耐熱耐酸的α-淀粉酶基因工程菌重組酶及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種耐熱耐酸的α-淀粉酶基因工程菌重組酶及應(yīng)用方法，屬于食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】。方法包括基因工程重組、轉(zhuǎn)化、發(fā)酵工藝優(yōu)化、酶活力測定。優(yōu)點(diǎn)是酶活力高，耐受的溫度高，耐受的酸堿度寬，使用方便。
【專利說明】
耐熱耐酸的Cl-淀粉酶基因工程菌重組酶及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】，是生物技術(shù)在食品酶學(xué)方面的探索性應(yīng)用研究。

【背景技術(shù)】
[0002]耐高溫α -淀粉酶屬于水解酶類，能隨機(jī)水解淀粉、糖原及降解物內(nèi)部的a -D-1,4糖苷鍵。它能使淀粉溶液的粘度迅速下降，產(chǎn)生可溶性糊精、低聚糖及少量麥芽糖、葡萄糖。目前以α-淀粉酶為代表的工業(yè)酶制劑類已占據(jù)25%的市場份額，廣泛地用于淀粉水解生成葡萄糖漿的液化，釀造、改性淀粉以及改善面粉的烘焙過程。微生物中有數(shù)百種嗜熱真菌和上千種細(xì)菌可以產(chǎn)生淀粉酶，僅芽孢桿菌屬{Bacillus)就有48個(gè)種能產(chǎn)生淀粉酶，但是產(chǎn)生高溫淀粉酶的微生物較少。地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)是公認(rèn)的產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的優(yōu)良菌種，但菌種本身是通過多代誘變而得到的高產(chǎn)菌株，存在著產(chǎn)酶條件不穩(wěn)定、易發(fā)生回復(fù)突變、發(fā)酵條件難控制、酶生產(chǎn)易污染等不足。早在20世紀(jì)70年代就開始了基因工程表達(dá)耐高溫α-淀粉酶的研究。巴斯德畢赤酵母{Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是目前最優(yōu)秀、應(yīng)用最廣泛的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一，操作簡單，表達(dá)量高，具有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和其它酵母表達(dá)系統(tǒng)無法比擬的優(yōu)越之處。
[0003]為尋求適于工業(yè)生產(chǎn)的耐高溫α-淀粉酶產(chǎn)生菌及其發(fā)酵條件，有必要經(jīng)過一系列的技術(shù)方法改造獲得真正意義的用于工業(yè)生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株，生物技術(shù)便是手段之一。本發(fā)明利用自主構(gòu)建的地衣芽孢桿菌耐高溫α -淀粉酶的重組畢赤酵母(P.pastorisGS115)基因工程菌，通過優(yōu)化發(fā)酵條件來提高酶產(chǎn)量和酶活性，降低生產(chǎn)成本，為工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供耐熱耐酸的α -淀粉酶基因工程菌重組酶及應(yīng)用方法。該方法簡單，制備的α -淀粉酶基因工程菌重組酶純度高，活性高，耐受酸堿度寬。
[0005](I)表達(dá)載體,所用的酵母分泌型表達(dá)載體為pPICZ a A、pPIC9購自Invitrogen公司。
[0006](2) α -淀粉酶基因工程菌重組所用的引物:
Upstream primer 2:5 ‘-GAATTCGCGACCTTGGATTCATGGTT-3’
Downstreamprimer3:5 ‘-GCGGCCGCACTATAGCGAAATGGATTGAG-3’
(3)將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到酵母表達(dá)載體，并用內(nèi)切酶和#0(1進(jìn)行雙酶切進(jìn)行鑒定正確連接。
[0007](4)進(jìn)行接種量、甲醇添加量、pH、誘導(dǎo)時(shí)間對耐高溫α -淀粉酶酶活的影響，篩選并確定最佳的發(fā)酵條件。
[0008](5)根改善酶活條件，使用CaCl2和MgCl2復(fù)合體系活性提高。

【具體實(shí)施方式】
實(shí)施例
[0009]I通過RT-PCR反應(yīng)，成功地克隆淀粉酶的結(jié)構(gòu)基因，然后成功構(gòu)建酵母分泌表達(dá)載體，篩選到5株淀粉酶表達(dá)量和酶活相對較高的重組酵母菌。
[0010]2取凍存于-20 °C的地衣芽孢桿菌耐高溫α-淀粉酶的重組畢赤酵母(ApaWorisGSllS)基因工程菌將其接種到新鮮的YH)培養(yǎng)基中30 °C >200 r/min搖瓶培養(yǎng)約14 h，觀察菌液出現(xiàn)渾濁時(shí)再以3%的接種量轉(zhuǎn)接到BMGY培養(yǎng)基中30 °C>150 r/min培養(yǎng)24 h，離心棄上清，菌體沉淀轉(zhuǎn)接到BMMY中，30 °C >200 r/min發(fā)酵，每隔24 h補(bǔ)加甲醇使其終濃度為0.4% (每瓶均為100 mL培養(yǎng)基裝于500 mL錐形瓶中)。培養(yǎng)72 h離心發(fā)酵液(4 0C , 10000 r/min, 20 min)，上清即為粗酶液，然后測定酶活性。
[0011]3接種量對耐高溫α -淀粉酶酶活的影響
菌液密度0D600達(dá)到5.0后，分別將25、50、100、200、250 mL BMGY培養(yǎng)基上生長的菌體3 000 r/min，離心15 min，菌體沉淀依次接種到100 mL，接種量150mL/100Ml,含有0.4%甲醇的BMMY培養(yǎng)基上，每隔24 h補(bǔ)加甲醇使其終濃度為0.4%，培養(yǎng)72 h，檢測菌體生長密度及耐高溫α-淀粉酶的酶活性。
[0012]4甲醇添加量對耐高溫α -淀粉酶酶活的影響
將100 mL BMGY培養(yǎng)基中的菌體沉淀分別轉(zhuǎn)接到100 mL含有甲醇百分比濃度為0.2、0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1.0的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后分別補(bǔ)加相同濃度的甲醇，誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后收獲發(fā)酵液，檢測菌體生長密度及耐高溫α-淀粉酶的酶活性。
[0013]5ρΗ對耐高溫α -淀粉酶酶活的影響及最適pH值的確定
以0.1 mo I/L的Na2HPO4-NaH2PO4為緩沖液，將100 mL生長培養(yǎng)基中的菌體沉淀分別接入100 mL，pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，含甲醇0.4%的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后收獲發(fā)酵液，檢測菌體生長密度及耐高溫α-淀粉酶的酶活性，確定酶的最適pH值。
[0014]6誘導(dǎo)時(shí)間對耐高溫α -淀粉酶酶活的影響
將100 mL BMGY培養(yǎng)中的基菌體2 000 r/min, 15min離心,菌體沉淀接入100 mL, pH為6.0，含甲醇0.4%的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)108 h，誘導(dǎo)24 h后每隔12 h取樣一次，檢測菌體生長密度及耐高溫α-淀粉酶的酶活性。
[0015]7 酶活
根據(jù)權(quán)利要求1d所述的改善酶活條件，其特征在于使用CaCl2和MgCl2復(fù)合體系活性提高，提高的條件為，加入CaCl2和MgCl2溶液，使Ca2+終濃度為0.08?0.12 mol/L, Mg2+終濃度為0.04?0.06 mol/L，在20?25°C下活力提高11%。
【權(quán)利要求】
1.本發(fā)明涉及耐熱耐酸的α-淀粉酶基因工程菌重組酶及應(yīng)用方法，其特征在于所述方法包括下述步驟: a地衣芽孢桿菌的基因組為模版，首先通過PCR擴(kuò)增出目的基因，然后通過雙酶切，載體連接及電轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建重組酵母工程菌； b對重組酵母工程菌的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化； c對重組表達(dá)的淀粉酶的耐受的最高溫度和最適的pH條件進(jìn)行測定； d使用CaCl2和MgCl2復(fù)合體系改善耐高溫淀粉酶的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1a所述的地衣芽孢桿菌的基因組，其特征在于獲得地衣芽孢桿菌的結(jié)構(gòu)基因，要求包括酶所有的活性中心的氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1b所述的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，其特征在于依次對接種量、甲醇添加量、耐受PH范圍、誘導(dǎo)時(shí)間對耐高溫α-淀粉酶酶活的影響，篩選并確定最佳的發(fā)酵條件:接種量150mL/100mL、甲醇添加量0.4%、pH耐受范圍4.5-9.4、誘導(dǎo)時(shí)間72h。
4.此時(shí)耐高溫α-淀粉酶酶活為228.0U/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1c所述對耐受的最高溫度和最適的PH條件進(jìn)行測定，其特征在于:耐受的最高溫度為95、20min,最適pH為6.1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1d所述的改善酶活條件，其特征在于使用CaCl2和MgCl2復(fù)合體系活性提高，提高的條件為，加入CaCl2和MgCl2溶液，使Ca2+終濃度為0.08、.12 mol/L,Mg2+終濃度為0.04?0.06 mol/L，在20?25°C下活力提高11%。
【文檔編號】C12R1/84GK104419690SQ201310403265
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月9日
【發(fā)明者】孟憲梅, 潘風(fēng)光, 柳增善 申請人:吉林工商學(xué)院