本發(fā)明屬于細(xì)胞工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法及其試劑盒與其在制備腫瘤免疫治療藥物及腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自然殺傷細(xì)胞(naturekillercell，nk)是除t、b細(xì)胞之外的第三類淋巴細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)也與t、b細(xì)胞不同，nk細(xì)胞是胞漿中含嗜天青顆粒的大顆粒淋巴細(xì)胞，廣泛存在于淋巴器官和外周組織中，在正常外周血中約占淋巴細(xì)胞總數(shù)的5％-10％，脾中占1％-2％，淋巴結(jié)和骨髓中也有nk細(xì)胞存在。nk細(xì)胞作為人體天然免疫的重要組成部分，是機(jī)體抗御感染和防止細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，在免疫監(jiān)視、免疫防御中起著十分重要的作用。長(zhǎng)期以來(lái)的研究表明在某些疾病的發(fā)生過(guò)程中，如腫瘤、自身免疫性疾病、衰老相關(guān)性疾病和hiv感染等，會(huì)導(dǎo)致nk細(xì)胞比例、數(shù)量和功能降低。2012年美國(guó)疾病控制中心報(bào)告nk細(xì)胞的活力和數(shù)量是人體健康的重要保證，幾乎所有疾病的發(fā)病都與nk細(xì)胞的活性明顯不足有關(guān)。當(dāng)人們患有某種疾病時(shí)，無(wú)論是慢性的、偶發(fā)性的或是急性的，nk細(xì)胞的活性都在平均水平以下。讓nk細(xì)胞恢復(fù)到高水平的活性，是比較好的治療疾病方法。與t淋巴細(xì)胞不同，nk細(xì)胞不需預(yù)先刺激就可直接溶解破壞腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞，通過(guò)分泌穿孔素、絲氨酸蛋白酶如顆粒酶a和b、硫酸軟骨素蛋白聚糖等分子降解細(xì)胞膜、破壞靶細(xì)胞完整性而發(fā)揮溶細(xì)胞效應(yīng)；nk細(xì)胞表面表達(dá)fasl(fasligand)和trail(tnf-relatedopoptosis-inducingligand)可通過(guò)與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合引起靶細(xì)胞的凋亡；活化后nk細(xì)胞會(huì)釋放大量的干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α等細(xì)胞因子；另外通過(guò)細(xì)胞膜fcγriii(cd16)與抗體fc段結(jié)合從而介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性作用。隨著對(duì)nk細(xì)胞生物功能及活化機(jī)制的了解，利用nk細(xì)胞為靶點(diǎn)的免疫治療對(duì)疾病的早期預(yù)防、控制和治療具有重要意義。近年來(lái)，免疫治療己經(jīng)成為繼手術(shù)、放化療及內(nèi)分泌治療之后的第四大治療模式，并逐漸受到重視。過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療法作為免疫治療方法的一種，在臨床研究方面取得了較大的進(jìn)展。目前已經(jīng)開(kāi)展自體nk細(xì)胞過(guò)繼免疫治療應(yīng)用于血液腫瘤(急性髓系白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病等)和實(shí)體瘤(腦膠質(zhì)瘤、腎癌和惡性黑色素瘤)的臨床研究，安全性得到肯定，但臨床試驗(yàn)的結(jié)果并不盡如人意，將自體外周血進(jìn)行 nk細(xì)胞分選后回輸，觀察到體內(nèi)nk細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷增強(qiáng)，但是生存率和復(fù)發(fā)率與對(duì)照組相比并無(wú)改善，可能與腫瘤在發(fā)展過(guò)程中容易對(duì)自體nk細(xì)胞形成免疫逃避有關(guān)，而且nk細(xì)胞過(guò)繼性免疫治療的臨床試驗(yàn)受試者往往都是經(jīng)過(guò)多種化療失敗的極度晚期的患者，瘤負(fù)荷重，機(jī)體免疫力差，nk細(xì)胞的功能有嚴(yán)重缺陷。要提高nk細(xì)胞的臨床治療療效就必須改變以往的治療策略。為了克服這些缺陷，異體來(lái)源的nk細(xì)胞是一個(gè)比較好的選擇。有學(xué)者研究通過(guò)移植異體nk細(xì)胞治療白血病患者，發(fā)現(xiàn)能延緩復(fù)發(fā)，且不引起移植物抗宿主病，引起人們對(duì)nk細(xì)胞的同種異體反應(yīng)性的關(guān)注。從目前的臨床研究的結(jié)果來(lái)看，異源性nk細(xì)胞在完全緩解率、無(wú)事件生存期、復(fù)發(fā)和死亡率方面明顯優(yōu)于自體nk細(xì)胞，而且異源性nk細(xì)胞并不伴隨移植物抗宿主反應(yīng)。nk細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力依賴于nk細(xì)胞表面活化性受體和抑制性受體間的信號(hào)平衡調(diào)控，殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(kir)組成與主要組織相容性i類(mhc-i)結(jié)合的受體家族，對(duì)調(diào)節(jié)人nk細(xì)胞的活化閾值起重要作用。最近越來(lái)越多的研究表明利用kir受體/mhc-i配體的錯(cuò)配，篩選最優(yōu)的供體能大大增強(qiáng)nk細(xì)胞對(duì)受體腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，提高nk細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的效果。當(dāng)前基于kir的供者選擇對(duì)提高造血干細(xì)胞/骨髓的移植和腫瘤的過(guò)繼免疫治療方面的研究倍受關(guān)注。異源性nk輸注已經(jīng)成為臨床上nk細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的新策略(limo,jungmy,hwangyk,shinec:presentandfutureofallogeneicnaturalkillercelltherapy.frontiersinimmunology2015,6:286.)。臍血作為現(xiàn)成的異源性資源，無(wú)倫理問(wèn)題，來(lái)源豐富，更容易找到最優(yōu)的供者，且臍血中t淋巴細(xì)胞發(fā)育不成熟,多為幼稚細(xì)胞，移植后發(fā)生急性和慢性移植物抗宿主病的幾率低、程度輕，所以臍血已經(jīng)成為異源nk細(xì)胞極具前景的來(lái)源(shaimh,yvone:cordblood:apromisingsourceofallogeneicnaturalkillercellsforimmunotherapy.cytotherapy2015,17(1):1-2.)。臨床輸注nk細(xì)胞，需要足夠的細(xì)胞純度和細(xì)胞數(shù)量，但nk細(xì)胞在臍血細(xì)胞中所占比例較低，數(shù)量也很少，需要經(jīng)過(guò)體外分離及培養(yǎng)擴(kuò)增，獲得大量高純度的nk細(xì)胞才能滿足臨床應(yīng)用。因而如何獲得高純度、高質(zhì)量的nk細(xì)胞成為nk細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的關(guān)鍵(klingemannh:challengesofcancertherapywithnaturalkillercells.cytotherapy2015,17(3):245-249.)。目前分離及擴(kuò)增臍血nk細(xì)胞的方法主要有兩種(如圖1所示)：1.nk細(xì)胞在臍血中約占淋巴細(xì)胞的10％-20％，功能不成熟，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力低下?？衫昧魇郊?xì)胞儀或者磁珠分選儀分選富集nk細(xì)胞，然后通過(guò)體外擴(kuò)增增加nk細(xì)胞的數(shù)量和殺傷腫瘤的能力。celgenecellulartherapeutics公司將凍存復(fù)蘇的臍帶血用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，利用nk富集試劑盒(stemcell technologies，試劑盒包含cd3、cd4、cd14、cd19、cd20、cd36、cd66b、cd123、hla-dr和glycophorina抗體)分選cd56+cd3-nk細(xì)胞，純度可達(dá)71％，細(xì)胞數(shù)為1.5×107/份臍血，然后通過(guò)起始培養(yǎng)基(包括：imdm，10％fbs，35mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，5μg/ml胰島素，20μm乙醇胺，1μg/ml不飽和脂肪酸，1μg/ml亞油酸，0.2μg/ml棕櫚酸，2.5μg/ml牛血清白蛋白，0.1μg/ml植物凝集素，1％青-鏈霉素，200iu/ml白介素-2)添加滋養(yǎng)層細(xì)胞(絲裂霉素c處理的外周血單個(gè)核細(xì)胞和k562細(xì)胞)，37℃5％co2條件下培養(yǎng)nk細(xì)胞5-7天后，轉(zhuǎn)移至維持培養(yǎng)基(imdm，10％fbs,2％人ab血清，1％青-鏈霉素，200iu/ml白介素-2)培養(yǎng)至21天后，每一份臍血可獲得cd56+cd3-nk細(xì)胞純度>80％，平均細(xì)胞總數(shù)為1.2×109/份臍血(kangl,voskinarian-bersev,lawe,reddint,bhatiam,hariria,ningy,dongd,maguiret,yarmushmetal:characterizationandexvivoexpansionofhumanplacenta-derivednaturalkillercellsforcancerimmunotherapy.frontiersinimmunology2013,4:101.)。2.nk細(xì)胞起始于造血干細(xì)胞，臍血中含有豐富的造血干細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀或磁珠分選儀分選富集造血干細(xì)胞，通過(guò)體外分化獲得一定數(shù)量的成熟nk細(xì)胞。glycostemtherapeutics公司將凍存復(fù)蘇臍血利用clinimacscd34磁珠分選試劑盒分選富集cd34+造血干細(xì)胞純度為67％，細(xì)胞數(shù)為3.8×106/份臍血，在細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基i(包括：培養(yǎng)基，10％人血清，高劑量細(xì)胞因子組合(scf，flt3l，tpo，il-7，低分子量肝素)和低劑量因子組合(gm-csf，g-csf，il-6))培養(yǎng)9天，然后在細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基ii(tpo更換為il-15，其它成分與培養(yǎng)基i一樣)擴(kuò)增至14天，最后在nk細(xì)胞分化培養(yǎng)基(低劑量因子組合更換為(il-7，scf，il-15和il-2)，其它與培養(yǎng)基i一樣)分化培養(yǎng)至35天，獲得純度>90％，平均數(shù)量2×109/份臍血的nk細(xì)胞(spanholtzj,preijersf,tordoirm,trilsbeekc,paardekooperj,dewittet,schaapn,dolstrah:clinical-gradegenerationofactivenkcellsfromcordbloodhematopoieticprogenitorcellsforimmunotherapyusingaclosed-systemcultureprocess.plosone2011,6(6):e20740.)。綜上所述，目前臍血nk細(xì)胞的制備方法(現(xiàn)有技術(shù))存在以下缺點(diǎn)：1、需要分選細(xì)胞，分選技術(shù)影響nk細(xì)胞的活性，也需要分選儀器；2、需要滋養(yǎng)層細(xì)胞，k562細(xì)胞的引入極大影響擴(kuò)增nk細(xì)胞的安全性；3、操作復(fù)雜，技術(shù)通用性差；4、分離和擴(kuò)增階段成本高；5、使用動(dòng)物源成分添加物，安全性差；6、nk細(xì)胞產(chǎn)量低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種簡(jiǎn)單且安全的臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法。本發(fā)明所提供的臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，可包括以下步驟：1)活化培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞：用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整臍血單個(gè)核細(xì)胞密度為0.5～5×106個(gè)/ml，再至少添加1～10μg/ml唑來(lái)膦酸和200～2000iu/ml重組人白介素-2，在36℃～40℃、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)1～5天，收集細(xì)胞液；2)增殖培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞：從步驟1)的細(xì)胞液中獲取細(xì)胞，用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為0.5～5×106個(gè)/ml，再添加200～2000iu/ml重組人白介素-2，在36℃～38℃、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，每隔2-3天補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基并調(diào)整細(xì)胞密度為0.5～5×106個(gè)/ml，培養(yǎng)14～35天，收獲得到臍血nk細(xì)胞。所述步驟1)中用到的臍血單個(gè)核細(xì)胞分離自新鮮抗凝臍血或凍存復(fù)蘇臍帶血，分離過(guò)程如下：1.1取新鮮抗凝臍血或凍存復(fù)蘇臍帶血，用1～2倍體積的pbs稀釋；1.2向淋巴細(xì)胞分離液上方緩慢加入等體積的稀釋臍血，保持兩液面界面清晰；1.3室溫980g，離心20～30min；1.4離心結(jié)束后，吸取上面第二層的白膜狀的單個(gè)核細(xì)胞層，用pbs清洗，得到臍血單個(gè)核細(xì)胞。所述步驟1)中的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基可為aimmediumctstm(購(gòu)自美國(guó)lifetechnology公司)或gmps&xfmtm-cd細(xì)胞培養(yǎng)基，優(yōu)選為gmps&xfmtm-cd細(xì)胞培養(yǎng)基。當(dāng)所述步驟1)中的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基為aimmediumctstm時(shí)，活化培養(yǎng)優(yōu)選為：用aimmediumctstm淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1～3×106個(gè)/ml，再添加1～5μg/ml唑來(lái)膦酸和500～1500iu/ml重組人白介素-2，在36℃～38℃、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)2～4天；活化培養(yǎng)更優(yōu)為：用aimmediumctstm淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml，再添加2μg/ml唑來(lái)膦酸和1000iu/ml重組人白介素-2，在37℃、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)3天。當(dāng)所述步驟1)中的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基為gmps&xfmtm-cd時(shí)，活化培養(yǎng)優(yōu)選為以下之一種：a.用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1～3×106個(gè)/ml，再添加1～5μg/ml唑來(lái)膦酸和500～1500iu/ml重組人白介素-2，在36℃～38℃、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)2～4天；活化培養(yǎng)更優(yōu)為：用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基 調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml，再添加2μg/ml唑來(lái)膦酸和1000iu/ml重組人白介素-2，在37℃、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)3天；b.用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1～3×106個(gè)/ml，再添加1～5μg/ml唑來(lái)膦酸和500～1500iu/ml重組人白介素-2，1～100ng/ml(較好1～20ng/ml)重組人白介素-15和1～100ng/ml(較好1～20ng/ml)重組人白介素-18，在36℃～38℃、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)2～4天；活化培養(yǎng)更優(yōu)為：用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml，再添加2μg/ml唑來(lái)膦酸和1000iu/ml重組人白介素-2、10ng/ml重組人白介素-15和10ng/ml重組人白介素-18，在37℃、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)3天；c.用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1～3×106個(gè)/ml，再添加1～5μg/ml唑來(lái)膦酸和500～1500iu/ml重組人白介素-2，1～100ng/ml(較好1～20ng/ml)重組人白介素-15和1～100ng/ml(較好1～20ng/ml)重組人白介素-18，在38.5℃～39.5℃、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)0.5～1天；活化培養(yǎng)更優(yōu)為：用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml，再添加2μg/ml唑來(lái)膦酸和1000iu/ml重組人白介素-2、10ng/ml重組人白介素-15和10ng/ml重組人白介素-18，在39℃、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)1天。所述步驟2)增殖培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞優(yōu)選為：用移液管將細(xì)胞液移至離心管中，150g，離心10min，棄上清，用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整,細(xì)胞密度為0.5～2×106個(gè)/ml(更優(yōu)選1×106個(gè)/ml)，再添加500～1500iu/ml(更優(yōu)選1000iu/ml)重組人白介素-2，在37℃、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，每隔2-3天補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為0.5～2×106個(gè)/ml(更優(yōu)選1×106個(gè)/ml)，并添加500～1500iu/ml(更優(yōu)選1000iu/ml)重組人白介素-2，培養(yǎng)18～24天(更優(yōu)選21天)，得到臍血nk細(xì)胞。以上所述臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法步驟1)中使用的專用活化培養(yǎng)基也屬于
發(fā)明內(nèi)容。專用活化培養(yǎng)基為以下組配之一：添加1～10μg/ml(優(yōu)選1～5μg/ml，最優(yōu)2μg/ml)唑來(lái)膦酸和200～2000iu/ml(優(yōu)選500～1500iu/ml，最優(yōu)1000iu/ml)重組人白介素-2的aimmediumctstm淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基；添加1～10μg/ml(優(yōu)選1～5μg/ml，最優(yōu)2μg/ml)唑來(lái)膦酸和200～2000iu/ml(優(yōu)選500～1500iu/ml，最優(yōu)1000iu/ml)重組人白介素-2的gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基；添加1～10μg/ml(優(yōu)選1～5μg/ml，最優(yōu)2μg/ml)唑來(lái)膦酸和200～2000iu/ml (優(yōu)選500～1500iu/ml，最優(yōu)1000iu/ml)重組人白介素-2、1～100ng/ml(優(yōu)選1～20ng/ml，最優(yōu)10ng/ml)重組人白介素-15和1～100ng/ml(優(yōu)選1～20ng/ml，最優(yōu)10ng/ml)重組人白介素-18的gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基。以上所述臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法步驟2)中使用的專用增殖培養(yǎng)基也屬于本
發(fā)明內(nèi)容。該專用增殖培養(yǎng)基為添加200～2000iu/ml(優(yōu)選1000iu/ml)重組人白介素-2的gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基。以上所述體外擴(kuò)增方法收獲的臍血nk細(xì)胞也屬于本
發(fā)明內(nèi)容。該細(xì)胞純度超過(guò)90％。本發(fā)明方法得到的臍血nk細(xì)胞在制備腫瘤免疫治療藥物中的應(yīng)用或在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用也屬于本
發(fā)明內(nèi)容。本發(fā)明另一目的是提供一種臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增試劑盒。本發(fā)明所提供的臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增試劑盒，主要包括以下試劑：1)臍血nk細(xì)胞的樣本密度分離液：樣本密度分離液(專利號(hào)：zl201110456878.2，醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150002號(hào))，或市售其它淋巴細(xì)胞分離液；2)臍血nk細(xì)胞活化培養(yǎng)基：aimmediumctstm(美國(guó)lifetechnology公司)培養(yǎng)基或gmps&xfmtm-cd培養(yǎng)基(專利申請(qǐng)?zhí)枺?01310082166.8；醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150008號(hào))，以及唑來(lái)膦酸、重組人白介素-2、重組人白介素-15和重組人白介素-18；3)臍血nk細(xì)胞增殖培養(yǎng)基：gmps&xfmtm-cd細(xì)胞培養(yǎng)基(專利申請(qǐng)?zhí)枺?01310082166.8；醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150008號(hào))和重組人白介素-2。采取以上方案，本發(fā)明提供了一種操作簡(jiǎn)單且安全的臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法以及相關(guān)試劑盒。與現(xiàn)有的分離及擴(kuò)增臍血nk細(xì)胞的方法(現(xiàn)有技術(shù))相比，本發(fā)明具有以下有益效果：1)不需要進(jìn)行細(xì)胞分選步驟(不需要分選nk細(xì)胞或者造血干細(xì)胞)，簡(jiǎn)化了細(xì)胞制備流程，大大降低了臍血nk細(xì)胞的制備成本；2)不需要滋養(yǎng)層細(xì)胞，避免引入滋養(yǎng)層細(xì)胞給制備的臍血nk細(xì)胞帶來(lái)安全風(fēng)險(xiǎn)；3)制備nk細(xì)胞所使用的細(xì)胞培養(yǎng)基完全無(wú)動(dòng)物源成分，安全性好，而且化學(xué)成分明確，增加了批次之間的穩(wěn)定性；4)nk細(xì)胞產(chǎn)量高，獲得的臍血nk細(xì)胞的純度達(dá)90％以上，細(xì)胞總數(shù)可達(dá)1010-11個(gè)/份臍血。本發(fā)明臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法和試劑盒將在制備腫瘤免疫治療藥物及腫瘤的免疫治療中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。附圖說(shuō)明圖1為現(xiàn)有分離及擴(kuò)增臍血nk細(xì)胞的方法；圖2為本發(fā)明臍血nk細(xì)胞體外擴(kuò)增方法的流程；圖3為新鮮臍血和凍存復(fù)蘇臍血nk細(xì)胞體外擴(kuò)增前后的細(xì)胞形態(tài)圖；圖4為新鮮臍血和凍存復(fù)蘇臍血nk細(xì)胞體外擴(kuò)增的生長(zhǎng)曲線；圖5為新鮮臍血和凍存復(fù)蘇臍血nk細(xì)胞體外擴(kuò)增前后純度的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果；圖6為體外擴(kuò)增的新鮮臍血和凍存復(fù)蘇臍血nk細(xì)胞的腫瘤靶細(xì)胞殺傷效果。具體實(shí)施方式針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中分離及擴(kuò)增臍血nk細(xì)胞中的不足，本發(fā)明旨在提供一種臍血nk細(xì)胞的體外制備方法，并提供方法中用到的專用活化培養(yǎng)基和專用增殖培養(yǎng)基。本發(fā)明臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，可包括以下步驟：1)活化培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞：用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(下文詳細(xì)介紹)調(diào)整臍血單個(gè)核細(xì)胞密度為0.5～5×106個(gè)/ml(優(yōu)選1～3×106個(gè)/ml，最優(yōu)選2×106個(gè)/ml)，將細(xì)胞懸液接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；再添加1～10μg/ml(優(yōu)選1～5μg/ml，最優(yōu)選2μg/ml)唑來(lái)膦酸和200～2000iu/ml(優(yōu)選500～1500iu/ml，最優(yōu)選1000iu/ml)重組人白介素-2(形成專用活化培養(yǎng)基)，在36℃～40℃、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)1～5天；步驟1)中的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基可為aimmediumctstm(購(gòu)自美國(guó)lifetechnology公司)或gmps&xfmtm-cd細(xì)胞培養(yǎng)基(專利申請(qǐng)?zhí)枺?01310082166.8；醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150008號(hào))，優(yōu)選為gmps&xfmtm-cd細(xì)胞培養(yǎng)基。根據(jù)選用的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基的種類，相應(yīng)得到不同的專用活化培養(yǎng)基。一)選用aimmediumctstm淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，專用活化培養(yǎng)基組成為：添加1～10μg/ml(優(yōu)選1～5μg/ml，最優(yōu)選2μg/ml)唑來(lái)膦酸和200～2000iu/ml(優(yōu)選500～1500iu/ml，最優(yōu)選1000iu/ml)重組人白介素-2的aimmediumctstm淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基。利用該專用活化培養(yǎng)基，步驟1)中的活化培養(yǎng)方法優(yōu)選為：用aimmediumctstm淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整臍血單個(gè)核細(xì)胞密度為0.5～5×106/ml(優(yōu)選1～3×106個(gè)/ml，最優(yōu)選2×106個(gè)/ml)，將細(xì)胞懸液接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再向aimmediumctstm淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中添加1～10μg/ml(優(yōu)選1～5μg/ml，最優(yōu)選2μg/ml)唑來(lái)膦酸和 200～2000iu/ml(優(yōu)選500～1500iu/ml，最優(yōu)選1000iu/ml)重組人白介素-2，在36℃～38℃(優(yōu)選37℃)、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)1～5天(優(yōu)選2～4天，最優(yōu)選3天)。二)選用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，專用活化培養(yǎng)基組成為：添加1～10μg/ml(優(yōu)選1～5μg/ml，最優(yōu)選2μg/ml)唑來(lái)膦酸和200～2000iu/ml(優(yōu)選500～1500iu/ml，最優(yōu)選1000iu/ml)重組人白介素-2的gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基。利用該專用活化培養(yǎng)基，步驟1)中的活化培養(yǎng)方法更優(yōu)選為：用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整臍血單個(gè)細(xì)胞密度為0.5～5×106/ml(優(yōu)選1～3×106個(gè)/ml，最優(yōu)選2×106個(gè)/ml)，將細(xì)胞懸液接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再向gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中添加1～10μg/ml(優(yōu)選1～5μg/ml，最優(yōu)選2μg/ml)唑來(lái)膦酸和200～2000iu/ml(優(yōu)選500～1500iu/ml，最優(yōu)選1000iu/ml)重組人白介素-2，在36℃～38℃(優(yōu)選37℃)、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)1～5天(優(yōu)選2～4天，最優(yōu)選3天)。三)選用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，專用活化培養(yǎng)基組成為：添加1～10μg/ml(優(yōu)選1～5μg/ml，最優(yōu)選2μg/ml)唑來(lái)膦酸和200～2000iu/ml(優(yōu)選500～1500iu/ml，最優(yōu)選1000iu/ml)重組人白介素-2、1～100ng/ml(優(yōu)選1～20ng/ml，最優(yōu)選10ng/ml)重組人白介素-15和1～100ng/ml(優(yōu)選1～20ng/ml，最優(yōu)選10ng/ml)重組人白介素-18的gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基。利用該專用活化培養(yǎng)基，步驟1)中的活化培養(yǎng)方法更優(yōu)選為：用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整臍血單個(gè)核細(xì)胞密度為0.5～5×106/ml(優(yōu)選1～3×106個(gè)/ml，最優(yōu)選2×106個(gè)/ml)，將細(xì)胞懸液接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再向gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中添加1～10μg/ml(優(yōu)選1～5μg/ml，最優(yōu)選2μg/ml)唑來(lái)膦酸和200～2000iu/ml(優(yōu)選500～1500iu/ml，最優(yōu)選1000iu/ml)重組人白介素-2、1～100ng/ml(優(yōu)選1～20ng/ml，最優(yōu)選10ng/ml)重組人白介素-15和1～100ng/ml(優(yōu)選1～20ng/ml，最優(yōu)選10ng/ml)重組人白介素-18，在36℃～38℃(優(yōu)選37℃)、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)1～5天(優(yōu)選2～4天，最優(yōu)選3天)。利用該專用活化培養(yǎng)基，改變培養(yǎng)條件，如在38℃～40℃(優(yōu)選38.5℃～39.5℃，最優(yōu)選39℃)、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)0.5～3天(優(yōu)選0.5～1天，最優(yōu)選1天)，將得到步驟1)活化培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞的最優(yōu)條件。2)增殖培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞：用移液管將步驟1)得到的細(xì)胞液移至離心管中，150g，離心10min,，棄上清，用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(專利申請(qǐng)?zhí)枺? 201310082166.8；醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150008號(hào))調(diào)整細(xì)胞密度為0.5～5×106個(gè)/ml(較優(yōu)0.5～2×106個(gè)/ml，優(yōu)選1×106個(gè)/ml)，將細(xì)胞懸液接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再添加200～2000iu/ml(較優(yōu)500～1500iu/ml，優(yōu)選1000iu/ml)重組人白介素-2(形成專用增殖培養(yǎng)基)，在36℃～38℃(優(yōu)選37℃)、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，每隔2～3天補(bǔ)充新鮮gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為0.5～5×106個(gè)/ml(較優(yōu)0.5～2×106個(gè)/ml，優(yōu)選1×106個(gè)/ml)，并添加200～2000iu/ml(較優(yōu)500～1500iu/ml，優(yōu)選1000iu/ml)重組人白介素-2，培養(yǎng)14～35天(較優(yōu)18～24天，優(yōu)選21天)，收獲得到臍血nk細(xì)胞。步驟2)中增殖培養(yǎng)中專用增殖培養(yǎng)基組成為：添加200～2000iu/ml(較優(yōu)500～1500iu/ml，優(yōu)選1000iu/ml)重組人白介素-2的gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基。步驟2)增殖培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞過(guò)程優(yōu)選為：用移液管將細(xì)胞液移至離心管中，150g(離心力單位)，離心10min，棄上清，用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中添加1000iu/ml重組人白介素-2，在37℃、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，每隔2～3天補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，培養(yǎng)21天，收獲得到臍血nk細(xì)胞。上述方法中，步驟1)中用到的臍血單個(gè)核細(xì)胞分離于臍帶血，分離方法如下：1.1取新鮮抗凝臍血或凍存復(fù)蘇臍帶血100ml，添加100mlpbs稀釋臍血；1.2于10個(gè)50ml離心管中分別加入20ml樣本密度分離液(專利號(hào)：zl201110456878.2，醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150002號(hào)；也可以是市售其它淋巴細(xì)胞分離液)，將200ml稀釋臍血均分分別緩慢加入分離液面上方，每個(gè)離心管加20ml稀釋臍血，保持兩液面界面清晰；1.3室溫，400～1200g(優(yōu)選980g，為一種離心力單位。市售其它淋巴細(xì)胞分離液按照說(shuō)明書操作)離心20～40min(優(yōu)選30min)；1.4離心結(jié)束后，離心管中由上至下分為界面清晰的四層，從上而下依次為：淺黃色的血漿層、白膜狀的單個(gè)核細(xì)胞層、透明的分離液層以及紅色的紅細(xì)胞層，小心吸取白膜狀的單個(gè)核細(xì)胞層到另一離心管中，用pbs清洗，得到臍血單個(gè)核細(xì)胞。依據(jù)以上方法，本發(fā)明還提供了一種臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增試劑盒，主要包括以下試劑：1)臍血單個(gè)核細(xì)胞的樣本密度分離液：樣本密度分離液(專利號(hào)：zl201110456878.2，醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150002號(hào))，或市售其它淋巴細(xì)胞分離液；2)臍血nk細(xì)胞活化培養(yǎng)基：aimmediumctstm(購(gòu)自美國(guó)lifetechnology 公司)培養(yǎng)基或gmps&xfmtm-cd培養(yǎng)基；以及按上述一)至四)描述的其它試劑，包括唑來(lái)膦酸、重組人白介素-2、重組人白介素-15和重組人白介素-18；3)臍血nk細(xì)胞增殖培養(yǎng)基：gmps&xfmtm-cd細(xì)胞培養(yǎng)基(專利申請(qǐng)?zhí)枺?01310082166.8；醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150008號(hào))，以及上述描述的試劑重組人白介素-2。以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。所述百分比濃度如無(wú)特別說(shuō)明均為質(zhì)量/質(zhì)量(w/w，單位g/100g)百分比濃度、質(zhì)量/體積(w/v，單位g/100ml)百分比濃度或體積/體積(v/v，單位ml/100ml)百分比濃度。實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑以達(dá)到具體公開(kāi)的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來(lái)源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的來(lái)源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實(shí)施例中的提示替換使用。實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1、體外擴(kuò)增臍血nk細(xì)胞及檢測(cè)一、體外擴(kuò)增臍血nk細(xì)胞(活化培養(yǎng)方案一)如圖1所示，本發(fā)明臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，包括以下步驟：1)分離臍血單個(gè)核細(xì)胞1.1分別取100ml的新鮮抗凝臍血(樣本1)和凍存復(fù)蘇臍帶血(樣本2，臍帶血均由武警總醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn))，添加100mlpbs(配方：nacl8.0g，kcl0.2g，na2hpo41.44g，kh2po40.24g，添加蒸餾水至1000ml，調(diào)節(jié)ph7.4)稀釋臍血；1.2于10個(gè)50ml離心管中分別加入20ml樣本密度分離液(專利號(hào)：zl201110456878.2，醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150002號(hào))，將稀釋臍血分別緩慢加入分離液面上方，每個(gè)離心管加20ml稀釋臍血，保持兩液面界面清晰；1.3室溫，980g,離心30min；1.4離心結(jié)束后，離心管中由上至下分為界面清晰的四層，從上而下依次為：淺黃色的血漿層、白膜狀的nk細(xì)胞層、透明的分離液層以及紅色的紅細(xì)胞層，小心吸取白膜狀的單個(gè)核細(xì)胞層到另一離心管中，用pbs清洗2～3次，得到單個(gè)核細(xì)胞。2)活化培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞用aimmediumctstm淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)lifetechnology公司)調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml(0.5～5×106/ml均可，較優(yōu)1～3×106個(gè)/ml。低于0.5×106/ml或者高于5×106/ml，都不利于nk細(xì)胞的活化)，將單個(gè)核細(xì)胞懸液接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再向aimmediumctstm淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中添加2μg/ml(1～10μg/ml均可，較優(yōu)1～5μg/ml。低于1μg/ml，影響nk細(xì)胞活化；高于10μg/ml，對(duì)nk的活化影響不大)唑來(lái)膦酸(擇泰，諾華制藥)和1000iu/ml(200～2000iu/ml均可，較優(yōu)500～1500iu/ml。低于200iu/ml，影響nk細(xì)胞的活化；高于2000iu/ml，細(xì)胞容易死亡)重組人白介素-2(德路生，北京四環(huán)生物)，在37℃(36℃～38℃均可，低于36℃或者高于38℃，細(xì)胞均無(wú)法正常生長(zhǎng))、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)3天(1～5天均可，較優(yōu)2～4天。低于1天，nk細(xì)胞活化較低；高于5天后，對(duì)nk的活化影響不大)。3)增殖培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞用移液管將細(xì)胞液移至離心管中，150g，離心10min，棄上清，用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(專利申請(qǐng)?zhí)枺?01310082166.8；醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150008號(hào))調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml(0.5～5×106/ml均可，較優(yōu)0.5～2×106個(gè)/ml。低于0.5×106個(gè)/ml或者高于5×106/ml時(shí)，都不利于nk細(xì)胞的增殖)，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再添加1000iu/ml(200～2000iu/ml均可，較優(yōu)500～1500iu/ml。低于200iu/ml，影響nk細(xì)胞的增殖；高于2000iu/ml，細(xì)胞容易死亡)重組人白介素-2，37℃(36℃～38℃均可，低于36℃或者高于38℃時(shí)，細(xì)胞不能正常生長(zhǎng))、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，每隔2～3天補(bǔ)充新鮮淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為0.5～5×106個(gè)/ml(優(yōu)選1×106個(gè)/ml，較優(yōu)0.5～2×106個(gè)/ml。細(xì)胞密度低于0.5×106個(gè)/ml，細(xì)胞將增殖緩慢；當(dāng)細(xì)胞高于5×106個(gè)/ml，細(xì)胞容易很快形成接觸抑制，影響細(xì)胞的增殖)，并添加1000iu/ml(200～2000iu/ml均可，較優(yōu)500～1500iu/ml)重組人白介素-2，培養(yǎng)14～35天(較優(yōu)18～24天，最優(yōu)選21天)，得到臍血nk細(xì)胞。由于細(xì)胞在21天時(shí)擴(kuò)增數(shù)量較多，且殺傷活性最大，21天后細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞的殺傷活性下降，所以優(yōu)選21天作為臍血nk細(xì)胞的收獲點(diǎn)。二、檢測(cè)體外擴(kuò)增的臍血nk細(xì)胞1、臍血nk細(xì)胞計(jì)數(shù)1)輕輕吹打臍血nk細(xì)胞懸液，成nk單細(xì)胞懸液；2)取nk單細(xì)胞懸液20μl，加入20μl0.2％臺(tái)盼藍(lán)染色液(購(gòu)自sigma公司)中，反復(fù)抽吸輕輕混合均勻；3)取20μl混合液加入countstar(ic1000)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(購(gòu)自上海睿鈺生物科技有限公司)的計(jì)數(shù)板槽中；4)靜置1分鐘，讀數(shù)。結(jié)果：從新鮮抗凝臍血或凍存復(fù)蘇臍帶血中分離的臍血nk細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外活化、擴(kuò)增培養(yǎng)后(用上述一的方法獲得)，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)由擴(kuò)增前的圓形、大小各異，逐漸變?yōu)榫坏牟灰?guī)則細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞胞體和胞核體積增大(擴(kuò)增培養(yǎng)21天的細(xì)胞如圖3所示)；細(xì)胞數(shù)量由最初的4.36×108個(gè)/ml(新鮮臍血)、3.25×108個(gè)/ml(凍存復(fù)蘇臍血)增殖至擴(kuò)增培養(yǎng)21天的5.08×1010個(gè)/ml(新鮮臍血)、3.94×1010個(gè)/ml(凍存復(fù)蘇臍血)，如圖4所示。圖4還顯示擴(kuò)增培養(yǎng)14天至21天為細(xì)胞快速增殖期，之后至35天為緩慢凋零期，因此可根據(jù)情況在14～35天培養(yǎng)期內(nèi)收獲臍血nk細(xì)胞。2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)臍血nk細(xì)胞的純度1)取單細(xì)胞懸液,150g離心10分鐘；2)用pbs重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/100μl，置流式檢測(cè)管中；3)加抗體cd56、cd3(購(gòu)自bd公司)，輕輕吹打混勻，4℃避光孵育30分鐘，同時(shí)設(shè)置同型對(duì)照；4)1500g離心5分鐘,棄上清；5)加100μlpbs，輕輕吹打混勻，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果：一中擴(kuò)增培養(yǎng)21天的nk細(xì)胞的純度由最初的1.23％(新鮮臍血)、0.79％(凍存復(fù)蘇臍血)提高至94.58％(新鮮臍血)、94.37％(凍存復(fù)蘇臍血)，如圖5所示。3、cck-8法測(cè)定臍血nk細(xì)胞的殺瘤活性1)取生長(zhǎng)良好的a549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞，來(lái)源于atcc)為靶細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化；2)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/ml；3)每孔100ul于96孔板中，置于37℃5％co2孵育過(guò)夜。4)取臍血nk細(xì)胞懸液為效應(yīng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×l06個(gè)/ml；5)按照效靶比為5：1、10：1、20：1加入96孔板中，每組設(shè)3復(fù)孔；6)37℃5％co2的孵箱中培養(yǎng)4h；7)每孔加入15μlcck-8(購(gòu)自碧云天)，繼續(xù)孵育2h；8)用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)的od值；9)計(jì)算殺傷率：殺傷率(％)＝[1-(實(shí)驗(yàn)組od值-單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞od值)÷ 單獨(dú)靶細(xì)胞od值]×100％。結(jié)果：熒光顯微鏡下觀察一中體外擴(kuò)增培養(yǎng)21天的臍血nk細(xì)胞對(duì)a549腫瘤細(xì)胞的殺傷能力大大提高，如圖6所示。上述檢測(cè)結(jié)果表明，用本發(fā)明方法體外擴(kuò)增的臍血nk細(xì)胞數(shù)量高、純度高、對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性高。實(shí)施例2、體外擴(kuò)增臍血nk細(xì)胞(活化培養(yǎng)方案二)如圖1所示，臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增包括以下過(guò)程：1)從凍存復(fù)蘇臍帶血中分離臍血單個(gè)核細(xì)胞取10ml凍存復(fù)蘇臍帶血(樣本3)，方法與實(shí)施例1相同。2)活化培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞(對(duì)照組為實(shí)施例1)用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(專利申請(qǐng)?zhí)枺?01310082166.8；醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150008號(hào))調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml(0.5～5×106/ml均可，較優(yōu)1～3×106個(gè)/ml)，將細(xì)胞懸液接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再向gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中添加2μg/ml(1～10μg/ml均可，較優(yōu)1～5μg/ml)唑來(lái)膦酸(擇泰，諾華制藥)和1000iu/ml(200～2000iu/ml均可，較優(yōu)500～1500iu/ml)重組人白介素-2(德路生，北京四環(huán)生物)，在37℃(36℃～38℃均可)、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)1～5天(較優(yōu)2～4天，優(yōu)選3天。低于1天，nk細(xì)胞活化較低；高于5天后，對(duì)nk的活化影響不大)。相同的添加試劑對(duì)細(xì)胞活化的影響與實(shí)施例1描述的相同，不再贅述。3)增殖培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3、體外擴(kuò)增臍血nk細(xì)胞及檢測(cè)(活化培養(yǎng)方案三)如圖1所示，臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增包括以下過(guò)程：1)從凍存復(fù)蘇臍帶血中分離臍血單個(gè)核細(xì)胞取10ml凍存復(fù)蘇臍帶血(樣本3)，方法與實(shí)施例1相同。2)活化培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞用gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(專利申請(qǐng)?zhí)枺?01310082166.8；醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150008號(hào))調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml(0.5～5×106/ml均可，較優(yōu)1～3×106個(gè)/ml)，將細(xì)胞懸液接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再向gmps&xfmtm-cd淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中添加2μg/ml(1～10μg/ml均可，較優(yōu)1～5μg/ml)唑來(lái)膦酸(擇 泰，諾華制藥)、1000iu/ml(200～2000iu/ml均可，較優(yōu)500～1500iu/ml)重組人白介素-2(德路生，北京四環(huán)生物)、10ng/ml(1～100ng/ml均可，較優(yōu)1～20ng/ml均可。低于1ng/ml時(shí)，對(duì)nk的活化無(wú)作用，高于100ng/ml時(shí)，對(duì)nk活性影響不大)重組人白介素-15(購(gòu)自peprotech公司)和10ng/ml(1～100ng/ml均可，較優(yōu)1～20ng/ml均可。低于1ng/ml時(shí)，對(duì)nk的活化無(wú)作用，高于100ng/ml時(shí)，對(duì)nk活性影響不大)重組人白介素-18(購(gòu)自peprotech公司)，在37℃(36℃～38℃均可)、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)3天(1～5天均可，較優(yōu)2～4天。低于1天，nk細(xì)胞活化較低；高于5天后，對(duì)nk的活化影響不大)。相同的添加試劑對(duì)細(xì)胞活化的影響與實(shí)施例1描述的相同，不再贅述。3)增殖培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4、體外擴(kuò)增臍血nk細(xì)胞(活化培養(yǎng)方案四)如圖1所示，臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增包括以下過(guò)程：1)從凍存復(fù)蘇臍帶血中分離臍血單個(gè)核細(xì)胞取10ml凍存復(fù)蘇臍帶血(樣本3)，方法與實(shí)施例1相同。2)活化培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞使用與活化培養(yǎng)方案三相同的活化培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件變化為在39℃±0.5℃(38℃～40℃均可，提高培養(yǎng)溫度，一方面有益于加快臍血nk細(xì)胞活化，活化效率提高，另一方面可以提高臍血nk的擴(kuò)增倍數(shù)、純度和生物活性。但高于40℃時(shí)，nk細(xì)胞不能適應(yīng)，出現(xiàn)死亡)、5％co2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)1天(0.5～3天均可，低于0.5天，nk的活化較低，高于3天后，nk細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)死亡)。3)增殖培養(yǎng)臍血nk細(xì)胞與實(shí)施例1相同。臍血nk細(xì)胞檢測(cè)用實(shí)施例1中二描述的方法對(duì)從10ml凍存復(fù)蘇臍帶血(樣本3)體外擴(kuò)增的臍血nk細(xì)胞進(jìn)行以下檢測(cè)(利用實(shí)施例1-實(shí)施例4方法以樣本3為起始血源進(jìn)行平行操作)：1、臍血nk細(xì)胞計(jì)數(shù)從凍存復(fù)蘇臍帶血中分離的臍血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外活化、擴(kuò)增培養(yǎng)21天后，細(xì)胞擴(kuò)增結(jié)果如表1-1和表1-2所示。本發(fā)明是從臍血單個(gè)核細(xì)胞(此時(shí)nk細(xì)胞在單個(gè)核細(xì)胞所占比例較低，見(jiàn)表2,0 天的nk細(xì)胞比例僅僅為9.56％)，經(jīng)過(guò)活化和擴(kuò)增兩步驟，可以獲得高純度的nk細(xì)胞。表1-1顯示擴(kuò)增前后所計(jì)數(shù)都是細(xì)胞(包括擴(kuò)增后的nk細(xì)胞和其它細(xì)胞)的總數(shù)。nk細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)是細(xì)胞總數(shù)×nk細(xì)胞的比例，即：表1-1數(shù)據(jù)×表2＝表1-2。0天臍血單個(gè)核細(xì)胞是本發(fā)明活化和擴(kuò)增前的細(xì)胞(包括少量nk細(xì)胞和其它細(xì)胞)，相當(dāng)于對(duì)照；0天臍血nk細(xì)胞是指其中的nk細(xì)胞。21天臍血nk細(xì)胞是單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增21天后的細(xì)胞總數(shù)，但因?yàn)榇藭r(shí)nk純度很高，絕大多數(shù)都是nk細(xì)胞，所以21天擴(kuò)增后的細(xì)胞被稱為nk細(xì)胞(嚴(yán)格來(lái)講是以nk細(xì)胞為主的單個(gè)核細(xì)胞)。該結(jié)果顯示實(shí)施例1-實(shí)施例4方案均使臍血細(xì)胞總數(shù)成百倍擴(kuò)增(表1-1)，其中nk細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)上千倍擴(kuò)增(表1-2)，且擴(kuò)增效果實(shí)施例4＞實(shí)施例3＞實(shí)施例2＞實(shí)施例1。表1-1臍血細(xì)胞的總體數(shù)量及擴(kuò)增倍數(shù)(10ml臍血量)表1-2臍血nk細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量及擴(kuò)增倍數(shù)(10ml臍血量)2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)臍血nk細(xì)胞的純度從凍存復(fù)蘇臍帶血中分離的臍血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外活化、擴(kuò)增培養(yǎng)21天后，nk細(xì)胞純度結(jié)果如表2所示。表2臍血nk細(xì)胞的純度實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例40天臍血nk細(xì)胞純度9.56％9.56％9.56％9.56％21天臍血nk細(xì)胞純度90.69％92.46％93.75％95.39％表2數(shù)據(jù)表明臍血單個(gè)核細(xì)胞中nk比例由原來(lái)的9.56％，經(jīng)過(guò)各實(shí)施例的擴(kuò)增，nk細(xì)胞純度均能達(dá)到90％以上，且實(shí)施例4＞實(shí)施例3＞實(shí)施例2＞實(shí)施例1。3、cck-8法測(cè)定臍血nk細(xì)胞的殺瘤活性實(shí)驗(yàn)以0天臍血單個(gè)核細(xì)胞(活化和擴(kuò)增前的細(xì)胞)為陰性對(duì)照，以cik細(xì)胞(一種殺傷腫瘤的免疫細(xì)胞)為陽(yáng)性對(duì)照。cik細(xì)胞的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)(adoptiveimmunotherapywithcytokine-inducedkillercellsgeneratedwithanewgoodmanufacturingpractice-gradeprotocol.cytotherapy,2012；earlyonline:1–10.doi:10.3109/14653249.2012.681038)獲得。結(jié)果如表3所示，熒光顯微鏡下觀察各實(shí)施例體外擴(kuò)增21天收獲的臍血nk細(xì)胞均顯示對(duì)a549腫瘤細(xì)胞較強(qiáng)的殺傷能力，與陽(yáng)性對(duì)照cik細(xì)胞相比，本發(fā)明擴(kuò)增的nk細(xì)胞具有更強(qiáng)的活性。同樣效靶比下實(shí)施例4＞實(shí)施例3＞實(shí)施例2＞實(shí)施例1，表明實(shí)施例4擴(kuò)增的細(xì)胞殺傷能力最強(qiáng)。表3臍血nk細(xì)胞對(duì)a549腫瘤細(xì)胞的殺傷能力由以上實(shí)施例可以看出，本發(fā)明所提供的臍血nk細(xì)胞體外擴(kuò)增方法操作簡(jiǎn)單且安全，與現(xiàn)有的分離及擴(kuò)增臍血nk細(xì)胞的方法(現(xiàn)有技術(shù))的比較如表4所示。綜上，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)不需要細(xì)胞分選；2)不需要滋養(yǎng)層細(xì)胞；3)操作簡(jiǎn)單，通用性好；4)成本低；5)所用試劑不含動(dòng)物源成分，安全性好；6)nk細(xì)胞產(chǎn)量高：獲得的臍血nk細(xì)胞的純度達(dá)90％以上，細(xì)胞總數(shù)可達(dá)1010-11個(gè)/份臍血(按實(shí)施例1樣本為100ml)；7)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力高。表4現(xiàn)有技術(shù)與本發(fā)明技術(shù)的比較注：每份臍血量為100ml(通常一份臍血的量約在50ml-120ml之間)。實(shí)施例5、臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增試劑盒本發(fā)明臍血nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增試劑盒，主要包括以下試劑：1)臍血nk細(xì)胞的樣本密度分離液：樣本密度分離液(專利號(hào)：zl201110456878.2，醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150002號(hào))，或市售其它淋巴細(xì)胞分離液；2)臍血nk細(xì)胞活化培養(yǎng)基：aimmediumctstm(購(gòu)自美國(guó)lifetechnology公司)培養(yǎng)基或gmps&xfmtm-cd培養(yǎng)基(專利申請(qǐng)?zhí)枺?01310082166.8；醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150008號(hào))，以及唑來(lái)膦酸、重組人白介素-2、重組人白介素-15和重組人白介素-18；3)臍血nk細(xì)胞增殖培養(yǎng)基：gmps&xfmtm-cd細(xì)胞培養(yǎng)基(專利申請(qǐng)?zhí)枺?01310082166.8；醫(yī)療器械備案號(hào)：京海械備20150008號(hào))和重組人白介素-2。該試劑盒可參照實(shí)施例1-4的方法進(jìn)行使用。工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明從分離的臍血單個(gè)核細(xì)胞通過(guò)活化培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)獲得臍血nk細(xì)胞，不需要細(xì)胞分選，不需要滋養(yǎng)層細(xì)胞，操作簡(jiǎn)單，通用性好，成本低，所用試劑不含動(dòng)物源成分，安全性好，且收獲的nk細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞總數(shù)可達(dá)1010-11個(gè)/份臍血，純度達(dá)90％以上，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力高。本發(fā)明能應(yīng)用于腫瘤免疫治療藥物的制備中。當(dāng)前第1頁(yè)12