與mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的至少部分序列互補(bǔ)，在所述寡核苷酸與所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物發(fā)生互補(bǔ)結(jié)合的情況下，與沒有復(fù)合物形成時比較，反應(yīng)溶液的熒光性質(zhì)發(fā)生改變。優(yōu)選的，上述的寡核苷酸由SEQ.IDNo.3所示序列中的至少10個連續(xù)堿基組成。以下提供本發(fā)明的詳細(xì)說明。附圖簡述圖1顯示在實(shí)施例1中用到的每個寡核苷酸沿著擴(kuò)增區(qū)域所在的位置。圖中堿基編號根據(jù)文獻(xiàn)(Appl.Environ.Microbiol.，58，2449-2457(1992))給出。圖2(A)顯示實(shí)施例2中從30拷貝/檢測到105拷貝/檢測的起始TDHRNA量生成的RNA產(chǎn)量，其中熒光強(qiáng)度比率隨著反應(yīng)時間增強(qiáng)，(B)顯示由初始RNA量的對數(shù)值和上升時間而獲得的校準(zhǔn)曲線?！瓣幮詫φ铡敝傅氖鞘褂孟♂寗┐鍾NA的樣品。在大約20分鐘反應(yīng)時間后，可以檢測到起始RNA量為102拷貝/檢測時的TDHRNA，并且也觀測到起始RNA量和上升時間之間的相關(guān)性。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳方式以下提供了本發(fā)明的詳細(xì)說明。在本發(fā)明中，盡管序列表中列出的全長堿基序列能被用作第一和第二引物，但是由于大約10個堿基就足以特異性結(jié)合到特定核酸序列或其類似物上，因此也可以使用每個序列中的至少10個連續(xù)堿基的組合。本發(fā)明的擴(kuò)增程序包括NASBA方法，3SR方法或，例如，在日本未審專利公開2000-014400中記載的RNA檢測方法(TRC方法)，其通過反轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶的協(xié)同作用(通過在反轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶可以協(xié)同作用的條件下使它們反應(yīng))來擴(kuò)增TDHRNA。這里，盡管對溫度沒有特別限定，但優(yōu)選35至50℃。在本申請上述發(fā)明的一個方面中，必須在所述特定序列的5’端剪切靶RNA。以這種方式剪切靶RNA的一種優(yōu)選方法優(yōu)選由如下步驟組成通過添加具有與特定序列5’末端相鄰和重疊的區(qū)域互補(bǔ)的序列的寡核苷酸(剪切寡核苷酸)，用核糖核酸酶H或類似物剪切靶RNA。所述寡核苷酸優(yōu)選是由SEQ.IDNo.4，5或6所示的序列組成的寡核苷酸。為了抑制3’末端的延伸反應(yīng)，在所述剪切寡核苷酸中，3’末端羥基基團(tuán)優(yōu)選被化學(xué)修飾，例如，被胺化。盡管可以利用已知的核酸檢測方法檢測上述核酸擴(kuò)增方法中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，但在這個方法的一個優(yōu)選方面，上述核酸擴(kuò)增優(yōu)選在標(biāo)記有嵌入熒光染料的寡核苷酸存在下進(jìn)行，并隨后測量反應(yīng)溶液的熒光性質(zhì)的改變。在所述寡核苷酸中，嵌入熒光染料通過接頭結(jié)合到該寡核苷酸的磷原子上，因此與靶核酸(互補(bǔ)核酸)形成雙鏈的嵌合劑部分嵌入雙鏈部分中，導(dǎo)致了熒光性質(zhì)的變化，從而導(dǎo)致了本方法不需要分離來進(jìn)行分析的特征(Ishiguro，T.etal.(1996)NucleicAcidRes.24(24)4992-4997)。被所述寡核苷酸結(jié)合的序列可以是對于TDHRNA而言特異的任一序列，并且盡管對此沒有具體限定，但優(yōu)選由SEQ.IDNo.3所示的序列中至少10個連續(xù)堿基組成的序列或其互補(bǔ)序列。另外，所述寡核苷酸3’末端的羥基基團(tuán)優(yōu)選被化學(xué)修飾(例如通過添加羥基乙酸)，從而抑制因使用這段寡核苷酸作為引物而可能出現(xiàn)的延伸反應(yīng)。這樣，在恒溫下利用單個步驟，在單管中能快速和高靈敏地?cái)U(kuò)增和檢測副溶血弧菌的TDHRNA，從而有助于自動化應(yīng)用。盡管以下通過實(shí)施例對本申請的發(fā)明提供了更詳細(xì)的解釋，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1比較表1所示(a)至(i)組合在副溶血弧菌的TDHRNA的擴(kuò)增效率方面的差異。(1)一份含有副溶血弧菌TDH2RNA的第1至610位堿基(RNA的堿基編號參照Nishibuchi，等，ApplEnviron.Microbiol.，58，2449-2457(1992))的標(biāo)準(zhǔn)RNA樣品(616個堿基)，通過在260nm下紫外吸收來定量，然后用RNA稀釋劑(10mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)，1mMEDTA，5mMDTT，0.5U/μlRNase抑制劑(TakaraBio))稀釋到103拷貝/5μl和104拷貝/5μl。對照組(陰性對照)僅用到了稀釋劑。(2)具有以下組成的20μl反應(yīng)溶液被分裝到0.5mlPCR管中(GeneAmp薄壁反應(yīng)管，AppliedBiosystem)，之后在管中加入5μl上述的RNA樣品。此外，預(yù)備溶液以將第一引物、第二引物和剪切寡核苷酸按照表1所示方式組合。反應(yīng)溶液的組成(所示的濃度是在30μl終反應(yīng)溶液體積中的濃度)60mMTris-HCl緩沖液(pH8.6)17mM氯化鎂110mM氯化鉀6URNase抑制劑1mMDTTdATP，dCTP，dGTP和dTTP各0.25mM3.6mMITPATP，CTP，GTP和UTP各3.0mM0.16μM剪切寡核苷酸1.0μM第二引物1.0μM第一引物15nM標(biāo)記有嵌入染料的寡核苷酸(YO-TDH2-S-G，SEQID.No.3；在距5’末端第16位的“G”和第17位的“A”之間標(biāo)記有嵌入熒光染料，其3’末端的羥基基團(tuán)被乙二醇基團(tuán)修飾)13％DMSO用于調(diào)整體積的蒸餾水(3)上述反應(yīng)溶液在44℃溫育5分鐘后，加入5μl具有下示組成并在44℃預(yù)熱2分鐘的酶溶液。酶溶液組成(顯示的值表示30μl終反應(yīng)溶液體積中的值)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142UT7RNA聚合酶(Invitrogen)6.4UAMV反轉(zhuǎn)錄酶(TakaraBio)用于調(diào)整體積的蒸餾水(4)隨后，在44℃下溫育時，用配有溫度控制功能并能直接測量試管的熒光分光光度計(jì)，在470nm的激發(fā)波長和520nm的熒光波長下，隨著時間的變化測量每個PCR管中的反應(yīng)溶液。(5)表2顯示每一個寡核苷酸組合得到的“上升時間”結(jié)果(熒光比率增長到陰性對照樣品的平均值再加上3個標(biāo)準(zhǔn)差之和的1.2倍時所需的時間)。由于不管使用(a)到(i)中任一組合，都在30分鐘內(nèi)檢測出TDH2RNA，表明這些組合中用到的寡核苷酸對于檢測副溶血弧菌的TDHRNA是有效的。表1表1顯示實(shí)驗(yàn)體系中用到的第一引物、第二引物和剪切寡核苷酸的組合，以及使用這些組合擴(kuò)增的特異性條帶的長度。對于每一寡核苷酸組合，圖1顯示了寡核苷酸在副溶血弧菌的TDHRNA中的定位和擴(kuò)增區(qū)域。在剪切寡核苷酸堿基序列的3’末端，羥基基團(tuán)被胺化。第二引物堿基序列中距5’末端的第1位的“A”到第22位的“A”的區(qū)域是T7啟動子區(qū)域，隨后的從第23位的“G”到第28位的“A”的區(qū)域是增強(qiáng)子序列。剪切寡核苷酸TD-S22(SEQ.IDNo.4，堿基編號253至274)TD-S26(SEQ.IDNo.5，堿基編號249至274)TD-S30(SEQ.IDNo.6，堿基編號245至274)第二引物TD-F23(SEQ.IDNo.7，堿基編號270至292)TD-F26(SEQ.IDNo.8，堿基編號270至295)TD-F29(SEQ.IDNo.9，堿基編號270至298)第一引物TD-R20(SEQ.IDNo.10，堿基編號446至465)TD-R24(SEQ.IDNo.11，堿基編號446至469)TD-R27(SEQ.IDNo.2，堿基編號446至472)表2表2顯示用表1所示的寡核苷酸組合，以103和104拷貝/檢測來測定TDH2RNA所得到的結(jié)果。所有在表1中所示的寡核苷酸組合都在30分鐘內(nèi)檢測到TDH2RNA。實(shí)施例2使用表1中所示的組合(a)檢測不同起始拷貝數(shù)的副溶血弧菌TDH2DNA。(1)類似于實(shí)施例1中的副溶血弧菌TDH2RNA使用RNA稀釋劑(10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA，5mMDTT，0.5U/μlRNase抑制劑(TakaraBio))稀釋到105拷貝/5μl至30拷貝/5μl。對照組(陰性對照)僅用了稀釋劑。(2)具有以下組成的20μl反應(yīng)溶液被分裝到PCR管中(體積0.5mL，GeneAmp薄壁反應(yīng)管，AppliedBiosystem)，之后添加5μl上述RNA樣品。反應(yīng)溶液組成(所示濃度是在30μl終反應(yīng)溶液體積中的濃度)60mMTris-HCl緩沖液(pH8.6)17mM氯化鎂110mM氯化鉀6URNase抑制劑1mMDTTdATP，dCTP，dGTP和dTTP各0.25mM3.6mMITPATP，CTP，GTP和UTP各3.0mM0.16μM剪切寡核苷酸(TD-S22，SEQ.IDNo.4，其3’末端的羥基基團(tuán)被胺化)1.0μM第二引物(TD-F23，SEQ.IDNo.7)1.0μM第一引物(TD-R20，SEQ.IDNo.10)15nM標(biāo)記有嵌入染料的寡核苷酸(YO-TDH2-S-G，SEQID.No.3；在距5’末端的第16位的“G”和第17位的“A”之間標(biāo)記有嵌入熒光染料，其3’末端的羥基基團(tuán)被乙二醇基團(tuán)所修飾)13％DMSO用于調(diào)整體積的蒸餾水(3)上述反應(yīng)溶液在44℃溫育5分鐘后，加入5μl具有下示組成并在44℃預(yù)熱2分鐘的酶溶液。酶溶液組成(顯示的值表示針對30μl最終反應(yīng)溶液體積的值)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142UT7RNA聚合酶(Invitrogen)6.4UAMV反轉(zhuǎn)錄酶(TakaraBio)用于調(diào)整體積的蒸餾水(4)隨后，當(dāng)在44℃下溫育時，用配有溫度控制功能并能直接測量試管的熒光分光光度計(jì)，在470nm的激發(fā)波長和520nm的熒光波長下，隨著時間變化測量每個PCR管中的反應(yīng)溶液。圖2(A)顯示將加入酶的時間設(shè)定為0分鐘時，樣品的熒光強(qiáng)度比率(預(yù)定時間的熒光強(qiáng)度值÷背景熒光強(qiáng)度值)隨時間的變化。另外，圖2(B)顯示就起始RNA量的對數(shù)值和“上升時間”(熒光比率增長到陰性對照樣品的平均值再加上3個標(biāo)準(zhǔn)差之和的1.2倍時所需的時間)之間的關(guān)系而得到的結(jié)果。此外，起始RNA量的范圍是從30拷貝/檢測到105拷貝/檢測。根據(jù)圖2，在約20分鐘內(nèi)檢測到102拷貝。另外，根據(jù)起始靶RNA量得到的熒光分布圖和校正曲線，表明可以定量檢測未知樣品中的TDHRNA。此外，由于在約20分鐘內(nèi)，該組合可檢測到甚至102拷貝/檢測的起始量TDH2，故與現(xiàn)有技術(shù)中的方法(日本未審專利公開2001-340086)相比，可以更快地和更靈敏地進(jìn)行TDH的檢測。工業(yè)實(shí)用性按照上述的解釋，本發(fā)明的檢測方法有助于快速和高靈敏地檢測副溶血弧菌TDHRNA。本發(fā)明的寡核苷酸不局限于序列表中列出的(具有20至30個堿基)序列，而是可以為由這些序列中至少10個連續(xù)堿基構(gòu)成的序列。這是因?yàn)槊黠@地，在相對較低的溫度(優(yōu)選44℃)條件下，約10個堿基的堿基序列就足以確保引物或探針對靶核酸的特異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解盡管已經(jīng)結(jié)合具體的實(shí)施方案和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了如上描述，但本發(fā)明不必局限于此，許多其它的實(shí)施方式、實(shí)施例和用途，修飾以及由這些實(shí)施方式、實(shí)施例、用途擴(kuò)展的內(nèi)容可以在不背離本申請的發(fā)明范圍的情況下實(shí)現(xiàn)。序列表<110>東曹株式會社(TOSOHCorporation)<120>用于檢測副溶血弧菌的耐熱性溶血素基因的檢測試劑<130>1033907<160>11<170>PatentInversion3.1<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>TD-F29-T7<400>1ggtcaatcagtattcacaacgtcaggtac29<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>TD-R27<400>2atagaatcttcatcttcaccaacaaag27<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>YO-TDH2-S-G<400>3agctgtacttgatctgattt20<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>TD-S22<400>4tgaccataaacatctttgtacg22<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>TD-S26<400>5tgaccataaacatctttgtacggttt26<210>6<211>30<212>DNA<213>TD-S30<220><223><400>6tgaccataaacatctttgtacggttttctt30<210>7<211>51<212>DNA<213>TD-F23<220><223><400>7aattctaatacgactcactatagggagaggtcaatcagtattcacaacgtc51<210>8<211>54<212>DNA<213>TD-F26<220><223><400>8aattctaatacgactcactatagggagaggtcaatcagtattcacaacgtcagg54<210>9<211>57<212>DNA<213>TD-F29<220><223><400>9aattctaatacgactcactatagggagaggtcaatcagtattcacaacgtcaggtac57<210>10<211>20<212>DNA<213>TD-R20<220><223><400>10cttcatcttcaccaacaaag20<210>11<211>24<212>DNA<213>TD-R24<220><223><400>11gaatcttcatcttcaccaacaaag2權(quán)利要求1.一種用于檢測樣品中存在的副溶血弧菌耐熱性溶血素(TDH)基因的檢測試劑，該檢測試劑被用于使用RNA擴(kuò)增程序的檢測方法中，所述RNA擴(kuò)增程序包括以下步驟以一段來自所述TDH基因的RNA的特定序列作為模板，通過RNA依賴性DNA聚合酶，應(yīng)用具有與所述特定序列互補(bǔ)的序列的第一引物和具有與所述特定序列同源的序列的第二引物，生成cDNA，由此形成雙鏈RNA-DNA，其中第一引物或第二引物在其5’末端添加了RNA聚合酶的啟動子序列；通過核糖核酸酶H降解所述雙鏈RNA-DNA中的RNA部分，從而生成單鏈DNA；和以所述的單鏈DNA作為模板，通過DNA依賴性DNA聚合酶，產(chǎn)生具有所述啟動子序列的雙鏈DNA，其中所述雙鏈DNA能轉(zhuǎn)錄為由所述特定RNA序列或者所述特定RNA序列的互補(bǔ)序列組成的RNA；其中，該雙鏈DNA在RNA聚合酶的作用下生成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板用于隨后通過RNA依賴性DNA聚合酶合成cDNA；所述的試劑包括，第一引物，其是由SEQ.IDNo.2所示序列的至少10個連續(xù)堿基組成的寡核苷酸，或者是從SEQ.IDNo.2所示序列的至少10個連續(xù)堿基組成的寡核苷酸中缺失、替換或添加一個或多個核苷酸后能特異性結(jié)合到所述特定序列上的寡核苷酸；和第二引物，其是由SEQ.IDNo.1所示序列的至少10個連續(xù)堿基組成的寡核苷酸，或者是從SEQ.IDNo.1所示序列的至少10個連續(xù)堿基組成的寡核苷酸中缺失、替換或添加一個或多個核苷酸后能特異性結(jié)合到所述特定序列的互補(bǔ)序列上的寡核苷酸。2.權(quán)利要求1所述的檢測試劑，其中第一引物是由SEQ.IDNo.2所示的序列組成的寡核苷酸。3.權(quán)利要求1或2所述的檢測試劑，其中第二引物是由SEQ.IDNo.1所示的序列組成的寡核苷酸。4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的檢測試劑，其中RNA擴(kuò)增程序在剪切寡核苷酸存在下進(jìn)行，剪切寡核苷酸具有與所述特定序列的5’末端相鄰和重疊的區(qū)域互補(bǔ)的序列，并在所述特定序列的5’末端剪切所述靶RNA；其中所述的寡核苷酸是由SEQ.IDNo.4，5或6所示的序列組成的寡核苷酸。5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的檢測試劑，其中RNA擴(kuò)增程序在標(biāo)記有嵌入熒光染料的寡核苷酸存在下進(jìn)行，并且通過測定反應(yīng)溶液的熒光強(qiáng)度來檢測副溶血弧菌的耐熱性溶血素；其中，所述寡核苷酸的序列互補(bǔ)于mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的至少部分序列，并且在所述寡核苷酸與所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物發(fā)生互補(bǔ)結(jié)合的情況下，與沒有生成復(fù)合物的情況比較，反應(yīng)溶液的熒光性質(zhì)發(fā)生變化。6.權(quán)利要求5所述的檢測試劑，其中標(biāo)記有嵌入熒光染料的寡核苷酸由SEQ.IDNo.3所示序列的至少10個連續(xù)堿基組成。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測試劑，其用于在特異性擴(kuò)增TDHRNA的擴(kuò)增程序中檢測耐熱性溶血素(TDH)基因，該試劑包括具有與來自TDH基因中的RNA的特定序列互補(bǔ)的序列的第一引物，以及具有與所述特定序列同源的序列的第二引物。文檔編號C12N15/09GK1637153SQ20041009052公開日2005年7月13日申請日期2004年9月3日優(yōu)先權(quán)日2003年9月5日發(fā)明者益田升佳,堀江隆一,保川清申請人:東曹株式會社