專利名稱：一種具有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)作用的核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一段對(duì)蝦白斑桿狀病病毒基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及位于WSSV的膜蛋白基因VP28的5’非編碼區(qū)的一段核苷酸序列，該序列不編碼蛋白質(zhì)，但能引導(dǎo)mRNA直接進(jìn)入核糖體起始翻譯。本發(fā)明還提供包含該核酸序列的雙順反子載體和Bacmid DNA，以該Bacmid DNA轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，以及用所述Bacmid DNA介導(dǎo)的起始翻譯功能的方法。
背景技術(shù)：
基因的表達(dá)分為轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)相互獨(dú)立但又緊密聯(lián)系的階段。真核生物的mRNA前體轉(zhuǎn)錄完成后，要經(jīng)過5’端加帽的修飾過程，5’帽子結(jié)構(gòu)除了能保護(hù)mRNA免遭核酸酶和磷酸酶的攻擊外，在隨后的翻譯起始過程中核糖體小亞基通過識(shí)別5’端帽子結(jié)構(gòu)來尋找蛋白質(zhì)合成的起始位點(diǎn)，而后再與mRNA5’端結(jié)合并沿mRNA滑行至第一個(gè)AUG進(jìn)行翻譯(Proc Ncad SciUSA，2001，987029-7036)。在研究一些動(dòng)物病毒的翻譯過程中發(fā)現(xiàn)，除了正常的翻譯起始機(jī)制外，還存在一種不依賴5’帽子結(jié)構(gòu)的翻譯起始機(jī)制。另外，一些微小RNA病毒家族中的5’非翻譯區(qū)包含的順式作用元件本身無啟動(dòng)子活性，但其卻能引導(dǎo)mRNA直接進(jìn)入核糖體開始不依賴于帽子結(jié)構(gòu)的翻譯，這些就是由IRES介導(dǎo)的翻譯起始(Nat Biotechnol，1997，15961-964)。
IRES的最大特點(diǎn)就是它介導(dǎo)不依賴于5’帽子結(jié)構(gòu)的翻譯起始機(jī)制。不同來源的IRES其作用機(jī)制雖有所區(qū)別，但它們都需要與某些反式作用元件結(jié)合后才能介導(dǎo)翻譯的起始。以腦炎心肌炎病毒EMCV的IRES為例，首先一種名為多聚嘧啶束結(jié)合蛋白(PTB)的反式作用元件與IRES上的特定位點(diǎn)結(jié)合，接著核糖體小亞基再與PTB-IRES復(fù)合物相結(jié)合從而使翻譯過程開始進(jìn)行(JVirol，2000，248330-8339)。IRES是5’非編碼區(qū)的一段DNA序列，這些序列長(zhǎng)度因物種不同而各異。EMCV中的IRES元件由位于5’非編碼區(qū)的450個(gè)核苷酸組成，包含有一系列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該元件中共有6個(gè)PTB結(jié)合位點(diǎn)。這些位點(diǎn)如發(fā)生突變，就會(huì)影響到起始復(fù)合物的形成以及翻譯的效率(RNA，1996，21199-1212)。
目前在脊椎動(dòng)物，昆蟲，酵母等的mRNA中都已發(fā)現(xiàn)了IRES的存在(PlantJ，2000，24583-589)。在已發(fā)現(xiàn)的小RNA病毒mRNAs都有發(fā)現(xiàn)IRES序列(Genes &Development，2001，151593-1612)。
基因診斷和治療中常用的多基因表達(dá)方式主要是通過使用多啟動(dòng)子或重組表達(dá)融合蛋白，但由于多啟動(dòng)子之間或目的基因之間的相互影響，往往減弱甚至于喪失某些基因的表達(dá)(J Innunol，1995，1546466-6474)。鑒于由IRES連接的兩個(gè)不同基因可以共同轉(zhuǎn)錄，各自翻譯，從而使多種基因能在同一載體上獲得良好表達(dá)。該元件已在基因診斷和治療中得到了應(yīng)用，為臨床基因診斷和治療以及療效檢測(cè)與隨訪提供了新的，更準(zhǔn)確快速的檢測(cè)手段。用EMCV的IRES，將gfp報(bào)告基因和hytk治療基因連接，構(gòu)建獲得含gfp和hytk基因的雙順反子真核表達(dá)載體；lipofectin介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染人膀胱癌細(xì)胞株，熒光顯微鏡下可觀察到發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，MTT法測(cè)定顯示丙氧鳥苷(GCV)對(duì)EJ/hytk-IRES-gfp細(xì)胞有明顯的殺傷作用，此殺傷效應(yīng)呈時(shí)間和劑量依賴性；而對(duì)野生型細(xì)胞無明顯毒性。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是生物技術(shù)領(lǐng)域近年來一個(gè)研究熱點(diǎn)，但傳統(tǒng)的受精卵顯微注射，精子介導(dǎo)法等存在的共同缺點(diǎn)就是整合效率不高，低于30％，而大動(dòng)物甚至只有1％左右。1997年12月英國(guó)羅斯林研究所率先報(bào)道了使用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將帶有新霉素抗性基因(neo)的FIX表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胎羊成纖維細(xì)胞，而后把具有neo抗性的細(xì)胞進(jìn)行核移植得到了轉(zhuǎn)基因羊“波莉”(Science，1997，2782130-2133)，但后來研究發(fā)現(xiàn)用該方法研制的轉(zhuǎn)基因羊中存在目的基因FIX缺失及未能表達(dá)等問題。我們?nèi)绻麡?gòu)建帶有目的基因，IRES，報(bào)告基因(如GFP等)的共表達(dá)載體，并用這種載體轉(zhuǎn)染長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞，那么只要選擇其中帶有報(bào)告基因穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行核移植。從理論上講，所獲得的克隆動(dòng)物也就是具有目的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這就有可能克服“波莉”研究中存在的上述問題。這樣不僅可以提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備效率，而且將有力地推動(dòng)乳腺生物反應(yīng)器的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。
本發(fā)明報(bào)道了對(duì)蝦白斑桿狀病病毒(WSSV)中的一個(gè)IRES序列。在本發(fā)明被公布之前，尚沒有任何人公開過本申請(qǐng)中涉及的對(duì)蝦白斑桿狀病病毒(WSSV)的IRES序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種對(duì)蝦白斑桿狀病病毒(WSSV)中的一個(gè)IRES序列，該IRES序列位于WSSV的膜蛋白基因VP28的5’非編碼區(qū)，不編碼蛋白質(zhì)，但能引導(dǎo)mRNA直接進(jìn)入核糖體起始翻譯。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有雙順反子結(jié)構(gòu)的表達(dá)載體，其特征之一在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA，其特征之二在于該DNA的上游是GST基因，該DNA的下游是GFP基因。這種具有雙順反子結(jié)構(gòu)的表達(dá)載體可以用于其它IRES序列的研究，也可以用于疾病的診治中，還可以有產(chǎn)業(yè)上的用途。
本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)DNA轉(zhuǎn)座的方法。從而使Bacmid DNA通過脂質(zhì)體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因真核表達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)發(fā)面，提供了一種收集轉(zhuǎn)染過含有雙順反子質(zhì)粒的BacmidDNA的細(xì)胞釋放出的病毒的方法，并且收集的這些病毒可以分裝后長(zhǎng)期存放于超低溫冰箱，需要時(shí)隨時(shí)可以向生長(zhǎng)狀態(tài)良好的昆蟲細(xì)胞接毒，這樣，無需再次轉(zhuǎn)染細(xì)胞隨時(shí)可以得到含有目的片斷的細(xì)胞，此外，通過進(jìn)一步接毒可以富集含有目的片斷的細(xì)胞。
本發(fā)明還包括一種用地高辛標(biāo)記過的該IRES分子作為探針分子，用Nothern實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GST-IRES-GFP三個(gè)基因共同轉(zhuǎn)錄。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域中已知的各種載體，如市售載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指Hi5粉蚊夜蛾的卵巢細(xì)胞。


附圖1IRES目的片斷擴(kuò)增。
附圖2SDS-PAGE。以未轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以GST純化蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。
附圖3Western blot。以未轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以GST純化蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。
附圖44.1圖為轉(zhuǎn)染細(xì)胞在藍(lán)色激發(fā)光下的照片；4.2圖為同一視野下細(xì)胞的白光照片
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，2001)中所述的實(shí)驗(yàn)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 IRES序列的克隆和測(cè)定1.PCR以對(duì)蝦白斑桿狀綜合病病毒(WSSV)基因組作為模板，用IRES的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，著重指出的是5’引物上游加了終止密碼子，獲得IRES目的片斷。
PCR程序①94℃3min②28個(gè)循環(huán)94℃45sec；55℃45sec；72℃45min③72℃5min2.將PCR產(chǎn)物與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含抗生素LB平板上。挑取已插入目的片斷的菌落由上海生工測(cè)序以保證目的片斷擴(kuò)增后的準(zhǔn)確性。
實(shí)施例2重組質(zhì)粒的構(gòu)建采用基因工程工具酶將IRES序列，GST基因，GFP基因連接到穿梭載體pFASTBACHTb中，并使GST基因位于IRES序列的上游，GFP基因位于IRES序列的下游。然后將連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含抗生素LB平板上。挑取菌落，提取質(zhì)粒，用PCR、酶切和測(cè)序的方法鑒定GST，IRES，GFP三個(gè)基因已正確插入pFASTBACHTb載體中，獲得重組質(zhì)粒GST-IRES-GFP-pFASTBACHTb.
實(shí)施例3重組Bacmid DNA的構(gòu)建應(yīng)用GIBCOBPRL的Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將實(shí)施例2得到的GST-IRES-GFP-pFASTBACHTb重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10BAC感受態(tài)細(xì)胞，分離重組BacmidDNA。
實(shí)施例4重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染Hi5昆蟲細(xì)胞1)在無菌的tube中加入5ul已經(jīng)鑒定的轉(zhuǎn)座了重組質(zhì)粒的Bacmid+90ul培養(yǎng)基(不含血清)+5ul脂質(zhì)體，室溫放置15min以上2)Hi5昆蟲細(xì)胞用培養(yǎng)基(不含血清)洗三次，最后加入1ml的SF培養(yǎng)基，然后逐滴加入脂質(zhì)體混合物，混勻，覆蓋細(xì)胞3)27℃培養(yǎng)5h以上，加入5％FBS的新鮮培養(yǎng)基5ml4)27℃培養(yǎng)72h，上清中含有重組的桿狀病毒，可用于下一步的接毒。
實(shí)施例5昆蟲細(xì)胞接毒傳代擴(kuò)增大量的Hi5昆蟲細(xì)胞，除去舊的培養(yǎng)基，加入含有5％FBS的新鮮培養(yǎng)基后，再加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液，27℃無CO2培養(yǎng)48h-72h.收集的細(xì)胞上清液為第二代重組病毒。
實(shí)施例6 IRES功能研究1 Northern用試劑盒提取轉(zhuǎn)染了重組Bacmid DNA的昆蟲細(xì)胞的總RNA，跑瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，與用地高辛標(biāo)記的IRES目的片斷探針結(jié)合，曝光自顯影。結(jié)果顯示只有一條mRNA條帶，且條帶大小大于IRES片斷。說明GST-IRES-GFP三個(gè)基因共同轉(zhuǎn)錄。
2 Western破碎接毒細(xì)胞，溶于蛋白電泳的上樣緩沖液中，沸水煮5min。SDS-PAGE，將蛋白膠轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜在用TTBS溶液配成的1％脫脂奶粉中4℃封阻過夜。TTBS洗膜3次，每次5min。加入用封閉液稀釋的GST一抗(IgG)，4℃輕搖2h。TTBS洗膜3次，每次5min。加入用TTBS稀釋的Anti-IgG-AP二抗，室溫輕搖1h。加入底物液，顯色至出現(xiàn)顏色深度適宜的條帶。結(jié)果表明GST基因有表達(dá)。
3.重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染Hi5昆蟲細(xì)胞48-72h后用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，受轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)了GFP綠色熒光蛋白，在藍(lán)色激發(fā)光下細(xì)胞呈現(xiàn)綠色。結(jié)果證明GFP基因有表達(dá)。
在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)和修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表IRES序列信息(1)序列特征(A)長(zhǎng)度183bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型cDNA(3)序列描述SEQ ID No.11 TAGACCCTGG CTTACTGTAA CAGAAAAAAG AGTAAAAGGC GACAGCTCGC TTGCCAATTG61 TCCTGTTACG TACTCTGTGG TTTCACGAGG TTGTCATCAC CAAAGGTAAC CTTTTTTTTT121 GTCCTCGCCG ACAAAACGAC ATCTTAATAA CCAAGCAACG TTCGATAAAG AAAAAAACTC181 GTC
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，位于對(duì)蝦白斑桿狀病病毒W(wǎng)SSV的膜蛋白基因VP28的5’非編碼區(qū)，不編碼蛋白質(zhì)，但能引導(dǎo)mRNA直接進(jìn)入核糖體起始翻譯。
2.如權(quán)利要求1中所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
3.一種測(cè)序載體，其特征在于，它含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的DNA。
4.一種具有雙順反子結(jié)構(gòu)的表達(dá)載體，其特征在于，它含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的DNA，
5.根據(jù)權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其特征在于該DNA的上游是GST基因，該DNA的下游是GFP基因。
6.一種Bacmid DNA分子，其特征在于，它含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的雙順反子載體。
7.一種昆蟲細(xì)胞，其特征在于，它轉(zhuǎn)染了SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的雙順反子載體的Bacmid DNA分子。
8.一種昆蟲病毒粒子，其特征在于，它是由權(quán)利要求7所述的昆蟲細(xì)胞釋放出來的。
全文摘要
從對(duì)蝦白斑桿狀病病毒(WSSV)的膜蛋白基因VP28的5’非編碼區(qū)(NCR)分離到一段基因序列，全長(zhǎng)183個(gè)核苷酸，實(shí)驗(yàn)證明具有IRES的功能。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1880456SQ20051007846
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2005年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日
發(fā)明者章曉波, 韓芳 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所