本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及高純度臍帶血干細(xì)胞的分離方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
臍帶血是胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)，臍帶血中含有可以重建人體造血和免疫系統(tǒng)的造血干細(xì)胞，可用于造血干細(xì)胞移植，治療80多種疾病。因此，臍帶血已成為造血干細(xì)胞的重要來源，特別是無血緣關(guān)系造血干細(xì)胞的來源。因此，臍帶血是一種非常重要的人類生物資源。
臍帶血中最重要的成分之一為臍帶血干細(xì)胞。因此，從臍帶血中分離或提取這些干細(xì)胞是臍帶血進(jìn)一步有效利用的重要前提。本申請的發(fā)明人在臍帶血分離方面一直進(jìn)行著深入研究，并且此前已公開了利用三種不同液體進(jìn)行干細(xì)胞分離的方法及試劑盒(參見，例如CN101638637A或CN102154201A)。然而這些技術(shù)的目的均在于提高獲得的產(chǎn)物的回收率和存活率，并沒有關(guān)注獲得的產(chǎn)物中有效干細(xì)胞的純度。
對于用于治療的干細(xì)胞，特別是直接用于注射的干細(xì)胞而言，存在雜質(zhì)是極其不利的，甚至是危險(xiǎn)的。因?yàn)楦杉?xì)胞中的雜質(zhì)會(huì)引起體內(nèi)產(chǎn)生排異反應(yīng)，這種情況在當(dāng)將干細(xì)胞輸入不同來源的個(gè)體時(shí)特別嚴(yán)重，而在臨床上異體輸入是通常情況。因此，在臍帶血提取的干細(xì)胞的過程中，不僅需要關(guān)注回收率和存活率，從安全角度，更需要關(guān)注臍帶血干細(xì)胞的純度。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究并發(fā)現(xiàn)，在通過常規(guī)細(xì)胞分層液使沉淀細(xì)胞分層得到的有核細(xì)胞中，存在部分功能受損的有核細(xì)胞以及部分衰老的紅細(xì)胞(本發(fā)明中也將這些細(xì)胞統(tǒng)稱為“雜質(zhì)細(xì)胞”)，這些細(xì)胞的密度比臍帶血中有效干細(xì)胞略輕。基于此密度差通過設(shè)計(jì)針對有核細(xì)胞的進(jìn)一步分離，從而得到更高純度的臍帶血干細(xì)胞。由此完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。
本發(fā)明的一方面，提供臍帶血干細(xì)胞的分離方法，其包括下列步驟：
稀釋步驟：將臍帶血樣品與細(xì)胞稀釋液混合；
沉淀步驟：加入沉淀劑，并靜置沉降以得到含有干細(xì)胞的上層細(xì)胞液，將所述含有干細(xì)胞的上層細(xì)胞液離心濃縮，得到細(xì)胞沉淀；
分層步驟：將所述細(xì)胞沉淀鋪在細(xì)胞分層液上離心，得到中間云霧狀有核細(xì)胞；
純化步驟：將所述有核細(xì)胞鋪在細(xì)胞純化液上離心，得到兩條細(xì)胞帶，取下方細(xì)胞帶中的細(xì)胞即為純化的干細(xì)胞；其中，
所述細(xì)胞稀釋液為PBS液或0.8-1.0重量％氯化鈉水溶液，
所述細(xì)胞沉淀劑為4-10重量％的羥乙基淀粉水溶液，
所述細(xì)胞分層液為由聚蔗糖和/或泛影葡胺配制成的密度為1.074-1.076g/ml的水溶液，
所述細(xì)胞純化液為由聚蔗糖配制成的密度為1.090-1.095g/ml的水溶液。
優(yōu)選地，所述細(xì)胞分層液中聚蔗糖和泛影葡胺的質(zhì)量比為0.8:1。
優(yōu)選地，所述細(xì)胞稀釋液為0.85-0.95重量％氯化鈉水溶液，更優(yōu)選所述細(xì)胞稀釋液為0.9重量％氯化鈉水溶液。
優(yōu)選地，所述細(xì)胞沉淀劑為5-7重量％的羥乙基淀粉水溶液，更優(yōu)選所述細(xì)胞沉淀劑為6重量％的羥乙基淀粉水溶液。
優(yōu)選地，所述臍帶血樣品與細(xì)胞稀釋液的體積比為0.8:1-1.2:1，更優(yōu)選所述臍帶血樣品與細(xì)胞稀釋劑的體積比為1:1。
優(yōu)選地，所述沉降的時(shí)間為5分鐘至3小時(shí)。
優(yōu)選地，所述沉淀步驟中的離心濃縮的轉(zhuǎn)速為2000-3000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為3-20分鐘。
優(yōu)選地，所述分層步驟中的離心濃縮的轉(zhuǎn)速為1800-2200轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為15-25分鐘。
優(yōu)選地，所述純化步驟中的離心轉(zhuǎn)速為1500-2000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為30-45分鐘。
本發(fā)明的另一方面還提供了臍帶血干細(xì)胞的分離試劑盒，其包括：
細(xì)胞稀釋液、沉淀劑、細(xì)胞分層液和細(xì)胞純化液；其中，所述細(xì)胞稀釋液為PBS液或0.8-1.0重量％氯化鈉水溶液，所述細(xì)胞沉淀劑為4-10重量％的羥乙基淀粉水溶液，所述細(xì)胞分層液為由聚蔗糖和/或泛影葡胺配制成的密度為1.074-1.076g/ml的水溶液，所述細(xì)胞純化液為由聚蔗糖配制成的密度為1.090-1.095g/ml的水溶液。
作為優(yōu)選地，其中所述的細(xì)胞分層液和/或細(xì)胞純化液包含腺嘌呤。
和其他方法相比，采用本發(fā)明提供的方法從臍帶血中分離出的干細(xì)胞中含有的造血干細(xì)胞的比例更高，且含有的雜質(zhì)細(xì)胞數(shù)更少，即純度更高，更容易在臨床特別是在干細(xì)胞治療上應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
通過解釋以下本申請的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)將變得清楚。
現(xiàn)詳細(xì)說明本發(fā)明的多種示例性實(shí)施方式，該詳細(xì)說明不應(yīng)認(rèn)為是對本發(fā)明的限制，而應(yīng)理解為是對本發(fā)明的某些方面、特性和實(shí)施方案的更詳細(xì)的描述。另外，對于本公開中的數(shù)值范圍，應(yīng)理解為還具體公開了該范圍的上限和下限之間的每個(gè)中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值以及任何其他陳述值或在所述范圍內(nèi)的中間值之間的每個(gè)較小的范圍也包括在本公開內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括或排除在范圍內(nèi)。
本發(fā)明中，所述的"臍帶血"是指哺乳動(dòng)物(例如，人類)胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液。在一個(gè)實(shí)施方案中，胎盤和臍帶可從動(dòng)物體分離后經(jīng)冷凍保存。在另一實(shí)施方案中，胎盤和臍帶為從動(dòng)物體分離的新鮮胎盤和臍帶。優(yōu)選地，胎盤和臍帶為從動(dòng)物例如人體分離后1-12小時(shí)，優(yōu)選1-5小時(shí)之內(nèi)的胎盤和臍帶。新鮮的胎盤和臍帶具有更多高活性的干細(xì)胞。因此，本發(fā)明的臍帶血優(yōu)選為新鮮胎盤和臍帶中的血液。另外，為了抗凝的目的，本發(fā)明的臍帶血也可包含枸櫞酸鈉和/或肝素。
本發(fā)明中，所述術(shù)語"有核細(xì)胞"是指通過分層液分離得到的不同細(xì)胞的組合，其中絕大部分細(xì)胞均為具有這完整細(xì)胞核的細(xì)胞，它們的密度范圍在1.083-1.100g/ml之間。本發(fā)明人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些有核細(xì)胞中可以進(jìn)一步細(xì)分出"有效干細(xì)胞"和"雜質(zhì)細(xì)胞"。關(guān)于兩類細(xì)胞如下所述。
其中"有效干細(xì)胞"是指對于干細(xì)胞治療有效的細(xì)胞的簡稱。通常，此類細(xì)胞中含豐富的造血干細(xì)胞(HSCs).的標(biāo)志物，即CD34(細(xì)胞表面的唾液粘蛋白)。此前的研究發(fā)現(xiàn)，從骨髓和外周血來源的CD34陽性富集的細(xì)胞群體顯出大部分的造血活性，被認(rèn)為是造血干細(xì)胞(HSCs).的標(biāo)志物。CD34在原始細(xì)胞分化為成熟細(xì)胞后表達(dá)下降。這點(diǎn)也發(fā)現(xiàn)存在于克隆的祖細(xì)胞和一些細(xì)胞系的干細(xì)胞。因此，CD34可以作為本發(fā)明中有效干細(xì)胞活性的標(biāo)識(shí)。
其次，"雜質(zhì)細(xì)胞"是指功能受損的有核細(xì)胞以及剛開始或即將開始衰老的紅細(xì)胞。通常情況下正常功能的紅細(xì)胞具有更低的密度，在沉淀步驟中，這些正常紅細(xì)胞會(huì)沉淀而分離，但剛開始或即將開始衰老的紅細(xì)胞具有更高的密度，且在該過程中不沉淀而與有核細(xì)胞一樣存在于中間云霧層中。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這些雜質(zhì)細(xì)胞的密度比臍帶血中有效干細(xì)胞略輕，通常為1.080左右。通過常規(guī)離心分離技術(shù)(例如，中國專利公布CN101638637A或CN102154201A中所述的技術(shù))即使在低速、長時(shí)間條件下也很難將這些雜質(zhì)細(xì)胞與有效干細(xì)胞分離開來。
本發(fā)明中，術(shù)語"細(xì)胞稀釋液"用于將臍帶血樣品進(jìn)行稀釋，從而獲得所需濃度或密度的血液樣品。優(yōu)選地，細(xì)胞稀釋液為0.85-0.95重量％，例如，0.89重量％、0.92重量％、0.95重量％、0.98重量％的氯化鈉水溶液，更優(yōu)選所述細(xì)胞稀釋液為0.9重量％氯化鈉水溶液，此溶液有時(shí)也稱作生理鹽水。
本發(fā)明中，所述術(shù)語"沉淀劑"為本領(lǐng)域內(nèi)通常使的物質(zhì)，例如羥乙基淀粉及其等同物質(zhì)的水溶液，關(guān)于羥乙基淀粉的濃度優(yōu)選為4-10重量％，更優(yōu)選為5-7重量％，進(jìn)一步優(yōu)選為6重量％。羥乙基淀粉可以直接在市場購買所得。沉淀劑的作用為結(jié)合紅細(xì)胞，使其重量增加，沉淀到細(xì)胞培養(yǎng)器皿的底部。
本發(fā)明中，所述術(shù)語"細(xì)胞分層液"為密度在1.074-1.076g/ml范圍內(nèi)的水溶液，優(yōu)選地，其由聚蔗糖和/或泛影葡胺配制而成，優(yōu)選密度為1.074g/ml、1.075g/ml，其中聚蔗糖和泛影葡胺的質(zhì)量比可以是任意的，只要能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明所述的密度即可。優(yōu)選地，聚蔗糖和泛影葡胺的質(zhì)量比為0.8:1。所述細(xì)胞分層液能夠利用各種細(xì)胞之間密度的差異來去除臍帶血中的紅細(xì)胞、血漿、血小板、血紅蛋白、粒細(xì)胞等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞分層液進(jìn)一步包含腺嘌呤。關(guān)于腺嘌呤的描述如下所述。
本發(fā)明中，所述術(shù)語"細(xì)胞純化液"為1.090-1.095g/ml的聚蔗糖水溶液。需要說明的是此密度是必要的，如果密度過低，則在細(xì)胞純化時(shí)，所需要的干細(xì)胞與雜質(zhì)細(xì)胞在離心時(shí)沉降過快，即使在低于1000轉(zhuǎn)/分的低速下離心難以將它們分開。另一方面，如果密度過高，則在低速旋轉(zhuǎn)時(shí)有效干細(xì)胞與雜質(zhì)細(xì)胞不能進(jìn)行沉降，另外，由于沉降速率相似，致使在高速旋轉(zhuǎn)時(shí)兩種細(xì)胞不能有效分開。因此，聚蔗糖水溶液在密度在1.090-1.095g/ml范圍內(nèi)是必要的，優(yōu)選的密度為1.091g/ml、1.092g/ml、1.093g/ml、1.094g/ml等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞純化液還可包含腺嘌呤。關(guān)于腺嘌呤的描述如下所述。
本發(fā)明中，所述"腺嘌呤"是體內(nèi)天然存在的一種物質(zhì)，分子式C5H4N4。其可以嘌呤核苷酸的形式使用。腺嘌呤的含量基于細(xì)胞分層液或細(xì)胞純化液的質(zhì)量為0.5-2重量％。優(yōu)選的含量為0.8-1.8重量％，更優(yōu)選1.0-1.5重量％，進(jìn)一步優(yōu)選1.2-1.4重量％。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的細(xì)胞分層液或細(xì)胞純化液中添加上述含量的腺嘌呤能夠更有效地保護(hù)得到的干細(xì)胞。其原因并不清楚，但是一種可能的原因在于在細(xì)胞呼吸中，腺嘌呤是富與能量的腺苷三磷酸(ATP)，與輔因子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等形式發(fā)生作用，并且在蛋白質(zhì)生物合成過程中作為DNA與RNA的組成物。過高或過低的腺嘌呤的含量的保護(hù)作用均是不利的。
本發(fā)明中，所述純化步驟中的離心轉(zhuǎn)速需要為1500-2000轉(zhuǎn)/分，且離心時(shí)間為30-45分鐘。例如，離心轉(zhuǎn)速需要為1800轉(zhuǎn)/分，且離心時(shí)間為35分鐘；離心轉(zhuǎn)速需要為2000轉(zhuǎn)/分，且離心時(shí)間為30分鐘等。需要說明的是，由于雜質(zhì)細(xì)胞與有效干細(xì)胞之間的密度差異非常小，因此保持轉(zhuǎn)速與時(shí)間之間的協(xié)同配合至關(guān)重要。轉(zhuǎn)速過快或過慢，或者時(shí)間過長或過短都不能有效的將雜質(zhì)細(xì)胞與有效干細(xì)胞進(jìn)行很好的分離。優(yōu)選地，離心轉(zhuǎn)速為1600-1800轉(zhuǎn)/分，且離心時(shí)間為32-40分鐘。更優(yōu)選離心轉(zhuǎn)速為1800轉(zhuǎn)/分，且離心時(shí)間為35分鐘。
本發(fā)明的方法中，所述稀釋步驟為將臍帶血樣品與細(xì)胞稀釋液混合，然后加入沉淀劑，并靜置沉降以得到含有干細(xì)胞的上層細(xì)胞液，其中所述混合可以是將臍帶血樣品添加到放置細(xì)胞稀釋液的容器中，也可以是將細(xì)胞稀釋液添加到放置臍帶血樣品的容器中，還可以是其他已知的混合方式；接觸時(shí)通常需要在較為溫和的條件下進(jìn)行，例如，在溫度能夠使細(xì)胞存活的各種溫度，優(yōu)選25℃-38℃，例如37℃，或在輕輕攪拌的條件下進(jìn)行等。
本發(fā)明的方法中，所述沉淀步驟為將適量的沉淀劑添加到含有臍帶血樣品和細(xì)胞稀釋液的容器中，容器可以是試管，也可以是其他常用的器皿。
本發(fā)明所述的臍帶血干細(xì)胞的分離試劑盒中，細(xì)胞稀釋液、沉淀劑、細(xì)胞分層液和細(xì)胞純化液優(yōu)選以獨(dú)立存在方式配置。例如，分別將細(xì)胞稀釋液、沉淀劑、細(xì)胞分層液和細(xì)胞純化液放置于不同的容器中，或者同一容器中獨(dú)立存在的空間內(nèi)。
本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包含其他試劑或成分或裝置。例如，用于移動(dòng)液體的裝置，例如吸液器等。這些其他試劑或成分或裝置是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可通過公開出版物容易地獲知。
優(yōu)選地，本發(fā)明中的試劑盒還進(jìn)一步包含使用說明書，其中在使用說明書中給出或教導(dǎo)了實(shí)施本發(fā)明所述方法或使用本發(fā)明所述試劑盒的指導(dǎo)、指引或教導(dǎo)。
實(shí)施例1
首先，將含有枸櫞酸鈉的50ml臍帶血樣品與50ml 0.9重量％氯化鈉水溶液混合形成混合液。
然后在上述混合液中加入6重量％的羥乙基淀粉水溶液并靜置沉降1小時(shí)以得到含有干細(xì)胞的上層細(xì)胞液，將所述含有干細(xì)胞的上層細(xì)胞液以2500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，得到細(xì)胞沉淀。將所述細(xì)胞沉淀鋪在由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為1.075g/ml的水溶液上進(jìn)行離心，其中聚蔗糖和泛影葡胺的質(zhì)量為0.8:1。然后以2000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，得到中間云霧狀干細(xì)胞層。取中間干細(xì)胞層，平鋪于另一試管的密度為1.092g/ml的聚蔗糖水溶液之上，以1700轉(zhuǎn)/分的離心轉(zhuǎn)速離心35分鐘，得到上下兩條細(xì)胞帶，取下方細(xì)胞帶分離，即為本發(fā)明所述的有效細(xì)胞。其中細(xì)胞情況如表1所示。
實(shí)施例2
除了在細(xì)胞純化液中加入1％的腺嘌呤以外，以與實(shí)施例1相同的方式制備有效細(xì)胞。所含細(xì)胞情況如表1所示。
作為對照，將含有枸櫞酸鈉抗凝液的50ml臍帶血，按照中國專利公布CN101638637A實(shí)施例1所提供的方法，進(jìn)行分離，即可得到含有干細(xì)胞的沉淀物，其中所含細(xì)胞如表1所示。
表1：本發(fā)明所述方法及現(xiàn)有技術(shù)分離出的干細(xì)胞情況對比
注：
采用流式細(xì)胞儀檢測CD34細(xì)胞的數(shù)量、分離后總細(xì)胞的數(shù)量以及無核細(xì)胞或核受損細(xì)胞總數(shù)；
回收率＝分離后CD34細(xì)胞數(shù)/分離前CD34細(xì)胞數(shù)×100％；
純度＝分離后CD34細(xì)胞數(shù)/分離后總細(xì)胞數(shù)×100％。
從表1可以看出，針對臍帶血樣品，與對照組相比，采用本發(fā)明提供的分離方法獲得的含有干細(xì)胞的沉淀物中的細(xì)胞總數(shù)雖然只有對照組中細(xì)胞總數(shù)的25-35％左右，但是其中有效干細(xì)胞的回收率幾乎沒有變化，并且重要的是純度大大提高，達(dá)到7.4％以上。
實(shí)施例3
首先，將含有枸櫞酸鈉的30ml臍帶血樣品與35ml PBS液混合形成混合液。
然后在上述混合液中加入6重量％的羥乙基淀粉水溶液并靜置沉降1小時(shí)以得到含有干細(xì)胞的上層細(xì)胞液，將所述含有干細(xì)胞的上層細(xì)胞液以2600轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，得到細(xì)胞沉淀。將所述細(xì)胞沉淀鋪在由聚蔗糖配制成的密度為1.075g/ml的水溶液上進(jìn)行離心，其中聚蔗糖和泛影葡胺的質(zhì)量為0.85:1。然后以2000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，得到中間云霧狀干細(xì)胞層。取中間干細(xì)胞層，平鋪于另一試管的密度為1.092g/ml的聚蔗糖水溶液之上，以1800轉(zhuǎn)/分的離心轉(zhuǎn)速離心32分鐘，得到上下兩條細(xì)胞帶，取下方細(xì)胞帶分離，即為本發(fā)明所述的有效細(xì)胞。其中細(xì)胞情況如表2所示。
實(shí)施例4
除了在細(xì)胞純化液中加入0.8％的腺嘌呤以外，以與實(shí)施例3相同的方式制備有效細(xì)胞。所是細(xì)胞情況如表2所示。
作為對照，將含有枸櫞酸鈉抗凝液的30ml臍帶血，按照專利CN101638637A提供的分離試劑盒及使用方法，進(jìn)行分離，即可得到含有干細(xì)胞的沉淀物，其中所含細(xì)胞數(shù)量如表2所示。
表2：本發(fā)明所述方法及現(xiàn)有技術(shù)分離出的干細(xì)胞情況對比
注：
采用流式細(xì)胞儀檢測CD34細(xì)胞的數(shù)量、分離后總細(xì)胞的數(shù)量以及無核細(xì)胞或核受損細(xì)胞總數(shù)；
回收率＝分離后CD34細(xì)胞數(shù)/分離前CD34細(xì)胞數(shù)×100％；
純度＝分離后CD34細(xì)胞數(shù)/分離后總細(xì)胞數(shù)×100％。
從表2可以看出，針對臍帶血樣品，與對照組相比，采用本發(fā)明提供的分離方法獲得的含有干細(xì)胞的沉淀物中的細(xì)胞總數(shù)雖然只有對照組中細(xì)胞總數(shù)的25-30％左右，但是其中有效干細(xì)胞的回收率幾乎沒有變化，并且重要的是純度大大提高，達(dá)到9.6％以上。
實(shí)施例5
首先，將含有枸櫞酸鈉的50ml臍帶血樣品與45ml 0.9重量％氯化鈉水溶液混合形成混合液。
然后在上述混合液中加入6重量％的羥乙基淀粉水溶液并靜置沉降1小時(shí)以得到含有干細(xì)胞的上層細(xì)胞液，將所述含有干細(xì)胞的上層細(xì)胞液以2500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，得到細(xì)胞沉淀。將所述細(xì)胞沉淀鋪在由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為1.074g/ml的水溶液上進(jìn)行離心，其中聚蔗糖和泛影葡胺的質(zhì)量為0.75:1。然后以2000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，得到中間云霧狀干細(xì)胞層。取中間干細(xì)胞層，平鋪于另一試管的密度為1.095g/ml的聚蔗糖水溶液之上，以1900轉(zhuǎn)/分的離心轉(zhuǎn)速離心31分鐘，得到上下兩條細(xì)胞帶，取下方細(xì)胞帶分離，即為本發(fā)明所述的有效細(xì)胞。其中細(xì)胞情況如表3所示。
實(shí)施例6
除了在細(xì)胞純化液中加入1.5％的腺嘌呤以外，以與實(shí)施例5相同的方式制備有效細(xì)胞。所是細(xì)胞情況如表3所示。
作為對照，將含有枸櫞酸鈉抗凝液的50ml臍帶血，按照專利CN101638637A提供的分離試劑盒及使用方法，進(jìn)行分離，即可得到含有干細(xì)胞的沉淀物，其中所含細(xì)胞數(shù)量如表3所示。
表3：本發(fā)明所述方法及現(xiàn)有技術(shù)分離出的干細(xì)胞情況對比
注：
采用流式細(xì)胞儀檢測CD34細(xì)胞的數(shù)量、分離后總細(xì)胞的數(shù)量以及無核細(xì)胞或核受損細(xì)胞總數(shù)；
回收率＝分離后CD34細(xì)胞數(shù)/分離前CD34細(xì)胞數(shù)×100％；
純度＝分離后CD34細(xì)胞數(shù)/分離后總細(xì)胞數(shù)×100％。
實(shí)施例7
試劑盒組成：
首先分別配置以下成分：
細(xì)胞稀釋液：取4.5g氯化鈉，加入適量水溶解，再加水稀釋至500ml，混合均勻，備用；
沉淀劑：6％(重量)羥乙基淀粉(市場購買)水溶液；
細(xì)胞分層液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為1.075g/ml的水溶液，其中聚蔗糖和泛影葡胺的質(zhì)量為1:1；
細(xì)胞純化液：由聚蔗糖和腺嘌呤配制成的密度為1.093g/ml的水溶液，其中腺嘌呤的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％。
將上述細(xì)胞稀釋劑、沉淀劑、細(xì)胞分層液及細(xì)胞純化液經(jīng)過115℃，20分鐘滅菌處理，檢測其內(nèi)毒素含量≤0.5EU/ml，裝瓶。
首先，將含有枸櫞酸鈉的50ml臍帶血樣品與50ml上述細(xì)胞稀釋液混合形成混合液。
然后在上述混合液中加入上述沉淀劑并靜置沉降1小時(shí)以得到含有干細(xì)胞的上層細(xì)胞液，將所述含有干細(xì)胞的上層細(xì)胞液以2500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，得到細(xì)胞沉淀。將所述細(xì)胞沉淀鋪在上述細(xì)胞分層液上進(jìn)行離心。然后以2500轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，得到中間云霧狀干細(xì)胞層。取中間干細(xì)胞層，平鋪于另一試管的細(xì)胞純化液之上，以2000轉(zhuǎn)/分的離心轉(zhuǎn)速離心30分鐘，得到上下兩條細(xì)胞帶，取下方細(xì)胞帶分離，即為本發(fā)明所述的有效細(xì)胞。其中細(xì)胞情況如表3所示。
從表3可以看出，針對臍帶血樣品，與對照組相比，采用本發(fā)明提供的分離方法和分離試劑盒獲得的含有干細(xì)胞的沉淀物中的細(xì)胞總數(shù)雖然只有對照組中細(xì)胞總數(shù)的25-33％左右，但是其中有效干細(xì)胞的回收率幾乎沒有變化，并且重要的是純度大大提高，達(dá)到7.9％。
參考本申請的優(yōu)選技術(shù)方案詳細(xì)描述了本申請的生物材料去細(xì)胞洗脫裝置，然而，需要說明的是，在不脫離本申請的精神的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在上述公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上做出任何改造、修飾以及變動(dòng)。本申請包括上述具體實(shí)施方案及其任何等同形式。