專利名稱：發(fā)酵轉(zhuǎn)化米糠油腳生產(chǎn)香草酸和香草醛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)香草酸與香草醛的方法，尤其涉及一種以米糠油加工過(guò)程產(chǎn)生的廢棄物(皂腳)為原料，通過(guò)微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香草酸與香草醛的方法，屬生物催化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
香草醛(4-羥基-3-甲氧基苯甲醛)，俗稱香蘭素(vanillin)，是享有世界“食品香料之王”美稱的香莢蘭(Vanilla planifolia Andreurs)的主要成份，具有純正的香莢蘭豆香氣及濃郁的奶味，氣味幽雅清爽，是當(dāng)今世界上重要的廣譜型高檔香料，被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、煙草、酒類、化妝品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)。
目前，“合成(artificial)”或半合成(semi-synthetical)的香草醛多數(shù)是由苯基石化原料如愈創(chuàng)木酚經(jīng)Reimer-Tiemann反應(yīng)或從木質(zhì)素原料進(jìn)行化學(xué)合成，雖然方法簡(jiǎn)單，能大規(guī)模生產(chǎn)，價(jià)格低廉，但卻存在容易造成環(huán)境污染、采用的原料如愈創(chuàng)木酚有毒等弊端。從植物(Vanilla planifolia)提取的香草醛，由于受氣候與地域的限制，產(chǎn)量少(年產(chǎn)約20噸)，價(jià)格昂貴($1,200~4,000/kg)。隨著人們對(duì)食品安全性的重視，歐洲已建議在食品中使用天然香草醛，而不許可使用廉價(jià)的化學(xué)合成香草醛(European Directive 88/388/CEE，JO No.L184，22nd of June1988)。從天然原料經(jīng)物理或生物方法加工的香料稱天然香料，由生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的香草醛被稱“生物香蘭素(bio-vanillin)”，與植物提取的香蘭素“天然等同(nature-identical)”。為滿足人們對(duì)天然香草醛的需求，開發(fā)微生物或酶生產(chǎn)香草醛的方法，其中特別是由各種真菌培養(yǎng)液生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香草醛的方法被認(rèn)為是一經(jīng)濟(jì)性的方法。(In the May 2000 edition of″Chemistry in Britain″，pages48-50)阿魏酸由于與香草醛的化學(xué)相似性，在植物體內(nèi)從葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)橄悴萑┑恼麄€(gè)過(guò)程中是一個(gè)重要的底物，因而被認(rèn)為是一種很有前途的香草醛前體物質(zhì)。Gross等(US5262315)發(fā)現(xiàn)P.cinnabarinus CNCMnDEG I-937或CNCMnDEG I-938能轉(zhuǎn)化0.3g/L阿魏酸產(chǎn)生0.045g/L香草醛，摩爾轉(zhuǎn)化率20.5％；轉(zhuǎn)化香草酸生成香草醛，轉(zhuǎn)化率35.1％。Lesage-Meessen等(US5866380，US 6,162,637)改用絲狀真菌二步法生產(chǎn)香草醛，提高香草醛的產(chǎn)率。第一步用黑曲霉菌株Asp.niger MIC 373的發(fā)酵培養(yǎng)液，按每24小時(shí)加阿魏酸430mg/L均衡方式添加了5.05g/L阿魏酸。培養(yǎng)發(fā)酵15天后HPLC檢測(cè)培養(yǎng)液中的香草酸最終濃度為3.60g/L，添加的阿魏酸完全消耗，很大部分轉(zhuǎn)化為香草酸(82％)，小部分(2％)為代謝產(chǎn)物甲氧基氫醌，沒(méi)有香草醛和香草醇；也可用Streptomyces setonii strain ATCC 25497的發(fā)酵培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)化0.88g/L阿魏酸生成0.332g/L香草酸。第二步培養(yǎng)黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporiumMIC 247，每天添加0.3g/L香草酸，連續(xù)流加3天，同時(shí)在菌體培養(yǎng)3天后加入XAD-2選擇性樹脂，最終將1.2g/L香草酸還原成0.628/L香草醛。后續(xù)的研究報(bào)道對(duì)朱紅密孔菌P.cinnabarinus MUCL39533轉(zhuǎn)化香草酸生成香草醛進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐上的放大，香草醛的濃度達(dá)到1,575mg/L(StenielaireC.，Lesage-meessen.L.，Oddou J.et.al.，J of Biosci and Bioengineering.2000，89，223-230)。這種以阿魏酸為前體通過(guò)兩種微生物的轉(zhuǎn)化制備香草醛的方法，涉及到兩種微生物的培養(yǎng)，兩次底物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，和中間產(chǎn)物的提取，整個(gè)生產(chǎn)流程長(zhǎng)，生產(chǎn)效率低。Rabenhorst等(US6133003)培養(yǎng)擬無(wú)枝酸菌Amycolatopsis sp.DSM 9992，在培養(yǎng)過(guò)程中分次加入3.3％的阿魏酸，47h產(chǎn)7317ppm香草醛，殘留1526ppm阿魏酸。Muheim等(US 6,235,507)用S..setonii ATCC 39116培養(yǎng)5～40h，至碳源葡萄糖幾乎消耗完后，在發(fā)酵液中按分批方法添加阿魏酸5～40g/L，繼續(xù)培養(yǎng)(生物轉(zhuǎn)化)約5～50h，阿魏酸轉(zhuǎn)化香草醛積累達(dá)到8～16g/L，但副產(chǎn)物較多，有香草醇、香草酸、愈創(chuàng)木酚、對(duì)-乙烯基愈創(chuàng)木酚和2-甲基4-乙基-苯酚等，不利于轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離提取。
在上述從阿魏酸微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香草醛的方法中，都未提及采用的底物阿魏酸和香草酸的來(lái)源。FDA規(guī)定，只要原料是天然的，通過(guò)生物催化獲得的香料就是天然的，采用的阿魏酸是否天然關(guān)系到生產(chǎn)的香草醛是否屬天然產(chǎn)品。
天然阿魏酸以反式阿魏酸的形式存在，它是構(gòu)成植物細(xì)胞壁成分的組分之一。在米糠植物細(xì)胞壁中阿魏酸主要以阿拉伯糖苷的形式存在于植物細(xì)胞壁的米糠渣中外，還以環(huán)木菠蘿醇類阿魏酸酯和甾醇類阿魏酸酯的形式存在于米糠毛油中，含量約為2～3％。米糠毛油提取色拉油后的皂腳中含阿魏酸酯約70％，該酯中阿魏酸的含量高達(dá)25％~30％。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一種生產(chǎn)香草酸和香草醛的方法，依次包括以下步驟
(1)黑曲霉菌株Aspergillus nige CGMCC0774在發(fā)酵罐中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，發(fā)酵30-50h時(shí)；(2)一次或分次添加含阿魏酸的米糠油皂腳溶液，使發(fā)酵液中阿魏酸的終濃度為1～5g/L，轉(zhuǎn)化24～80h，得到含香草酸轉(zhuǎn)化液；(3)含香草酸轉(zhuǎn)化液進(jìn)行膜過(guò)濾除去菌絲體，調(diào)pH4～6，并補(bǔ)加1～10g/L的葡萄糖后，高溫滅菌；(4)朱紅密孔菌Pycnoporus cinnabarinus CGMCC1115或其突變株在發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵24～72h，獲得濕菌絲體；(5)濕菌絲體以10％的比率與處理過(guò)的含香草酸轉(zhuǎn)化液混合，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)生成香草醛液，反應(yīng)時(shí)間24～80h；(6)從香草醛液中提取香草醛。
步驟(4)轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程中還可以添加2~20％的孔徑范圍為80~200的大孔樹脂或20~80％的有機(jī)溶劑。
以下是本發(fā)明的詳細(xì)描述。
本發(fā)明采用微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化天然原料生產(chǎn)香草酸和香草醛的方法，涉及的微生物Asp.Niger CGMCC 0774和P.cinnabarinus CGMCC1115菌株已保存在中國(guó)北京中關(guān)村中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心。發(fā)明內(nèi)容包括(1)天然阿魏酸或其水溶液的制備黑曲霉Asp.Niger CGMCC 0774斜面培養(yǎng)配制含葡萄糖1～10％，馬鈴薯浸汁5～30％，瓊脂1～2.5％，pH6～9的培養(yǎng)基，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/100ml，下同。100～120℃滅菌，20～50分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面、接種，20～40℃培養(yǎng)3～7天。
種子培養(yǎng)和發(fā)酵麥芽糖5～50g/L、酒石酸二銨0.2～10g/L、酵母膏1～5g/L、磷酸二氫鉀0.2～2g/L、氯化鈣1～10g/L、硫酸鎂0.2～5g/L，pH值為4～9的培養(yǎng)基，裝液量20～150ml/250ml三角瓶，100～120℃滅菌，20～50分鐘，滅菌后冷卻、接種，接種量5～10％，20～40℃，搖瓶轉(zhuǎn)速100～250r/min。在上述條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，培養(yǎng)1～5天，分別作為種子或發(fā)酵培養(yǎng)液。
阿魏酸酯的酶法水解取米糠油皂腳溶液，加入培養(yǎng)好的黑曲霉發(fā)酵液中，25~40℃下水解反應(yīng)24~48h，用0.2um微濾膜過(guò)濾除去菌絲體，加正己烷萃取甾醇后，溶液加稀酸酸化，調(diào)pH4~5，用0.2um微濾膜過(guò)濾得到阿魏酸沉淀，用10％的NaOH調(diào)pH7.0，得到含阿魏酸的溶液，該溶液可直接用于微生物轉(zhuǎn)化，阿魏酸的濃度由HPLC測(cè)定。也可將此含阿魏酸的溶液用常規(guī)的結(jié)晶方法制備成品阿魏酸。
(2)香草酸轉(zhuǎn)化液的制備與處理按上述種子培養(yǎng)和發(fā)酵條件，將黑曲霉Asp.nigerCGMCC 0774種子以5-10％的種量接入發(fā)酵罐中，控制罐溫30~37℃，轉(zhuǎn)速100~200r/min，通氣量0.5~1vvm，當(dāng)發(fā)酵液pH降為最低點(diǎn)pH3.5以下時(shí)，加入終濃度為1~4g/L的按上述方法制備的底物阿魏酸，轉(zhuǎn)化30~54h，補(bǔ)加1~4g/L的阿魏酸底物，繼續(xù)轉(zhuǎn)化至阿魏酸接近耗完。用0.2um微濾膜過(guò)濾除去菌絲體，調(diào)pH4~5，補(bǔ)加0.2~5g/L的葡萄糖，100～120℃滅菌，20～50分鐘，滅菌后冷卻，即得到含香草酸1~3g/L的溶液，香草酸對(duì)阿魏酸摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到64~86％。
利用篩選得到的絲狀真菌黑曲霉(Asp.niger)CGMCC 0774同時(shí)具有阿魏酸酯酶與具備氧化裂解阿魏酸側(cè)鏈的轉(zhuǎn)化活力，可以將水解阿魏酸酯與進(jìn)而發(fā)酵轉(zhuǎn)化為香草酸一步進(jìn)行。由于黑曲霉缺乏還原香草酸生產(chǎn)香草醛的能力，需要再用朱紅密孔菌(P.cinnabarnus)CGMCC1115進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到所需產(chǎn)物香草醛。
(3)生物轉(zhuǎn)化制備香草醛朱紅密孔菌P.cinnabarinusCGMCC1115斜面培養(yǎng)配制含葡萄糖1～10％，馬鈴薯浸汁5～30％，瓊脂1～2.5％，pH6～9的培養(yǎng)基。100～120℃滅菌，20～50分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面、接種，20～40℃培養(yǎng)3～7天。
種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)基的成份為葡萄糖0.1~30g/L，牛肉膏0.1~15g/L，酵母膏0.1~10g/L，磷酸二氫鉀0.1~2.0g/L，硫酸鎂0.1~0.5g/L，氯化鈣0.1~1.0g/L。培養(yǎng)基的起始pH3~8，裝液量20～150ml/250ml三角瓶，100～120℃滅菌，20～50分鐘，滅菌后冷卻、接種，接種量5～10％，20~35℃，搖瓶轉(zhuǎn)速100～250r/min。在上述條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，培養(yǎng)時(shí)間36~72h，分別作為種子或發(fā)酵培養(yǎng)液。發(fā)酵罐培養(yǎng)控制轉(zhuǎn)速50~100r/min，通氣量0.5~1vvm，溫度20~40℃，培養(yǎng)36-48h，pH降為pH3.5以下時(shí)，離心或過(guò)濾得到菌絲體，即可用于香草酸的生物轉(zhuǎn)化。
將菌絲體以10％的量接入滅菌的香草酸處理液，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，控制發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速50~100r/min，通氣量0.2~0.8vvm，溫度20~40℃，反應(yīng)過(guò)程中添加20~80％的乙酸正丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯等有機(jī)溶劑，或者添加2~20％的HZ802、D001、D001-CC、D061、D113、DA201、HPD600、HPD300、HPD100A等不同型號(hào)的，孔徑范圍為80~200的大孔樹脂，反應(yīng)24～80h，不斷生成的香草醛被萃取于有機(jī)溶劑中或被吸附到樹脂上，當(dāng)溶液中香草酸濃度接近0時(shí)結(jié)束反應(yīng)，香草醛濃度可到1.8~4.0g/L，對(duì)香草酸的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到60~80％。
(4)香草醛的提取分離反應(yīng)液中的有機(jī)溶劑，或吸附樹脂，用100％乙醇進(jìn)行洗脫，香草醛集中在有機(jī)相中。含有香草醛的有機(jī)相，經(jīng)飽和氯化鈉等脫水后，在30~70℃下真空濃縮，回收溶劑，得到100~600g/L的香草醛濃縮液。濃縮液冷卻，攪拌得到純度為70~80％的香草醛深棕色粗結(jié)晶。再用體積比為0.01~0.8的乙醇~水溶液溶解，加熱至60~85℃，至香草醛粗晶體完全溶解后，冷卻至0~10℃，靜止結(jié)晶，濾去母液，用冷乙醇洗滌，50℃下真空干燥，得到純度為99％的香草醛乳白色或淡棕色的結(jié)晶體。
本發(fā)明的目的是提供一種有效的微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化天然原料生產(chǎn)香草酸和香草醛的方法。本發(fā)明采用微生物水解以環(huán)木菠蘿醇類阿魏酸酯和甾醇類阿魏酸酯為主要成分的米糠油加工皂腳，直接作為發(fā)酵原料，或用其生產(chǎn)阿魏酸或含阿魏酸的溶液，進(jìn)而作為微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香草酸、香草醛的原料。通過(guò)兩種微生物的連貫轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天然香草醛，即用黑曲霉Asp.Niger CGMCC 0774或其突變株水解油腳制備阿魏酸，并將其轉(zhuǎn)化為香草酸。含香草酸的發(fā)酵轉(zhuǎn)化液經(jīng)過(guò)膜處理去除微生物菌絲體后，用培養(yǎng)好的朱紅密孔菌P.cinnabarinus CGMCC1115或其突變株進(jìn)行還原轉(zhuǎn)化，為消除產(chǎn)物香草醛對(duì)細(xì)胞和酶的毒害作用，轉(zhuǎn)化過(guò)程中采用水/有機(jī)溶劑雙相生物催化反應(yīng)，或加入吸附樹脂，生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物被萃取于有機(jī)溶劑中，或被吸附在樹脂上。通過(guò)乙醇洗脫，濃縮結(jié)晶，水重結(jié)晶，得到高純度的香草醛。
中國(guó)富產(chǎn)稻谷，谷制米的副產(chǎn)品米糠，一般占稻谷的5-8％，年產(chǎn)米糠1,000多萬(wàn)噸，米糠資源豐富。米糠可用于提取一系列具有保健功能的化學(xué)物質(zhì)，如功能性油脂、谷維素、γ-谷維醇、菲丁(植酸鈣鎂)、植酸、肌醇、VB、VE等，這些功能性成分具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、降膽固醇、殺菌、消炎、增強(qiáng)免疫力等功能。通過(guò)對(duì)米糠的綜合利用可以降低阿魏酸原料的生產(chǎn)成本。
本發(fā)明利用微生物對(duì)天然原料進(jìn)行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香草醛，反應(yīng)條件溫和，有害物質(zhì)含量低，產(chǎn)品安全可靠，對(duì)環(huán)境友好，并且不受種植業(yè)的影響，可大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短，用可再生的農(nóng)產(chǎn)品資源，替代煤焦油來(lái)源的苯基石化原料，可緩解合成香草醛的石化資源緊張問(wèn)題與制造過(guò)程中的環(huán)境污染問(wèn)題，有極其重要的社會(huì)意義。
本發(fā)明突出的特點(diǎn)(1)采用農(nóng)副產(chǎn)品加工副產(chǎn)物米糠為阿魏酸原料進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天然的香蘭素，即“生物香蘭素”(bio-vanillin)，利用可再生的農(nóng)產(chǎn)品資源，替代煤焦油來(lái)源的苯基石化原料，不僅用于食品安全可靠，可緩解合成香草醛的石化資源緊張問(wèn)題與制造過(guò)程中的環(huán)境污染問(wèn)題，并且原料成本也大幅度下降。
(2)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中采用反應(yīng)與分離耦聯(lián)技術(shù)，較好地解決了產(chǎn)物抑制問(wèn)題，特別是消除了香草醛對(duì)細(xì)胞和酶的毒害作用，使轉(zhuǎn)化產(chǎn)物濃度達(dá)1.8~4.0g/L，并有利于產(chǎn)物分離提取，減少提取成本與能耗。
(3)實(shí)現(xiàn)從阿魏酸到香草酸再到香草醛的兩種微生物的連貫轉(zhuǎn)化，與兩步法生產(chǎn)工藝相比，大大縮短生產(chǎn)流程和生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率。


圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
以下是說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)例，但不限于這些實(shí)例。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1從新鮮的生長(zhǎng)好的黑曲霉Asp.niger CGMCC 0774斜面刮下一定量的菌塊放在100mL裝有玻璃珠的無(wú)菌水中，在180r/min的轉(zhuǎn)速下打碎20min，得到的孢子液濃度約為106個(gè)/mL，按10％接種量接到800mL種子培養(yǎng)基中，30℃，170r/min培養(yǎng)2d，將種子液打碎20min，最后將種子液接入到經(jīng)120℃滅菌20～50分鐘、冷卻的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基組分為麥芽糖20g/L、酒石酸二銨10g/L、酵母膏2g/L、磷酸二氫鉀1g/L、氯化鈣5g/L、硫酸鎂0.5g/L，pH值為7.0。發(fā)酵條件為裝液量100ml/250ml三角瓶，接種量10％，35℃，搖瓶轉(zhuǎn)速120r/min。菌體培養(yǎng)生長(zhǎng)40小時(shí)后，添加米糠油皂腳溶液10g/100ml，計(jì)算其中含阿魏酸2.02g/100ml。培養(yǎng)液于37℃下繼續(xù)發(fā)酵水解反應(yīng)24小時(shí)，HPLC測(cè)定阿魏酸濃度為1.22g/100ml，香草酸濃度為0.68g/100ml。
實(shí)施例2按實(shí)施例1培養(yǎng)黑曲霉A5p niger CGMCC 0774，將種子液放在特定的接種瓶中，接入到裝有8L的實(shí)罐滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基中的15L發(fā)酵罐中，在37℃，200r/min，1vvm通氣量，0.1Mpa罐壓條件下菌體生長(zhǎng)44h，加入按實(shí)施例1得到的10g/L的無(wú)菌阿魏酸溶液(鈉鹽溶液，pH7.0)1L，在相同條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，定時(shí)取樣用薄層層析跟蹤，轉(zhuǎn)化34h時(shí)，阿魏酸基本耗盡，香草酸濃度為0.506g/L，相應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率為83.32％。生物量(菌體干重)可達(dá)到4.8g/L。
實(shí)施例3按實(shí)施例1培養(yǎng)黑曲霉Asp.niger CGMCC 0774，按10％接種量接到1.6L種子培養(yǎng)基中，30℃，170r/min培養(yǎng)2d，將種子液放在特定的接種瓶中接入裝有16L的實(shí)罐滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基中的25L發(fā)酵罐中，在37℃，200r/min，1vvm通氣量，0.1Mpa罐壓下進(jìn)行菌體生長(zhǎng)，生長(zhǎng)41h時(shí)，pH降到最低點(diǎn)pH3.1，加入按實(shí)施例1得到、經(jīng)濃縮或結(jié)晶調(diào)成的36g/L無(wú)菌阿魏酸鈉鹽溶液(pH7.0)1L，測(cè)得轉(zhuǎn)化液中阿魏酸濃度為2.0g/L，在相同的發(fā)酵罐條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化36h時(shí)，流加33g阿魏酸調(diào)成的無(wú)菌阿魏酸鈉鹽溶液(pH7.0)1L，測(cè)得轉(zhuǎn)化液中阿魏酸濃度為2.3g/L，繼續(xù)轉(zhuǎn)化。用HPLC跟蹤測(cè)定的底物和產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化72h時(shí)香草酸濃度2.24g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率64.6％。
實(shí)施例4將培養(yǎng)48h的朱紅密孔菌P.cinnabarinus CGMCC1115種子以10％接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的成份為葡萄糖20g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏10g/L，磷酸二氫鉀1g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鈣0.1g/L，培養(yǎng)基的起始pH7.0。在30℃，120r/min，裝液量100mL/250mL三角瓶中發(fā)酵培養(yǎng)48h，然后向其中加入1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L香草酸，轉(zhuǎn)化12h后，加入樹脂HZ802，繼續(xù)搖床轉(zhuǎn)化，48h后HPLC測(cè)定，結(jié)果見表1。由表1可見在底物濃度4g/L時(shí)香草醛達(dá)2.197g/L，mol轉(zhuǎn)化率為60.69％；5g/L香草酸和25g樹脂條件下，最高香草醛產(chǎn)2.498g/L，mol轉(zhuǎn)化率是55％，延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間至72h，香草醛產(chǎn)量達(dá)2.787g/L，mol轉(zhuǎn)化率為61.59％。
表1 不同底物濃度轉(zhuǎn)化48小時(shí)的香草醛產(chǎn)量

實(shí)施例5在25L發(fā)酵罐中裝發(fā)酵液16L，以10％種量接入按實(shí)施例4培養(yǎng)的朱紅密孔菌P.cinnabarinusCGMCC1115，溫度30℃、罐壓0.1Mpa，轉(zhuǎn)速100r/min，通氣量1∶1vvm，菌體生長(zhǎng)48h時(shí)，pH降至最低點(diǎn)pH2.9，加入終濃度2g/L的香草酸溶液，溫度升為35℃，通氣量降為0.3vvm，轉(zhuǎn)化12h后以10％(質(zhì)量體積比)加入樹脂HZ802，轉(zhuǎn)化57h時(shí)，轉(zhuǎn)化達(dá)到最高值1.446g/L，轉(zhuǎn)化率為79.9％。
實(shí)施例6黑曲霉Aspergillus nigerCGMCC 0774種子培養(yǎng)2天，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，再加入含有環(huán)木菠蘿醇類阿魏酸酯和甾醇類阿魏酸酯為主要成分的米糠油皂腳溶液，計(jì)算其加阿魏酸量為4g/L，在37℃，150r/min繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化2天，得到含香草酸為1.960g/L，殘留的阿魏酸為0.897g/L的轉(zhuǎn)化液，調(diào)pH5.0，補(bǔ)加終濃度為5.0g/L的葡萄糖，滅菌后，以10％的菌體量接入按實(shí)施例4發(fā)酵培養(yǎng)48h的朱紅密孔菌P.cinnabarinus CGMCC1115菌絲體轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中加入樹脂HZ802，轉(zhuǎn)化50小時(shí)產(chǎn)香草醛最高為1.066g/L，對(duì)香草酸摩爾轉(zhuǎn)化率60.1％，對(duì)阿魏酸的摩爾轉(zhuǎn)化率34.01％。
實(shí)施例7按實(shí)施例5方法，培養(yǎng)朱紅密孔菌P.cinnabarinus CGMCC1115，將發(fā)酵培養(yǎng)48h的朱紅密孔菌菌絲體1g接入含香草酸3.980g/L的轉(zhuǎn)化液100mL(含5g/L葡萄糖，pH4.5)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，反應(yīng)中添加100mL如表2所示的各種有機(jī)溶劑，形成水/有機(jī)溶劑兩相生物反應(yīng)體系，35℃，180r/min振蕩轉(zhuǎn)化，不斷生成的香草醛被萃取于有機(jī)相中，24h后結(jié)束反應(yīng)，其結(jié)果見表2。其中正己烷中香草醛濃度達(dá)到3.08g/L，對(duì)香草酸的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到70.00％。
表2 有機(jī)溶劑對(duì)P.cinnabarnus CGMCC1115轉(zhuǎn)化香草酸生成香草醛的影響

實(shí)施例8按實(shí)施例6在25L發(fā)酵罐中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，取罐中吸附香草醛的樹脂299g，用95％乙醇浸泡洗脫，收集得到1860ml洗脫液，HPLC測(cè)定香草醛1.865g/L，溶液50℃真空濃縮至約170ml，測(cè)定含香草醛2.60g，乙酸乙酯萃取三次，飽和氯化鈉和無(wú)水硫酸鎂脫水后，得乙酸乙酯溶液480ml，測(cè)定含量5.474g/L，35℃真空濃縮至粘稠液，慢慢形成黃棕色粉狀晶體，35℃烘干得到2.89g粗結(jié)晶，HPLC測(cè)定其純度77％。取粗結(jié)晶1.89g，加12倍量85℃熱乙醇-水(乙醇∶水＝1∶1)溶解，調(diào)pH7.0，冷卻，去除先析出的棕色油狀物，再冷卻析出晶體，經(jīng)過(guò)濾烘干后得到淡棕色結(jié)晶，HPLC測(cè)定含量95％，重復(fù)進(jìn)行二次重結(jié)晶得到0.87g乳白色結(jié)晶，HPLC測(cè)定其純度為99.01％。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)香草酸和香草醛的方法，依次包括以下步驟(1)黑曲霉菌株Aspergillus nige CGMCC0774在發(fā)酵罐中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，發(fā)酵30-50h時(shí)；(2)一次或分次添加含阿魏酸的米糠油皂腳溶液，使發(fā)酵液中阿魏酸的終濃度為1～5g/L，轉(zhuǎn)化24～80h，得到含香草酸轉(zhuǎn)化液；(3)含香草酸轉(zhuǎn)化液進(jìn)行膜過(guò)濾除去菌絲體，調(diào)pH4～6，并補(bǔ)加1～15g/L的葡萄糖后，高溫滅菌；(4)朱紅密孔菌Pycnoporus cinnabarinus CGMCC1115或其突變株在發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵24～72h，獲得濕菌絲體；(5)濕菌絲體以10％的比率與處理過(guò)的含香草酸轉(zhuǎn)化液混合，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)生成香草醛液，反應(yīng)時(shí)間24～80h；(6)從香草醛液中提取香草醛。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程中添加2～20％的孔徑范圍為80～200的大孔樹脂或20～80％的有機(jī)溶劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以米糠油加工過(guò)程產(chǎn)生的廢棄物(皂腳)為原料，通過(guò)微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香草酸與香草醛的方法。該方法利用發(fā)明人篩選并保藏的微生物菌株黑曲霉菌(Aspergillus niger)CGMCC 0774水解米糠油皂腳中的阿魏酸酯產(chǎn)生阿魏酸，并將其轉(zhuǎn)化成香草酸，繼而利用另一株朱紅密孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)CGMCC 1115將香草酸轉(zhuǎn)化為香草醛。采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)香草醛，充分利用了稻米加工的廢棄資源，緩解化學(xué)合成香草醛制造過(guò)程中對(duì)環(huán)境的污染。
文檔編號(hào)C12R1/685GK1824783SQ20051007719
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日
發(fā)明者孫志浩, 鄭璞, 過(guò)鑫富, 林關(guān)羽, 殷杭華, 汪軍, 白彥兵 申請(qǐng)人:江南大學(xué), 浙江杭州鑫富藥業(yè)股份有限公司