專利名稱：啤酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工業(yè)技術(shù)領(lǐng)域中的一種啤酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
啤酒的風味穩(wěn)定性是啤酒的一個重要的質(zhì)量指標。由于硫化氫的存在影響啤酒的風味，因此，啤酒需要較長的貯酒時間以除去這些物質(zhì)從而達到啤酒的風味的成熟。啤酒酵母的代謝流中，硫化氫是谷胱甘肽的上游代謝物，可以通過增強γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶系的活性來降低硫化氫的形成，增加谷胱甘肽的形成，以改善啤酒的風味，增強啤酒的抗老化能力。
雙己酰是啤酒中另一個重要的風味物質(zhì)，但它的口味域值很低(0.1mg/L)。當雙己酰的含量達到或超過口味域值時，會產(chǎn)生一種餿飯味，從而破壞了啤酒的風味。雙己酰是啤酒酵母合成纈氨酸和亮氨酸的代謝途徑的中間產(chǎn)物α-己酰乳酸經(jīng)非酶途徑促氧化形成的。而ILV2基因編碼己酰羥酸合成酶，能夠把丙酮酸轉(zhuǎn)化為己酰乳酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種高谷胱甘肽含量低雙乙酰含量的啤酒酵母工程菌。
本發(fā)明所提供的啤酒酵母工程菌，是將γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因?qū)脶劸平湍竃SF-31(購于中國普通微生物菌種保藏中心，原始編號CGMCC 2.420)中，得到的高谷胱甘肽含量低雙乙酰含量的菌株；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有70-705bp的選自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有70-539bp的選自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第1-705位堿基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第2983-3522位堿基的核苷酸序列。
所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的氨基酸殘基序列的GenBank號為CAA59393；所述ILV2基因的核苷酸序列的GenBank號為X02549；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶編碼基因的核苷酸序列的GenBank號為D90220。
所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第443-705位堿基的263bp核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第2983-3361位堿基的379bp的核苷酸片段。
為了便于篩選，在導(dǎo)入所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的同時還將銅抗性基因CUP1一同導(dǎo)入釀酒酵母YSF-31；所述銅抗性基因CUP1的核苷酸序列的GenBank號為K02204。
所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因和銅抗性基因CUP1是通過用KpnI和PstI從重組質(zhì)粒pICG切下的6.0kb的DNA片段導(dǎo)入釀酒酵母YSF-31；所述重組質(zhì)粒pICG的物理圖譜如圖7。
所述啤酒酵母工程菌優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2CGMCC №1377。
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377已于2005年05月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC №1377。
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377的細胞為橢圓形，菌落形態(tài)特征是菌落凸起、光滑、乳白色、邊緣整齊。最適生長溫度30℃。生長最適pH為5.5。其發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件與工業(yè)用啤酒酵母菌YSF-31(購于中國普通微生物菌種保藏中心，原始編號CGMCC 2.420)相同。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種構(gòu)建上述啤酒酵母工程菌的方法。
本發(fā)明所提供的構(gòu)建上述啤酒酵母工程菌的方法，是將γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因?qū)脶劸平湍竃SF-31(購于中國普通微生物菌種保藏中心，原始編號CGMCC 2.420)中，得到的高谷胱甘肽含量低雙乙酰含量的菌株即為啤酒酵母工程菌；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有70-705bp的選自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有70-539bp的選自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第1-705位堿基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第2983-3522位堿基的核苷酸序列。
所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的氨基酸殘基序列的GenBank號為CAA59393；所述ILV2基因的核苷酸序列的GenBank號為X02549；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶編碼基因的核苷酸序列的GenBank號為D90220。
所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第443-705位堿基的263bp核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第2983-3361位堿基的379bp的核苷酸片段。
所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第443-705位堿基的263bp核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有自GenBank號為X02549的3′端第2983-3522位堿基的539bp的核苷酸片段。
為了便于篩選，在導(dǎo)入所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的同時還將銅抗性基因CUP1一同導(dǎo)入釀酒酵母YSF-31(購于中國普通微生物菌種保藏中心，原始編號CGMCC 2.420)；所述銅抗性基因CUP1的核苷酸序列的GenBank號為K02204。
所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因和銅抗性基因CUP1是通過用KpnI和PstI從重組質(zhì)粒pICG切下的6.0kb的DNA片段導(dǎo)入釀酒酵母YSF-31(購于中國普通微生物菌種保藏中心，原始編號CGMCC 2.420)；所述重組質(zhì)粒pICG的物理圖譜如圖7。
所述啤酒酵母工程菌優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377。
來源于非使用工業(yè)微生物的基因構(gòu)建的工程菌是否適于飲用，能否被消費者接受還需要很長時間的實踐證明，又因為啤酒酵母本身就含有γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因，所以本發(fā)明采用基因自克隆的方式將γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因插入到ILV2基因中，構(gòu)建了ILV2基因被破壞而γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因增加了一個拷貝的工程菌。本發(fā)明將傳統(tǒng)的育種技術(shù)與分子育種技術(shù)相結(jié)合，首先依據(jù)不同工業(yè)用啤酒酵母菌種的生理生化特性，通過銅抗性篩選，獲得在含有3.0mmol/lCuSO4的YEPD平板上不能生長的工業(yè)用啤酒酵母菌YSF-31作為受體菌。然后采用自克隆技術(shù)，用KpnI和PstI酶切重組質(zhì)粒pICG得到一個6.0kb大小的DNA片段。
此片段含來源于酵母菌的銅抗性基因和γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因，兩端含有受體菌ILV2基因的5′端和3′端序列。用該DNA片段轉(zhuǎn)化工業(yè)啤酒酵母菌YSF-31，該片段和YSF-31基因組上的ILV2發(fā)生同源重組，結(jié)果銅抗性基因和γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因被整合到染色體上。這樣，在重組酵母菌株中，ILV2基因被破壞，而同時銅抗性基因和γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因都增加了一個拷貝。在含有4mmol/l CuSO4的YEPD平板上篩選轉(zhuǎn)化子。通過遺傳穩(wěn)定性實驗、及模擬啤酒發(fā)酵小型實驗、在啤酒廠進行的小試實驗和中試發(fā)酵實驗，獲得高谷胱甘肽含量低雙乙酰含量的工業(yè)啤酒酵母工程菌YSF31(pICG)-2(CGMCC №1377)。與受體菌相比，其生理、生化特性無明顯差異；小試和中試發(fā)酵實驗生產(chǎn)的啤酒的風味也無差異；對發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般啤酒廠的設(shè)備和條件均可使用。本發(fā)明的啤酒酵母工程菌因雙乙酰產(chǎn)生量降低而縮短發(fā)酵周期，生產(chǎn)的啤酒保鮮時間明顯增長；因增加谷胱甘肽的形成，改善了啤酒的風味，增強了啤酒的抗老化能力。


圖1為CUP1基因的PCR產(chǎn)物的電泳2為重組質(zhì)粒pMCUP和pYCUP的構(gòu)建過程示意3為質(zhì)粒pMCUP的酶切驗證圖譜圖4為轉(zhuǎn)化子YS58(pYCUP)的營養(yǎng)缺陷型篩選圖5為轉(zhuǎn)化子YS58(pYCUP)的銅抗性篩選圖6為質(zhì)粒pICG的構(gòu)建過程示意7為質(zhì)粒pICG的酶切驗證圖譜圖8為銅抗性基因和γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因整合到Y(jié)SF-31基因組上的示意9為用引物ILV2-1和CUP1-P2進行受體和轉(zhuǎn)化子的PCR分析電泳圖譜圖10為搖瓶發(fā)酵實驗中受體菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的谷胱甘肽含量和雙乙酰含量的比較圖11為百升發(fā)酵實驗中受體菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的雙乙酰含量檢測圖12為百升發(fā)酵實驗中受體菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的糖度檢測結(jié)果圖13為兩噸發(fā)酵實驗中受體菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的谷胱甘肽含量和雙乙酰含量的比較具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、構(gòu)建啤酒酵母工程菌-釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377。
一、含有谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因和銅抗性基因CUP1的表達載體pICG的構(gòu)建1、工業(yè)用啤酒酵母菌的銅抗性測定工業(yè)用啤酒酵母菌對銅的抗性普遍偏低，因此，可以依據(jù)銅抗性的提高有效篩選酵母轉(zhuǎn)化子，銅抗性被普遍用作工業(yè)用啤酒酵母的選擇標記。通過銅抗性測定，大部分工業(yè)用啤酒菌在含有2.5mmol/l CuSO4的YEPD平板上不能生長，測定篩選到Y(jié)SF-31、YSF-35和YSF-41(購于中國普通微生物菌種保藏中心，原始編號分別為CGMCC 2.420、CGMCC 2.412、CGMCC 2.241)三株酵母在含有3.0mmol/lCuSO4的YEPD平板上不能生長，確定用YSF-31作為下一步轉(zhuǎn)化實驗的受體菌。
2、銅抗性基因CUP1的PCR擴增根據(jù)文獻報導(dǎo)的CUP1的基因序列(CUP1基因序列的GenBank號為K02204)設(shè)計CUP1基因克隆的PCR引物P15′-CCAAGATCTCGCTATACGTGCATATGTTC-3′P25′-CGAGTCGACATCTGTTGTACTATCCGCTT-3′劃線部分分別是BglII和SalI酶切位點，PCR反應(yīng)以P1、P2為引物，以YSF-31的基因組DNA為模板，在50μl PCR反應(yīng)混合液中含25μl Taq酶Mix，12.5μmol/l引物各2μL，模板10μl，加無菌水11μl調(diào)整至50μl。條件為94℃，變性5min，循環(huán)參數(shù)94℃變性40s；56℃退火1min；72℃延伸2min；30個循環(huán)；72℃延伸15min使產(chǎn)物延伸完全。將得到的PCR產(chǎn)物進行0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1所示，得到一條約1.1kb的特異性條帶，其大小與預(yù)期相當。圖1中，泳道M為DNA分子量標準sppI DNA/EcoRI(8576，7427，6106，4899，3639，2799，1953，1882，1515，1412，1164，992，718，710，492，359bp)，泳道1為CUP1的PCR產(chǎn)物。回收該約1.1kb的DNA片段，克隆至pGEM-T載體，進行測序，結(jié)果表明擴增得到的CUP1具有GenBank Access No.K02204的自5′端第1098-2189位堿基的核苷酸序列。
3、重組質(zhì)粒pYCUP的構(gòu)建PCR片段經(jīng)低熔點膠回收直接與經(jīng)HincII酶切的質(zhì)粒pBluescriptM13(寶生物工程(大連)有限公司)連接，構(gòu)成質(zhì)粒pMCUP。用KpnI和SalI酶切質(zhì)粒pMCUP得到CUP1片段，然后與用KpnI和SalI酶切的線性質(zhì)粒YEp352(Hill JE，Meyers AM，Koemer TJ，Tzagoloff A.Yeast/E.coli shuttle vectors with multiple unique restriction sites.Yeast，1993，9163-167.)連接，得到質(zhì)粒pYCUP(圖2)。并利用EcoRI，SacI，KpnI和XbaI進行單酶切驗證pMCUP，結(jié)果如圖3所示，pMCUP經(jīng)EcoRI酶切后，得到4060bp的DNA片段(泳道2)；pMCUP經(jīng)SacI酶切后，得到4060bp的DNA片段(泳道3)；pMCUP經(jīng)KpnI酶切后，得到4060bp的DNA片段(泳道4)；pMCUP經(jīng)XbaI酶切后，得到3200bp片段和660bp的DNA片段(泳道5)。酶切驗證結(jié)果表明pMCUP的結(jié)構(gòu)正確。圖3中，1為DNA分子量標準sppI DNA/EcoRI(8576，7427，6106，4899，3639，2799，1953，1882，1515，1412，1164，992，718，710，)。
用穿梭質(zhì)粒pYCUP通過完整酵母轉(zhuǎn)化法(Adams A.Gottschling DE，Kaiser CA，Steams T.Methods in Yeast Geneticsa cold spring harbor laboratory course manual.New YorkCold Spring Harbor；1997.Cold Spring Harbor Laboratory)轉(zhuǎn)化實驗室酵母菌株YS58(Teunissen ARH，Holub E，Hucht JVD.Physical localization of theflocculation gene FLO1 on chromosome I of Saccharomyces cerevisiae.Yeast，1993，91-10)，轉(zhuǎn)化時用含有20mg/L Leu，Ura和Trp的YNB培養(yǎng)基進行篩選，因質(zhì)粒中含有URA3基因，所以含有質(zhì)粒pYCUP的轉(zhuǎn)化子YS58(pYCUP)在不含Ura的YNB培養(yǎng)基上也能生長，而YS58不能生長(圖4)。圖4中，兩個平板中的第一行的五個菌落為受體菌，其余各行的五個菌落均為轉(zhuǎn)化子YS58(pYCUP)。左側(cè)平板中的培養(yǎng)基為含有20mg/L Leu和20mg/L Trp的YNB培養(yǎng)基，右側(cè)平板為含有20mg/LLeu，20mg/L Ura和20mg/L Trp的YNB培養(yǎng)基。
得到轉(zhuǎn)化子YS58(pYCUP)后用含有不同Cu2+濃度的YEPD培養(yǎng)基驗證。結(jié)果是在含有3mM Cu2+的平皿中YS58與轉(zhuǎn)化子YS58(pYCUP)都能生長，而在5-9mM Cu2+的平皿中只有轉(zhuǎn)化子YS58(pYCUP)能夠生長，YS58不能生長(圖5)。圖5中，四個平板中的第一行的五個菌落為受體菌，其余各行的五個菌落均為轉(zhuǎn)化子YS58(pYCUP)。實驗結(jié)果表明CUP1基因具有銅抗性功能，可以用作篩選標記。
4、重組質(zhì)粒pICG的構(gòu)建用BglII和SalI酶切質(zhì)粒pYCUP得到CUP1片段，用SalI和XbaI酶切質(zhì)粒pGF-2(Fan X，He X，Guo X，Qu N，Wang Ch，Zhang B.Increasing glutathioneformation by functional expression of the γ-glutamylcysteine synthetasegene in Saccharomyces cerevisiae.Biotechnol.Lett.2004，26415-417)得到片段GSH1，用BglII和XbaI酶切質(zhì)粒pLZ-2(李艷，鐵翠娟，王正祥，張博潤，諸葛健。低雙乙酰啤酒酵母菌的構(gòu)建。釀酒，2002，2977-79)，將三個片段連接，構(gòu)成質(zhì)粒pICG(圖6)。并利用SalI、BamHI、EcoRI、BglII或SacI單酶切，SalI和SacI雙酶切驗證pICG，結(jié)果如圖7所示，pICG經(jīng)SalI酶切后，得到7000bp片段和4300bp片段(泳道2)；pICG經(jīng)BamHI酶切后，得到6100bp片段，3600bp片段和1600bp片段(泳道3)；pICG經(jīng)EcoRI酶切后，得到6200bp片段，2900bp片段和2200bp片段(泳道4)；pICG經(jīng)BglII酶切后，得到9820bp片段和990bp片段和490bp片段(泳道5)；pICG經(jīng)SacI酶切后，得到5700bp和5600bp片段(泳道6)；pICG經(jīng)SalI和SacI雙酶切后，得到5200bp片段，4600bp片段和1500bp片段(泳道7)。酶切驗證結(jié)果表明pICG的結(jié)構(gòu)正確。圖7中，1為DNA分子量標準sppI DNA/EcoRI(8576，7427，6106，4899，3639，2799，1953，1882，1515，1412，1164，992，718，710，)。
二、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2CGMCC №1377的構(gòu)建1、工程菌YSF31(pICG)-2的構(gòu)建用KpnI和PstI酶切重組質(zhì)粒pICG得到一個6.0kb大小的DNA片段。此片段含有銅抗性基因和γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因，γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因的5′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第443-705位堿基的263bp核苷酸片段，γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第2983-3361位堿基的379bp的核苷酸片段。用該DNA片段轉(zhuǎn)化(Adams A.Gottschling DE，Kaiser CA，Stearns T.Methods in Yeast Geneticsa cold spring harbor laboratory course manual.New YorkCold Spring Harbor；1997.Cold Spring Harbor Laboratory)工業(yè)啤酒酵母菌YSF-31，在含有硫酸銅的YEPD培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化子，獲得硫酸銅抗性明顯提高的轉(zhuǎn)化子YSF31(pICG)-2。該6.0kb片段和YSF-31基因組上的ILV2發(fā)生同源重組，結(jié)果，銅抗性基因和谷胱甘肽基因被整合到染色體上。這樣，在重組酵母菌株中，ILV2基因被破壞，而同時銅抗性基因和谷氨酸半胱氨酸合成酶基因都增加了一個拷貝(圖8)。
用引物ILV2-1(5′-GCAGGATCCTGGCTTCAGTTGCTGTCT-3′)和CUP1的引物P2，以工程菌YSF31(pICG)-2的基因組DNA為模板，進行PCR擴增驗證，結(jié)果在受體菌YSF-31中沒有任何片段生成，而在挑選的工程菌YSF31(pICG)-2中擴增出了大小為1.3kb的片段(圖9)。圖9中，1為1kb ladder marker；2-4轉(zhuǎn)化子YSF31(pICG)-2的PCR產(chǎn)物；5受體菌YSF-31的PCR產(chǎn)物；6陽性對照pICG為模板的PCR產(chǎn)物。
2、工程菌YSF31(pICG)-2的γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶(AHAS)酶活測定菌株接于YEPD培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)36小時，離心收集細胞，按照細胞通透測定法測定工程菌YSF31(pICG)-2和受體菌YSF-31的AHAS酶活(Magee PT，Robichon-Szulmajster DH.The regulation of isoleucine-valine biosynthesisin Saccharomyces cerevisiae.2.Identification and characterization ofmutants lacking acteohydroxyacid synthase.Eur.J.Biochem.1968，3502-506)。測定結(jié)果表明，在工程菌YSF31(pICG)-2中AHAS的酶的活性是受體菌的50％(表1)，證明在工程菌YSF31(plCG)-2中ILV2基因被破壞掉一個等位基因。
表1轉(zhuǎn)化子YSF31(pICG)-2和受體菌YSF-31的AHAS酶活比較

3、搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果將受體菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2分別接入5ml麥芽汁培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)12小時，以10％的接種量接種于10ml麥芽汁培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)36小時，全部接于含有270ml麥芽汁的三角瓶中，9℃靜置培養(yǎng)10天。每兩天取樣，每次用無菌移液管取10ml培養(yǎng)液，用兩層3MM濾紙過濾，分別檢測細胞內(nèi)谷胱甘肽含量(Fan X，He X，Guo X，Qu N，Wang Ch，Zhang B.Increasing glutathioneformation by functional expression of the γ-glutamylcysteine synthetasegene in Saccharomyces cerevisiae.Biotechnol.Lett.2004，26415-417)和濾液中雙乙酰含量(管敦儀。啤酒工業(yè)手冊，中冊，p234，輕工業(yè)出版社)。結(jié)果表明工程菌的谷胱甘肽的含量比受體菌的高，而在發(fā)酵液中，工程菌的雙乙酰含量比受體菌的低，特別是工程茵的峰值是YSF-31的75％。這充分說明在工程菌中GSH1基因得到了高表達而ILV2基因被破壞掉一個拷貝(圖10)。圖10中，YSF-31的GSH含量(■)工程菌YSF31(pICG)-2的GSH含量(□)；YSF-31的雙乙酰含量(▲)；工程菌YSF31(pICG)-2的雙乙酰含量(△)。
4、小試(百升)發(fā)酵實驗將酵母菌接入5mL麥芽汁培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)12小時，以10％的接種量接種于10mL麥芽汁培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)36小時，培養(yǎng)液全部接于270mL麥芽汁中，25℃培養(yǎng)36小時，然后將培養(yǎng)液接入2000ml大三角瓶，20℃培養(yǎng)36小時，接至100L發(fā)酵罐(裝有80L麥芽汁培養(yǎng)基)中。啟發(fā)后10℃培養(yǎng)，當糖度降到2.6時，降溫到0℃后儲。
(1)谷胱甘肽含量檢測將發(fā)酵液離心收集菌體，然后測細胞中的GSH含量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化子YSF31(pICG)-2細胞中的GSH含量是受體YSF31細胞的1.38倍，說明在轉(zhuǎn)化子YSF31(pICG)-2細胞中GSH1基因得到了高表達(表2)。
表2受體菌和工程菌的谷胱甘肽含量的比較

(2)雙乙酰含量檢測將發(fā)酵液用濾紙過濾，然后測濾液中的雙乙酰含量，在百升發(fā)酵實驗中，工程菌YSF31(pICG)-2的發(fā)酵速度比受體菌的快得多，工程菌YSF31(pICG)-2從第10天開始進入后儲期，受體菌YSF-31從第14天開始進入后儲期，工程菌提前4天進入后儲期。工程菌的雙乙酰含量的峰值比受體的低(圖11)。圖11中，受體菌YSF-31的雙乙酰含量(▲)；工程菌YSF31(pICG)-2的雙乙酰含量檢測(△)。
(3)糖度檢測從發(fā)酵罐中取500ml發(fā)酵液，通過反復(fù)傾倒排除二氧化碳，用糖度計檢測發(fā)酵液的糖度。糖度檢測實驗表明，工程菌YSF31(pICG)-2的糖發(fā)酵速度比受體菌YSF-31的快，提前六天達到2.5(圖12)。圖12中，受體菌YSF-31的糖度檢測(▲)；工程菌YSF31(pICG)-2的糖度檢測(△)。
(4)發(fā)酵結(jié)束后其他指標的檢測百升實驗在后儲期(工程菌YSF31(pICG)-2和受體菌YSF-31的后儲期均為14天)取樣檢測pH、絮凝性、α-N同化率和發(fā)酵度，結(jié)果表明pH、絮凝性、α-N同化率和發(fā)酵度，受體菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2基本相同，說明染色體上的整合沒有改變酵母的其他特性(表3)。
表3其他發(fā)酵指標的檢測

5、中試(兩噸)發(fā)酵實驗將酵母菌接入5mL麥芽汁培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)12小時，以10％的接種量接種于10mL麥芽汁培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)36小時，培養(yǎng)液全部接于270mL麥芽汁中，25℃培養(yǎng)36小時，然后將培養(yǎng)液接入2000ml大三角瓶，20℃培養(yǎng)36小時，接至15L的卡氏罐中，20℃培養(yǎng)36小時，菌液全部接于兩噸發(fā)酵罐(裝有1600L麥芽汁培養(yǎng)基)中，10℃發(fā)酵，當糖度降到2.6時，降溫到0℃后儲。
(1)谷胱甘肽含量與雙乙酰含量檢測在兩噸發(fā)酵實驗中，工程菌YSF31(pICG)-2的谷胱甘肽的含量比受體菌YSF-31的高，而工程菌YSF31(pICG)-2的雙乙酰的含量比受體菌YSF-31的低。跟小試實驗結(jié)果和百升發(fā)酵實驗結(jié)果一致(圖13)。圖13中，受體菌YSF-31的雙乙酰含量(■)；工程菌YSF31(pICG)-2的雙乙酰含量(□)；受體菌YSF-31谷胱甘肽含量(○)；工程菌YSF31(pICG)-2的谷胱甘肽含量(●)。
(2)抗老化實驗硫代巴比妥酸(TBA)法測定羰基化合物的檢測報告表明，用工程菌YSF31(pICG)-2生產(chǎn)的成品酒的保鮮時間是受體菌YSF-31生產(chǎn)的成品酒保鮮時間的1.5倍左右(表4)。
表4受體菌YSF-31和工程菌YSF31(pICG)-2的抗老化實驗

注1和1’樣品為兩噸中試工程菌YSF31(pICG)-2及其平行樣，2和2’為兩噸中試受體菌YSF-31及其平行樣。說明RSV值越大，表示成品啤酒的保鮮時間越長。
(3)受體菌和工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒經(jīng)過陳化以后，品評結(jié)果如下10位評委品評結(jié)果是認為工程菌YSF31(pICG)-2發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒優(yōu)于受體菌YSF-31生產(chǎn)的啤酒的有7位評委；認為工程菌YSF31(pICG)-2發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒同于受體菌YSF-31生產(chǎn)的啤酒的有1位評委；認為工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒遜于受體菌YSF-31生產(chǎn)的啤酒的有2位評委。
6、工程菌YSF31(pICG)-2的穩(wěn)定性檢測將工程菌YSF31(pICG)-2分別在有選擇壓力(YEPD+3mmol/L CuSO4)及無選擇壓力(YEPD)的液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)120h(24小時傳一次代)，每天取樣檢測插入的DNA片段的丟失情況，結(jié)果表明，無論在有選擇壓力條件下，還是在無選擇壓力條件下，連續(xù)培養(yǎng)120h后，100％的工程菌細胞帶有插入DNA片段，未發(fā)生丟失現(xiàn)象。
通過上述實驗步驟，獲得高谷胱甘肽含量低雙乙酰生成量的工業(yè)啤酒酵母工程菌YSF31(pICG)-2。啤酒酵母工程菌YSF31(pICG)-2已于2005年05月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC №1377。
權(quán)利要求
1.一種啤酒酵母工程菌，是將γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因?qū)脶劸平湍竃SF-31中，得到的高谷胱甘肽含量低雙乙酰含量的菌株；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有70-705bp的選自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有70-539bp的選自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第1-705位堿基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第2983-3522位堿基的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的氨基酸序列的GenBank號為CAA59393；所述ILV2基因的核苷酸序列的GenBank號為X02549；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶編碼基因的核苷酸序列如GenBank號D90220。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第443-705位堿基的263bp核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第2983-3361位堿基的379bp的核苷酸片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于在導(dǎo)入所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的同時還將銅抗性基因CUP1一同導(dǎo)入釀酒酵母YSF-31；所述銅抗性基因CUP1的核苷酸序列如GenBank號K02204。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因和銅抗性基因CUP1是通過用KpnI和PstI從重組質(zhì)粒pICG切下的6.0kb的DNA片段導(dǎo)入釀酒酵母YSF-31；所述重組質(zhì)粒pICG的物理圖譜如圖7。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于所述啤酒酵母工程菌是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377。
7.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述啤酒酵母工程菌的方法，是將γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因?qū)脶劸平湍竃SF-31中，得到的高谷胱甘肽含量低雙乙酰含量的菌株即為啤酒酵母工程菌；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有70-705bp的選自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有70-539bp的選自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第1-705位堿基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第2983-3522位堿基的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的氨基酸序列的GenBank號為CAA59393；所述ILV2基因的核苷酸序列的GenBank號為X02549；所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶編碼基因的核苷酸序列如GenBank號D90220。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第443-705位堿基的263bp核苷酸片段，所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有自GenBank號為X02549的5′端第2983-3361位堿基的379bp的核苷酸片段；在導(dǎo)入所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的同時還將銅抗性基因CUP1一同導(dǎo)入釀酒酵母YSF-31；所述銅抗性基因CUP1的核苷酸序列的GenBank號為K02204。
10.根據(jù)權(quán)利要求7、8或9所述的方法，其特征在于所述γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因和銅抗性基因CUP1是通過用KpnI和PstI從重組質(zhì)粒pICG切下的6.0kb的DNA片段導(dǎo)入釀酒酵母YSF-31；所述重組質(zhì)粒pICG的物理圖譜如圖7；所述啤酒酵母工程菌優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF31(pICG)-2 CGMCC №1377。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種啤酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法。該工程菌，是將γ－谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因?qū)脶劸平湍竃SF－31中，得到的高谷胱甘肽含量低雙乙酰含量的菌株；所述γ－谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的5′端連接有70－705bp的選自ILV2基因的5′端序列的核苷酸片段，所述γ－谷氨酸半胱氨酸合成酶的編碼基因的3′端連接有70－539bp的選自ILV2基因的3′端序列的核苷酸片段；所述ILV2基因的5′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第1－705位堿基的核苷酸序列，所述ILV2基因的3′端序列是自GenBank號為X02549的5′端第2983－3522位堿基的核苷酸序列。該工程菌因雙乙酰產(chǎn)生量降低而縮短發(fā)酵周期，生產(chǎn)的啤酒保鮮時間明顯增長；因增加谷胱甘肽的形成，改善了啤酒的風味，增強了啤酒的抗老化能力。
文檔編號C12N1/19GK1699552SQ20051007778
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
發(fā)明者張博潤, 張吉娜, 何秀萍, 郭雪娜, 傅秀輝 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所