枯草芽孢桿菌x3及其在降低水牛糞便硫化氫生成中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了枯草芽孢桿菌X3及其在降低水牛糞便硫化氫生成中的應(yīng)用?？莶菅挎邨U菌X3(Bacillus?subtilis?X3)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2013年06月16日，編號為CCTCC?NO:M2013261，保藏地址：中國·武漢·武漢大學(xué)。以水牛養(yǎng)殖場內(nèi)土壤等作為菌株分離來源，對枯草芽孢桿菌X3(Bacillus?subtilis?X3)于37℃下培養(yǎng)24小時后，按20%（W/W）的比例直接接種到裝有水牛糞便的密閉燒杯中，室溫下培養(yǎng)2～8天，使硫化氫降低。與添加等比例無菌水的對照組相比，枯草芽孢桿菌X3能降低水牛糞便中硫化氫生成19.59%～52.74%，具有效率高、營養(yǎng)要求低、操作簡單、安全性高優(yōu)點。
【專利說明】枯草芽孢桿菌X3及其在降低水牛糞便硫化氫生成中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株可降低水牛糞便中硫化氫氣體生成的新菌株枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)及其在降低糞便硫化氫生成中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，規(guī)?；B(yǎng)殖比例不斷增加，在滿足日漸提高的畜禽產(chǎn)品需求和改善人民生活水平的同時，也帶來了一系列的生態(tài)問題。家畜糞尿在產(chǎn)生、處理、存放和排放過程會產(chǎn)生大量的惡臭物質(zhì)，這些惡臭物質(zhì)成分復(fù)雜，主要含有氨、硫化物、胺類和揮發(fā)性脂肪酸等化學(xué)物質(zhì)。惡臭是指一切刺激嗅覺器官引起人們不愉快和損壞生物環(huán)境的物質(zhì)。惡臭作為7種典型公害之一(大氣污染、水質(zhì)污染、惡臭、土壤污染、噪聲、振動、土地下沉)，其物質(zhì)種類繁多，影響范圍大，并且嚴(yán)重危害人體健康，它對人體的毒害是多方面的:(1)危害神經(jīng)系統(tǒng)。長期受到一種或幾種低濃度的惡臭物質(zhì)刺激，首先使嗅覺脫失，繼而導(dǎo)致大腦皮層興奮與抑制過程的調(diào)節(jié)功能失調(diào)。有的惡臭物質(zhì)，如硫化氫不僅有異臭作用，同時也對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒作用；(2)危害呼吸系統(tǒng)。當(dāng)人們嗅到臭氣時，會反射性地抑制吸氣，妨礙正常呼吸功能；(3)危害循環(huán)系統(tǒng)。如氨等刺激性臭氣，會使血壓出現(xiàn)先下降后上升，脈搏先減慢后加快的變化。硫化氫還能阻礙氧的輸送，而造成體內(nèi)缺氧；(4)危害消化系統(tǒng)。經(jīng)常接觸惡臭物質(zhì)，使人食欲不振與惡心，進(jìn)而發(fā)展成為消化功能減退；(5)惡臭會使內(nèi)分泌系統(tǒng)的分泌功能紊亂，而影響機(jī)體的代謝活動。此外氨和醛類對眼睛有刺激作用，常引起流淚、疼痛、結(jié)膜炎、角膜浮腫；(6)臭味還會阻礙人際關(guān)系的良好發(fā)展，影響個人、家庭或某一場所的外在形象。長期受到惡臭的持續(xù)作用會使人煩躁、憂郁、失眠、注意力不集中、記憶減退，從而使學(xué)習(xí)和工作效率降低。由于臭味對人體感觀和健康的影響，引起世界各國的普遍重視，有關(guān)除臭技術(shù)的研究已成為環(huán)境治理工程中的一個重要的環(huán)節(jié)。
[0003]目前，對于臭味的去除方法主要有:(I)化學(xué)除臭法(氧化法，吸收法，吸附法)包括燃燒法(熱力燃燒，催化燃燒)；(2)物理除臭法，如掩避法，稀釋擴(kuò)散法等；(3)生物除臭法，主要是利用微生物除臭，通過微生物的生理代謝將具有臭味的物質(zhì)加以轉(zhuǎn)化。對于大流量、低濃度的揮發(fā)性有機(jī)廢氣和惡臭氣體，使用物理和化學(xué)法處理存在投資大、操作復(fù)雜、運行成本高的問題。早在1957年，美國就報道了利用土壤脫臭法處理硫化氫的專利。生物除臭方法因其具有適用范圍廣、處理效率高、無二次污染、所需設(shè)備簡單、便于操作、運行成本低、環(huán)境負(fù)荷低和維護(hù)管理簡單方便的特點，可廣泛應(yīng)用于污水處理廠、垃圾處理場、公園中的湖泊和水溝、畜牧養(yǎng)殖場等不同場所。在20世紀(jì)80年代末90年代初，生物除臭技術(shù)得到迅速發(fā)展，并逐漸發(fā)展成除臭技術(shù)的主流。它是一種利用微生物分解惡臭物質(zhì)使其無臭化、無害化的處理方法，因此也叫微生物除臭法。生物除臭法按處理方式分有生物過濾法、生物洗滌法、生物滴濾法等；按填充材料分有土壤除臭法、珍珠巖棉除臭法、堆肥除臭法、活性污泥除臭法、泥炭土除臭法和鋸末除臭法等。由于來自畜禽養(yǎng)殖或糞尿處理場的臭氣中最主要成分是氨氣和硫化氫，生物除臭法也正是源于此目的而發(fā)展起來的，所以這些方法對于消除氨氣和硫化氫的臭味最為有效。目前各國對牛糞等的處理方法不外乎采用厭氧消化，即沼氣發(fā)酵。而目前真正用微生物直接除去牛糞中，尤其是水牛糞便中所產(chǎn)生的臭氣味的研究報道尚少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一株可降低水牛糞便中硫化氫氣體生成的新菌株枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)及其在微生物降解硫化氫的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是:
[0006]1.枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3),保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2013年06月16日，編號為CCTCC N0:M2013261，保藏地址:中國?武漢?武漢大學(xué)。
[0007]本發(fā)明所提供的硫化氫降解菌分離自廣西壯族自治區(qū)水牛研究所的水牛養(yǎng)殖場附近草地土壤，命名枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)，經(jīng)形態(tài)特征及16SrRNA序列初步鑒定為_，目前尚無利用_降低水牛糞便中的硫化氫生成的報道。
[0008]菌株的形態(tài):桿狀，在固體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)24小時后菌落成乳白色,圓形,邊緣光滑，濕潤，菌落中間較厚，向四周逐漸變薄。
[0009]本菌株的獲得:從廣西壯族自治區(qū)水牛研究所的水牛養(yǎng)殖場附近草地土壤中取樣，通過初步，復(fù)篩，獲得具有降低水牛糞便硫化氫生成的純培養(yǎng)物，對該培養(yǎng)物進(jìn)行形態(tài)和16SrRNA鑒定，將其鑒定為 枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)。
[0010]本菌株的分離、篩選:將土壤樣品以10% (W/W)的比例接種于裝有新鮮水牛糞便的燒杯中，每種三個重復(fù)，用玻棒攪拌均勻，密閉，室溫下連續(xù)培養(yǎng)7天，每隔24h用感官法判定除臭效果。如有明顯除臭效果的處理，立即取樣稀釋進(jìn)行微生物分離純化實驗，即采用多次平板劃線法從具有明顯除臭效果的樣品中分離單個菌株，所用培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。
[0011]菌株的形態(tài):桿狀，在固體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)24小時后菌落成乳白色,圓形，邊緣光滑，濕潤，菌落中間較厚，向四周逐漸變薄。
[0012]菌株的16SrRNA序列測定:采用機(jī)械破壁法將X3菌株的DNA提取出來，經(jīng)純化后，選用引物 8f(5’ -CACGGATCCAGAGTTTGAT (C/T) (A/C) TGGCTCAG-3’)/1510r (5，-GTGAAGCTTACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3，)擴(kuò)增細(xì)菌的16SrRNA序列并送檢測序，利用Blast將所測得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16SrRNA基因序列進(jìn)行同源性比較分析，其同源性與GenBank數(shù)據(jù)庫中許多枯草芽孢桿菌的同源性在99%以上，所以將菌株X3命名為枯草芽孢桿菌 X3 (Bacillus subtilis X3),其 16SrRNA 序列如下(5，一 3’):
[0013]I tctgtccacc ttcggcggct ggctcctaaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa
[0014]61 actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc
[0015]121 tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa
[0016]181 ctgagaacag atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc
[0017]241 attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc
[0018]301 ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag[0019]361 atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca
[0020]421 accatgcacc acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga
[0021]481 ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg
[0022]541 cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg
[0023]601 gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc
[0024]661 atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc
[0025]721 ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta
[0026]781 cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt
[0027]841 tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc
[0028]901 gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc
[0029]961 tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtaccgc cctattcgaa
[0030]1021 cggtacttgt tcttccctaa caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc
[0031]1081 ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag
[0032]1141 gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat
[0033]1201 cgtcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa
[0034]1261 gtggtagccg aagccacctt ttatgtttga accatgcggt tcaaacaacc atccggtatt
[0035]1321 agccccggtt tcccggagtt atcccagtct tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc
[0036]1381 cgtccgccgc taacatcagg gagcaagctc ccatctgtcc gctcgacttg catgtattag
[0037]1441 gcacgcc
[0038]菌株的培養(yǎng):取配制好的枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)菌懸液2ml接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
[0039]菌株的保藏:與已滅菌40%甘油混勻后，于_20°C冰箱中保存。
[0040]本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)在微生物降低硫化氫中的應(yīng)用。
[0041]將50g牛糞加入1000ml塑料大燒杯中，按20%接種量接種菌株枯草芽孢桿菌X3培養(yǎng)液，以等量無菌水作為對照；在一個大燒杯放入盛有20ml鋅銨絡(luò)鹽溶液的小燒杯，用以吸收硫化氫(測定方法見附錄I)。大燒杯用兩層塑料膜和一層保鮮膜密封，做兩個重復(fù)，室溫下培養(yǎng)；每隔2天，取小燒杯檢測硫化氫的釋放量，連續(xù)8天。實驗證明，枯草芽孢桿菌 X3(Bacillus subtilis X3)(編號為 CCTCC N0:M2013261)能夠有效地降低 19.59% ~52.74%水牛糞便中的硫化氫氣體生成。
[0042]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:針對水牛糞便特點，本菌株具有高效降低硫化氫氣體生成的特點，且操作簡便，應(yīng)用前景廣闊。
【具體實施方式】
[0043]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明 作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0044]實施例1
[0045]枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3，編號為 CCTCC N0:M2013261)的分離。
[0046]枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3 編號為 CCTCC N0:M2013261)的分離包括樣品初篩和菌株分離兩部分:[0047]1.含高效除臭微生物的樣品來源初篩:
[0048](I)分別稱量牛場外下水道淤泥、魚塘水、牛場內(nèi)下水道淤泥、魚塘邊淤泥、草地干牛糞10g，放入離心管(注意:應(yīng)留出一小截空間不裝滿，避免冷凍后體積增大脹出)，-200C保存，每種樣品存放3管。
[0049](2)稱量20g新鮮牛糞加入培養(yǎng)皿。
[0050](3)稱量牛場外下水道淤泥、魚塘水、牛場內(nèi)下水道淤泥、魚塘邊淤泥、草地干牛糞、無菌水按10%(w/w)接種入裝有新鮮牛糞的培養(yǎng)皿，每種三個重復(fù)。玻棒攪拌均勻。
[0051](4)蓋好培養(yǎng)皿，室溫下培養(yǎng)。
[0052](5)計時觀察，每隔24h用感官法判定除臭效果(感官法判定除臭效果標(biāo)準(zhǔn)見表
I),連續(xù)7天。
[0053](6)如有明顯除臭效果的培養(yǎng)基，標(biāo)記。并立即取樣稀釋進(jìn)行微生物分離純化實驗。
[0054]表1感官法判定除臭效果標(biāo)準(zhǔn)
【權(quán)利要求】
1.枯草芽孢桿菌X3(Bacillus subtilis X3),保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏日期為2013年06月16日，編號為CCTCC N0:M2013261，保藏地址:中國.武漢.武漢大學(xué)。
2.如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌X3(Bacillus subtilis X3)_,其特征在于,所述的枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)特征為:桿狀，在固體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)24小時后菌落成乳白色，圓形，邊緣光滑，濕潤，菌落中間較厚，向四周逐漸變薄。
3.如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌X3(Bacillus subtilis X3)，其特征在于枯草芽抱桿菌 X3 (Bacillus subtilis X3)的 16SrRNA 序列如下(5，—3，):1 tctgtccacc ttcggcggct ggctcctaaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa
61 actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc
121 tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa
181 ctgagaacag atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc
241 attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc
301 ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag
361 atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca
421 accatgcacc acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga
481 ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg
541 cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg
601 gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc
661 atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc
721 ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta
781 cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt
841 tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc
901 gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc
961 tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtaccgc cctattcgaa
1021 cggtacttgt tct tccctaa caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc
1081 ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag
1141 gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat
1201 cgtcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa
1261 gtggtagccg aagccacctt ttatgtttga accatgcggt tcaaacaacc atccggtatt
1321 agccccggtt tcccggagtt atcccagtct tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc
1381 cgtccgccgc taacatcagg gagcaagctc ccatctgtcc gctcgacttg catgtattag
1441 gcacgcc 。
4.如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌X3(Bacillus subtilis X3)在微生物降解糞便中硫化氫的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌X3(Bacillus subtilis X3)在降低水牛糞便硫化氫生成中的應(yīng)用，其特征在于:對枯草芽孢桿菌X3 (Bacillus subtilis X3)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后接種于糞便中，使糞便中的硫化氫降低。
【文檔編號】C12R1/125GK103484402SQ201310403129
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】楊承劍, 李婉, 梁辛, 梁賢威, 韋升菊, 李舒露, 楊炳壯, 鄒彩霞, 李麗莉 申請人:廣西壯族自治區(qū)水牛研究所