專利名稱：一種重金屬離子特異性響應(yīng)的啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物啟動子領(lǐng)域，特別是關(guān)于植物中響應(yīng)重金屬離子的啟動子及該啟動子序列中的類金屬響應(yīng)元件。
背景技術(shù)：
重金屬有些是生物的必需的微量元素，但過量也會造成傷害，而非必需的重金屬則會造成生物體的損傷。通過用植物基因工程技術(shù)來開發(fā)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品能提高植物的重金屬的抗性，減少可食用植物的重金屬毒害，保護(hù)人類健康；提高某些植物的重金屬的富集能力，對治理重金屬污染具有重大的應(yīng)用價值。通過植物基因工程來達(dá)到上述目的影響因素有所用的結(jié)合或轉(zhuǎn)運重金屬離子的蛋白或多肽的目的基因，轉(zhuǎn)基因植物物種，轉(zhuǎn)基因的方法及所采用的控制目標(biāo)基因表達(dá)的啟動子等，其中最為關(guān)鍵的是啟動子的選擇。幾種重金屬誘導(dǎo)的啟動子及其金屬響應(yīng)元件在酵母，動物和一些植物中發(fā)現(xiàn)，但特異誘導(dǎo)啟動子在高等植物中目前還沒有克隆。目前克隆的重金屬誘導(dǎo)啟動子包括酵母的Cu2+誘導(dǎo)的金屬硫蛋白(metallothionein，MT)的啟動子(Wendy J et al.，1996.JBIC 1451-459)、Zn2+轉(zhuǎn)運蛋白基因的啟動子(Zhao HEide D，1996.J Bio Chem 27123203-23210)、老鼠的Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)基因的啟動子(Kim Y.H.，et al.1993.Gene 133267-271.)、老鼠金屬硫蛋白基因的啟動子(Stuart，G.W.et al.1985.Nature 317828-831)、煙草中的ParA基因的啟動子(Kusaba M et al.1996.Plant Physiol.111，11 61-1167)衣藻的CPX1和CYC6基因啟動子(Quinn J M和Merchant S 1995.Plant Cell 7623-638)。
目前雖然在通過植物基因工程技術(shù)提高了模式植物的重金屬的抗性或改變了重金屬的在植物中的分布，但總體來說還不是很理想，這與選擇的啟動子有極大的關(guān)系。目前在植物中經(jīng)常采用酵母銅金屬硫蛋白基因的啟動子，該啟動子僅對Cu2+響應(yīng)，而對其他種類的重金屬則沒有響應(yīng)。老鼠的金屬硫蛋白基因的啟動子在煙草中沒有活性(Maiti.，I.B.et al.，1991.Plant Sci.76，94-107)，組成型的啟動子花椰菜花葉病毒的35S啟動子(caMV35S)的活性在轉(zhuǎn)基因煙草中不受鎘的影響(Stefanov，I.J.et al.，1997.Plant Cell Reports16291-294)。重金屬特異誘導(dǎo)啟動子能夠控制金屬結(jié)合蛋白基因或金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白在重金屬存在的條件下，特異高效地表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因植物的重金屬耐受性或富集能力，從而避免組成型的啟動子持續(xù)表達(dá)對轉(zhuǎn)基因植物造成損傷或動物來源的金屬誘導(dǎo)啟動子在植物中沒有活性的弊端。
PvSR2基因是從菜豆中克隆出來的特異響應(yīng)重金屬離子的基因，而對其他脅迫如熱激、紫外輻射、病毒侵染則不響應(yīng)(Yuxiu Zhang，Tuan-yao Chaiet al.，2001.Plant Sci.161(4)783-790)。目前還沒有關(guān)于PvSR2基因啟動子研究的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供植物基因工程中的重金屬特異響應(yīng)的啟動子以及該啟動子中的類金屬響應(yīng)元件，本發(fā)明為今后開發(fā)具有抗重金屬或富集重金屬的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，為保護(hù)人類健康和防治重金屬污染環(huán)境奠定了基礎(chǔ)。
目前我們克隆了菜豆PvSR2基因的啟動子區(qū)，并對啟動子進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該啟動子的3個片段具有對重金屬響應(yīng)的能力，并鑒定出一個有金屬響應(yīng)能力的與在動物中發(fā)現(xiàn)的金屬響應(yīng)元件(metal responsive element，MRE)類似的類金屬響應(yīng)元件(MRE-like)。
在本發(fā)明的一個技術(shù)方案中，提供了菜豆PvSR2基因啟動子序列(圖1)中的三段不同片段，該三段序列為圖1序列中的-1161至+48位的序列(SEQ IDNO.2)，-687至+48位的序列(SEQ ID NO.3)1-281至+48位的序列(SEQ IDNO.4)序列。
這些序列都能在植物中作為啟動子，控制特異性響應(yīng)重金屬離子的基因的表達(dá)。該啟動子優(yōu)選用在煙草或擬南芥菜上。
在本發(fā)明的另一個技術(shù)方案中，提供了菜豆PvSR2基因啟動子中有金屬響應(yīng)能力的類金屬響應(yīng)元件(MRE-like)，該響應(yīng)元件具有核心序列TGCAGGCG(SEQ ID NO.5)。
應(yīng)用本發(fā)明的啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因開發(fā)基因工程產(chǎn)品，能提高植物的重金屬的抗性，減少重金屬在可食用植物中的累積；并能提高轉(zhuǎn)基因植物、微生物的重金屬富集能力，對治理重金屬污染具有重大的應(yīng)用價值。


圖1為PvSR2基因的啟動子區(qū)序列轉(zhuǎn)錄起始位點的堿基用下劃線表示并標(biāo)記為+1，推斷的翻譯起始位點密碼子(ATG)用下劃線標(biāo)定。推斷的TATA box，CAAT box，MRE-like和其他的順式元件用方框標(biāo)定，其中HSE為熱激響應(yīng)元件，ABRE為干旱脅迫響應(yīng)元件，MRE為類金屬響應(yīng)元件，AuxRE為生長素響應(yīng)元件，I-box，GATAbox為光響應(yīng)元件；圖2為PvSR2基因啟動子5`缺失分析其中，+添加15μM Hg2+；-沒有添加15μM Hg2+；實驗數(shù)據(jù)來自三次獨立實驗，數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。GUS酶活用nmol[對-硝基苯酚]/min/mg蛋白質(zhì)表示。圖的左側(cè)為缺失分析所用質(zhì)粒載體的表達(dá)框示意圖，其中MRE-like元件用黑框標(biāo)出，GUS報告基因的編碼區(qū)、終止子區(qū)和5`非翻譯區(qū)分別用GUS、NOS和5`-UTR表示。
圖3A為MRE-like元件的功能分析，pBMRE和pBmMRE的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3B為添加HgCl2的pBMRE和pBmMRE的瞬時表達(dá)分析；圖3C為添加ZnCl2的pBMRE和pBmMRE的瞬時表達(dá)分析；圖4為T0-8株系的Southern雜交分析其中+探針陽性對照；-野生型煙草基因組DNA的陰性對照；HHindIII；EEcoRIXXbaI圖5A為T0-8株系T1代小苗對不同的重金屬離子的響應(yīng)能力；圖5B為T0-8株系T1代小苗對不同的濃度的Cu2+的響應(yīng)能力；圖5C為T0-8株系T1代小苗對不同的器官類型的響應(yīng)能力圖6T0-8T1代小苗的對不同種類的重金屬的響應(yīng)的組織染色分析具體實施方式
實施例1植物材料的培養(yǎng)無菌煙草苗(Nicotiana tabacum，W38)生長在MS培養(yǎng)基，在16h光照(25℃)/8h黑暗條件下培養(yǎng)。擬南芥菜(Arabidopsis thaliana，Columbiaecotype)種子表面消毒后在附加2％蔗糖的1/2MS中生長。菜豆(Phaseolusvulgaris L.cv.Saxa)種子表面消毒后生長在土盆中，生長條件為光照16h(22℃)/8h黑暗條件下培養(yǎng)。當(dāng)兩片初葉展開時，用0.2％(w/v)HgCl2.噴葉片。
實施例2菜豆PvSR2基因啟動子區(qū)克隆步驟1DNA步行獲得基因上游調(diào)控區(qū)菜豆的基因組DNA用CTAB法提取，PvSR2基因的5`上游區(qū)的克隆按照寶生物工程公司的In vitro Cloning kit說明書進(jìn)行。簡述如下分離的菜豆的基因組DNA用PstI、HindIII和EcoRI三種限制性內(nèi)切酶分別完全消化后，經(jīng)乙醇沉淀回收后與試劑盒中提供的帶有相應(yīng)酶切位點和引物C1和C2的接頭連接。接著用根據(jù)PvSR2基因設(shè)計的基因特異引物1(gene-specific primerl，GSP1見表1)和接頭上的的引物C1(試劑盒自帶的引物)進(jìn)行第一次擴增，接著將擴增產(chǎn)物稀釋100倍后進(jìn)行巢式PCR，所用引物為位于GSP1和C1內(nèi)側(cè)的引物GSP2(gene-specific primer2，GSP2見表1)和接頭上的引物C2(試劑盒自帶的引物)。將特異擴增條帶回收后克隆在pMD18T-vector上并測序(上海生物工程公司)，將該質(zhì)粒命名為pUC-MRP。測序表明從PstI酶切的DNA中經(jīng)過DNA步行獲得了PvSR2基因的上游2188bp的片斷，即PvSR2基因上游序列。
步驟25`-RACE確定轉(zhuǎn)錄起始位點用RNAgent Total RNA Isolation System(promega)提取噴施0.2％(w/v)HgCl26h的菜豆葉片的總RNA。5`-RACE按照SMARTMRACE cDNAAmplification kit(Clontech Laboratories)操作說明書進(jìn)行。簡述如下200ng總RNA用PvSR2 cDNA序列設(shè)計的基因特異反轉(zhuǎn)錄引物(RGSP，見表1)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取2.5μl cDNA進(jìn)行PCR，所用引物為RGSP(序列見表1)和試劑盒提供UPM(universal primer mix)引物。PCR產(chǎn)物克隆到T-easy vector(Promega公司)上并測序，四個獨立陽性克隆被選擇測序(上海生物工程公司)，以更準(zhǔn)確地確定轉(zhuǎn)錄起始位點。測序表明該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點位于原來克隆的PvSR2cDNA5`端上游的119bp處的核苷酸A。綜合步驟1和步驟2獲得了1624bp的啟動子序列，序列如圖1所示。
實施例35`缺失分析啟動子區(qū)功能步驟1啟動子區(qū)-GUS報告基因融合表達(dá)載體的構(gòu)建將PvSR2啟動子區(qū)的5`端不同區(qū)的片斷與GUS報告基因連接形成融合基因。具體如下根據(jù)啟動子區(qū)設(shè)計引物(正義引物SP1，SP2，SP3，SP4，SP5和SP6，反義引物ASP)(具體序列見表1)，通過PCR分別擴增獲得長度分別為1.6，1.2，0.7，0.3，0.15和0.1kb的啟動子區(qū)，PCR擴增所用的模板為質(zhì)粒pUC-MRP，這些啟動子區(qū)缺失片段分別對應(yīng)與圖1的-1623至+48、-1161至+48、-687至+48、-281至+48、-146至+48和-90至+48。這些片斷PCR過程中兩端引進(jìn)了HindIII和XbaI酶切位點，將這些PCR產(chǎn)物用HindIII和XbaI酶切后回收，與同樣經(jīng)過HindIII和XbaI酶切回收的pBI221(Clontech公司)大片斷連接，以PvSR2啟動子區(qū)代替組成型啟動子CaMV35S啟動子，得到重組體。將各重組體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)篩選鑒定出陽性克隆啟動子區(qū)測序(上海生物工程公司)表明正確沒有突變堿基引入。最終獲得pBMRP1.6，pBMRP1.2，pBMRP0.7，pBMRP0.3，pBMRP0.15，和pBMRP0.1的一系列5`缺失的啟動子與GUS基因融合的表達(dá)載體。
表1

a表中數(shù)值代表引物的位置，以轉(zhuǎn)錄PvSR2基因的轉(zhuǎn)錄起始位點為+1。
步驟2煙草原生質(zhì)體的制備和PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草的原生質(zhì)體從三周的無菌苗的葉片中分離制備，pBMRP1.6，pBMRP1.2，pBMRP0.7、pBMRP0.3、pBMRP0.15、pBMRP0.1、pBI121和pBI101各20μg按照Negrutiu等1987年的PEG介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體(Negrutiu et al.1987，Plant Mol.Biol.8363-373)。轉(zhuǎn)化的煙草原生質(zhì)體用改良的MS液體培養(yǎng)基(含30g/l蔗糖，72.8g/l甘露醇，不含重金屬離子)培養(yǎng)，處理組添加15μM HgCl2，對照組不加15μM HgCl2。GUS基因前無任何啟動子的質(zhì)粒pBI101作為負(fù)對照和5`端有CaMV 35S啟動子的質(zhì)粒pBI221作為正對照。瞬時表達(dá)分析在轉(zhuǎn)化24h后進(jìn)行。每個質(zhì)粒做三個平行作處理。
步驟3GUS酶活性的測定100g離心1min收集轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的原生質(zhì)體細(xì)胞，然后用200μl GUS提取緩沖液(10mM EDTA，0.1％Triton X-100，0.1％SLS和10mmol/L β-巰基乙醇)重懸原生質(zhì)體沉淀，加少許滅菌石英砂，在蝸旋震蕩器上震蕩以破碎細(xì)胞。冰上放置10min，然后10000g離心5min，回收含GUS酶的粗提液，冰上備用。提前制備Sephadex G-25層析柱，使用前用新鮮配制的GUS提取緩沖液平衡柱子10min，而后1000g離心10min棄去流出液，將GUS酶的粗提液加到柱子頂端，然后置冰上，直到不含葉綠素的GUS酶粗提液流出，若還有葉綠素存在則重新過柱。蛋白濃度測定用Bradford法(1976)。GUS酶活性用Jefferson(1987)描述的分光光度法(Plant Mol Biol Rep 5387-405)，反應(yīng)底物用(對-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷酸PNPG)(sigma公司產(chǎn)品)。測量儀器用SmartSpecTM3000分光光度計(Bio-Rad).GUS酶活用nmol[對-硝基苯酚]/min/mg蛋白質(zhì)表示。GUS組織化學(xué)染色用Jefferson(1987)的染色法(Jeffersonet al.，1987.EMBO J.；63901-3907)底物用X-gluc。
步驟4分析數(shù)據(jù)分析不同長度的啟動子片段在HgCl2脅迫和對照條件下啟動GUS酶基因表達(dá)活性高低來衡量啟動子活性及對重金屬誘導(dǎo)活性等，確定金屬響應(yīng)元件的所在位置。如圖2所示，全長的啟動子在沒有重金屬誘導(dǎo)條件下能指導(dǎo)GUS基因表達(dá)，而在重金屬誘導(dǎo)下能提高GUS基因表達(dá)1.6倍，表現(xiàn)出重金屬誘導(dǎo)增強表達(dá)的活性，當(dāng)啟動子5`端缺失到-1161處時，在沒有重金屬誘導(dǎo)條件下表現(xiàn)出的GUS酶活性和負(fù)對照相當(dāng)，而在重金屬誘導(dǎo)下則表現(xiàn)出強烈的表達(dá)活性，因此是重金屬特異誘導(dǎo)子片段，進(jìn)一步缺失到-687和-281也同樣顯示出重金屬特異誘導(dǎo)活性。進(jìn)一步缺失135bp的序列到-146處時則表現(xiàn)出沒有重金屬誘導(dǎo)也能表達(dá)，而有重金屬誘導(dǎo)表達(dá)并沒有增強，說明-281到-146的135bp片段對啟動子響應(yīng)重金屬誘導(dǎo)是必須的。與動物金屬硫蛋基因啟動子中鑒定出的金屬響應(yīng)元件(MRE)相類似的類金屬響應(yīng)元件(MRE-like)也存在該區(qū)域內(nèi)。以上結(jié)果如圖2所示。
實施例4在穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因的煙草中分析735bp的PvSR2基因啟動子的活性步驟1植物表達(dá)載體的構(gòu)建將pBMRP0.7質(zhì)粒用HindIII和EcoRI酶切后回收含735bp啟動子區(qū)-GUS基因的表達(dá)框片段，然后與同樣經(jīng)過HindIII和EcoRI酶切回收的pBI121(Clontech公司)大片斷連接，以PvSR2啟動子區(qū)代替組成型啟動子CaMV35S啟動子，最終構(gòu)建成轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)載體pMRP0.7-GUS。
步驟2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草用凍融法將步驟1構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pMRP0.7-GUS導(dǎo)入到農(nóng)桿菌LBA4404(Agrobactenium tumefaciens)，然后采用Horsch等1985年的方法(Horsch et al.，1985，Science 227(4691)；1229-1231)將基因?qū)氲綗煵菁?xì)胞的基因組中，經(jīng)過誘導(dǎo)生芽、生根的等抗性選擇培養(yǎng)，用PCR的方法鑒定生根陽性苗。最后在溫室中將轉(zhuǎn)基因煙草土培，自花授粉獲得子一代種子。
步驟2單拷貝基因插入的轉(zhuǎn)基因株系的鑒定將子一代種子在含200mg/L的卡那霉素(Km)的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，計算綠色抗性小苗(轉(zhuǎn)基因)和白化小苗(非轉(zhuǎn)基因)的比例。共得到6株綠色小苗∶白化小苗≈3∶1，即符合單因子的孟德爾遺傳規(guī)律。從中隨機選取T0-8株系進(jìn)一步通過Southern雜交進(jìn)行鑒定結(jié)果每種酶切只有一條雜交帶出現(xiàn)，而野生型沒有雜交信號，證明該株系中轉(zhuǎn)入的基因只有一個拷貝(圖4)。
步驟4單拷貝基因插入的轉(zhuǎn)基因煙草小苗的重金屬誘導(dǎo)活性分析T0-8株系的子一代種子在不含重金屬離子的MS培養(yǎng)基(附加200mg/L的卡那霉素)中萌發(fā)后，將綠色陽性苗轉(zhuǎn)移到分別附加20μM的HgCl2，CdCl2，AgNO3，和Pb(NO)3；100μM的ZnSO4，CoCl2，CuSO4，和MnCl2的同樣的MS培養(yǎng)基中，或附加2.5，5，10，50和100μM CuSO4的同樣的MS培養(yǎng)基中，脅迫24小時后進(jìn)行GUS酶活性分析。以上每種重金屬脅迫每次1取10棵小苗，重復(fù)三次。
步驟5GUS酶活性的測定處理后的小苗用無菌水漂洗除去根上的培養(yǎng)基后，加200μl GUS提取緩沖液(10mM EDTA，0.1％Triton X-100，0.1％SLS和10mmol/L β-巰基乙醇)和少許滅菌石英砂，在蝸旋震蕩器上震蕩以破碎細(xì)胞。冰上放置10min，然后10000g離心5min，回收含GUS酶的粗提液，冰上備用。提前制備Sephadex G-25層析柱，使用前用新鮮配制的GUS提取緩沖液平衡柱子10min，而后1000g離心10min棄去流出液，將GUS酶的粗提液加到柱子頂端，然后置冰上，直到不含葉綠素的GUS酶粗提液流出，若還有葉綠素存在則重新過柱。蛋白濃度測定用Bradford法(1976)。GUS酶活性用Jefferson(1987)描述的分光光度法(Jefferson et al.1987，Plant Mol Biol Rep 5387-405)，反應(yīng)底物用(對-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷酸PNPG，sigma)。測量儀器用SmartSpecTM3000分光光度計(Bio-Rad).GUS酶活用nmol[對-硝基苯酚]/min/mg蛋白質(zhì)表示。GUS組織化學(xué)染色用Jefferson(1987)的染色法(Jefferson et al.，1987，EMBO J.；63901-3907)，底物用X-gluc。
步驟4分析數(shù)據(jù)含單拷貝插入735bp的啟動子-GUS報告基因的T0-8株系的子一代能響應(yīng)多種重金屬離子，在所測試的重金屬離子響應(yīng)的能力順序如下Ag+＞Zn2+＞Cd2+＞Hg2+＞Pb3+＞Co2+＞Mn2+＞Cu2+(參見圖5A)。不同濃度的Cu2+的啟動GUS基因的表達(dá)強度也不同，其中在2.5μM到100μM的濃度范圍內(nèi)，50μM誘導(dǎo)能力最強(參見圖5B)。在50μM的Cu2+誘導(dǎo)下，該啟動子活性表現(xiàn)為莖葉特異表達(dá)的模式(參見圖5C)。
對小苗進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色表明，在沒有重金屬誘導(dǎo)的小苗(對照)中沒有藍(lán)色出現(xiàn)，而在Ag+、Co2+、Cd2+、Al3+、Zn2+、Cu2+、Hg2+等重金屬離子誘導(dǎo)下出現(xiàn)明顯的藍(lán)色，從直觀上進(jìn)一步驗證了735bp啟動子片段能指導(dǎo)GUS報告基因響應(yīng)重金屬(參見圖6)。
實施例5啟動子區(qū)的類金屬響應(yīng)元件(MRE-like)的功能鑒定步驟1含類金屬響應(yīng)元件的表達(dá)載體的構(gòu)建將含有MRE-like在內(nèi)的25bp啟動子序列通過PCR的方法引入到CaMV35S((-82/+8，35SΔ82))基礎(chǔ)啟動子的5`端，所用的引物為35S-82F(5`CCC TAAGGGATGACGCACAA3`，下劃線處為HindIII酶切位點，方框處的堿基序列為25bp啟動子區(qū)，MRE-like元件用陰影表示)和35S-82R(5`GCTCTAGAGTCCCCCGTG3`，下劃線處為XbaI酶切位點)，所用的模板為CaMV35S啟動子片段。同樣，將含有突變的MRE-like在內(nèi)的25bp啟動子序列也通過PCR方法引入到CaMV35S(-82/+8，35SΔ82)基礎(chǔ)啟動子的5`端，所用的引物為35S-82mF(5`CCC TAAGGGATGACGCACAA3`下劃線處為HindIII酶切位點，方框處的堿基序列為25bp啟動子區(qū)，突變后的mMRE-like元件用陰影表示)和35S-82R。PCR產(chǎn)物用HindIII/XbaI酶切后，插入到經(jīng)過HindIII/XbaI酶切后回收的pBI221大片段，以取代CaMV 35S啟動子。測序(上海生物工程公司)表明插入序列正確。最終構(gòu)建成表達(dá)載體pBMRE和pBmMRE，其具體結(jié)構(gòu)參見圖3A。
步驟2煙草原生質(zhì)體的制備和PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草的原生質(zhì)體從三周的無菌苗的葉片中分離制備，pBMRE和pBmMRE各20μg按照Negrutiu等1987年的PEG介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體(Negrutiu et al.1987，Plant Mol.Biol.8363-373)。轉(zhuǎn)化的煙草原生質(zhì)體用改良的MS液體培養(yǎng)基(含30g/l蔗糖，72.8g/l甘露醇，不含重金屬離子)培養(yǎng)，處理組分別添加20μM HgCl2和50μM ZnCl2，對照組正常培養(yǎng)。瞬時表達(dá)分析在轉(zhuǎn)化24h后進(jìn)行。每個質(zhì)粒做三個平行作處理。
步驟3GUS酶活性測定方法同前實施例4步驟5所述。
步驟4數(shù)據(jù)分析根據(jù)未突變和突變的MRE-like元件對重金屬離子的響應(yīng)能力，來確定該元件的功能。在20μM HgCl2和50μM ZnCl2處理下，含未突變的MRE-like元件的pBMRE質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中啟動子能響應(yīng)重金屬誘導(dǎo)，活性分別增強1.8-和1.6倍，而含有突變的MRE-like元件的pBmMRE質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中啟動子則失去了響應(yīng)重金屬誘導(dǎo)能力，表現(xiàn)出活性受重金屬離子的抑制(圖3B和3C)。這些證據(jù)表明該元件能介導(dǎo)基礎(chǔ)啟動子的重金屬誘導(dǎo)活性。
權(quán)利要求
1.一種在植物中特異性響應(yīng)重金屬離子的類金屬響應(yīng)元件，該元件具有核心核苷酸序列TGCAGGCG。
2.權(quán)利要求1所述的類金屬響應(yīng)元件在植物中調(diào)控特異性響應(yīng)重金屬離子的基因的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中所述的植物為煙草或擬南芥菜。
4.一種在植物中特異性響應(yīng)重金屬離子的基因的啟動子序列，其中該啟動子序列包含權(quán)利要求1所述的響應(yīng)元件，啟動子序列為圖1中-1161至+48、或-687至+48序列，或-281至+48序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的啟動子序列，其中啟動子序列為圖1中的-281至+48序列。
6.權(quán)利要求4所述的啟動子序列作為植物中控制目的基因的重金屬誘導(dǎo)啟動子的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中所述的植物為煙草或擬南芥菜。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物中新的重金屬誘導(dǎo)的啟動子。本發(fā)明提供了菜豆重金屬誘導(dǎo)基因PvSR2基因的啟動子序列和一個經(jīng)驗證的類金屬響應(yīng)元件的序列。應(yīng)用本發(fā)明的啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因開發(fā)基因工程產(chǎn)品，能提高植物的重金屬的抗性，減少重金屬在可食用植物中的累積；并能提高轉(zhuǎn)基因植物、真核微生物的重金屬富集能力，對治理重金屬污染具有重大的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/82GK1884536SQ20051007745
公開日2006年12月27日 申請日期2005年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月23日
發(fā)明者柴團耀, 祁曉廷, 張玉秀 申請人:中國科學(xué)院研究生院