本發(fā)明具體涉及干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種原代牙髓干細(xì)胞的制備方法及構(gòu)建牙髓干細(xì)胞庫(kù)的方法。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新、高度增殖和多向分化能力的細(xì)胞，在特定條件下能向人體成熟組織、器官進(jìn)行誘導(dǎo)分化，已被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)各個(gè)方面的研究。干細(xì)胞的來(lái)源主要為胚胎干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，其中胚胎干細(xì)胞由于涉及倫理學(xué)問(wèn)題而限制其臨床轉(zhuǎn)化研究；間充質(zhì)干細(xì)胞主要來(lái)源骨髓，即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但其在臨床轉(zhuǎn)化研究過(guò)程中存在給供體造成侵入性損傷等缺點(diǎn)。自從2000年gronthos等[gronthoss，mankanim，brahimj，etal.postnatalhumandentalpulpstemcells(dpscs)invitroandinvivo.procnatlacadsciusa，2000，97(25)：13625-13630.]從健康成人第三磨牙中發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞(dentalpulpstemcells，dpscs)以來(lái)，以前作為口腔醫(yī)療廢棄物的脫落牙齒和拔除智齒等已經(jīng)“變廢為寶”，成為dpscs研究的主要來(lái)源。dpscs是一種具有高度增殖能力和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有來(lái)源豐富、取材安全方便、不涉及倫理學(xué)問(wèn)題、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了很大進(jìn)展，具有廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，dpscs在適當(dāng)條件下能被誘導(dǎo)分化為骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神經(jīng)組織、肌組織、角膜等多種組織細(xì)胞，并能夠被誘導(dǎo)為具有類(lèi)胚胎干細(xì)胞特性的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，ipscs)，能夠作為以后多種疾病臨床轉(zhuǎn)化研究中的種子細(xì)胞。目前，已有多個(gè)國(guó)家建立牙髓干細(xì)胞庫(kù)以供臨床治療或科學(xué)研究需要。

牙髓干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程包括牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)、牙髓干細(xì)胞的傳代以及牙髓干細(xì)胞凍存三部分。其中，牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程又分為牙體收集、牙體運(yùn)輸、牙髓組織提取以及干細(xì)胞的培養(yǎng)等，而在這個(gè)過(guò)程中的每一步都對(duì)最終獲得牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)活性有較大的影響。目前，對(duì)于牙髓組織的提取和培養(yǎng)過(guò)程，傳統(tǒng)方法為組織塊直接培養(yǎng)法和膠原酶消化培養(yǎng)法兩種，但存在培養(yǎng)周期過(guò)長(zhǎng)、細(xì)胞量較少、易導(dǎo)致分化以及消化不完全或消化過(guò)度等缺點(diǎn)。

傳統(tǒng)酶消化法制備牙髓干細(xì)胞消化的時(shí)間為20min-3h不等，如專利人牙髓干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法(cn101717750a)里面提到，從正畸或智齒來(lái)源的牙髓組織剪碎后利用膠原酶和分散酶在37℃，5％co2環(huán)境中消化50min得到牙髓干細(xì)胞；專利一種臨床用牙髓干細(xì)胞及其制備方法(cn104694464a)利用膠原酶和dispaseii將牙髓組織消化1-3h得到牙髓干細(xì)胞；專利一種制備牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞及建立牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)的方法及細(xì)胞復(fù)蘇方法(cn104630141a)利用胰酶替代物消化牙髓組織20min得到牙髓干細(xì)胞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種原代牙髓干細(xì)胞的制備方法及構(gòu)建牙髓干細(xì)胞庫(kù)的方法，可以在短時(shí)間內(nèi)(≤10min)將牙髓組織消化好，提取到足夠多的dpscs。

本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案是：一種原代牙髓干細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

(1)牙體收集；

(2)牙髓提?。簩⑹占碾x體牙進(jìn)行前處理后提取牙髓；

(3)牙髓組織消化及干細(xì)胞培養(yǎng)：將提取的牙髓組織置于無(wú)菌pbs中，剪碎牙髓組織至1mm²，然后，利用離心管收集牙髓組織，并于常溫條件下1000rpm，離心10min，棄上清，滴加3mg/mli型膠原酶+4mg/ml中性蛋白酶混合酶吹散牙髓組織，i型膠原酶與中性蛋白酶體積比例為1∶1，置于37℃，180rpm恒溫?fù)u床環(huán)境中進(jìn)行消化，5-10min后，滴加血清培養(yǎng)基終止消化，1000rpm條件下，離心處理5min收集組織塊及細(xì)胞，1ml完全α-mem培養(yǎng)基重懸，接種于35mm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，于37℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1d后完全α-mem培養(yǎng)基補(bǔ)液2ml，每隔3d更換一次α-mem培養(yǎng)基；

(4)對(duì)牙髓干細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。

所述的完全α-mem培養(yǎng)基為10-20％fbs+100u/ml青霉素+100ug/ml鏈霉素。

所述的步驟(2)牙髓提取中前處理為采用牙齒儲(chǔ)存液沖洗離體牙的牙體2次，每次1min，然后利用1％聚維酮碘消毒液泡離體牙1min，最后再用牙齒儲(chǔ)存液沖洗離體牙2次，每次1min。

所述的步驟(4)對(duì)牙髓干細(xì)胞進(jìn)行傳代處理步驟為：當(dāng)牙髓細(xì)胞融合達(dá)到80％-90％時(shí)，用胰酶/edta混合酶進(jìn)行消化，1000rpm條件下離心5min，收集細(xì)胞，用完全α-mem培養(yǎng)基分散細(xì)胞，細(xì)胞懸液平均分配到2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3d換液一次。

一種構(gòu)建牙髓干細(xì)胞庫(kù)的方法，包括以下步驟：

(1)牙體收集；

(2)牙體運(yùn)輸；

(3)牙髓提?。?/p>

(4)牙髓組織消化及干細(xì)胞培養(yǎng)；

(5)牙髓干細(xì)胞的傳代；

(6)牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)功能檢測(cè)；

(7)牙髓干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇。

所述的牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)功能檢測(cè)包括cck-8檢測(cè)、免疫熒光染色檢測(cè)、成脂向分化檢測(cè)、成骨向分化檢測(cè)或成軟骨向分化檢測(cè)中的一種或幾種。

所述的步驟(7)牙髓干細(xì)胞的凍存包括以下步驟：取符合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牙髓干細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80％-90％時(shí)，用胰酶/edta混合酶進(jìn)行消化，1000rpm條件下離心5min，收集細(xì)胞，用10％dmso+90％fbs的細(xì)胞凍存液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×10⁶個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液1ml分別裝入凍存管中，然后將凍存管依次編號(hào)放入細(xì)胞專用凍存盒中，以1℃/min速度降溫，放入-80℃冰箱凍存12h，最后細(xì)胞凍存管轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期貯存，并做好相應(yīng)的登記。

所述的步驟(7)牙髓干細(xì)胞的復(fù)蘇包括以下步驟：細(xì)胞凍存管從液氮中取出后，快速放入37℃水浴環(huán)境中進(jìn)行解凍，然后用5ml的完全α-mem培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，1000rpm條件下離心5min，收集細(xì)胞，用完全α-mem培養(yǎng)基吹散，轉(zhuǎn)入35-mm無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入37℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，3天更換一次培養(yǎng)基。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種原代牙髓干細(xì)胞的制備方法及構(gòu)建牙髓干細(xì)胞庫(kù)的方法，利用恒溫?fù)u床在特定溫度和轉(zhuǎn)速條件下，可以在幾分鐘時(shí)間內(nèi)將牙髓組織消化好，提取到足夠多的具有較好生物學(xué)活性的牙髓干細(xì)胞，既縮短了牙髓干細(xì)胞原代提取的時(shí)間，節(jié)約了時(shí)間成本，可以大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)獲得的足量牙髓干細(xì)胞，能夠滿足牙髓干細(xì)胞在干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建以及后期干細(xì)胞臨床治療以及再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的使用需求，與常規(guī)條件下牙髓組織半消化30min或全消化1h左右對(duì)照組相比，dpscs量無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但細(xì)胞增殖活性明顯高于對(duì)照組。因此，本方法在dpscs庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程中可以成批快速進(jìn)行，縮短了dpscs原代提取的時(shí)間，節(jié)約了時(shí)間成本，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。

說(shuō)明書(shū)附圖

圖1為本發(fā)明牙髓組織的提取流程圖。

圖2為不同條件以及不同時(shí)間牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)8d以及傳代后第一代的光鏡圖片，其中tes代表在恒溫?fù)u床消化條件，te代表半消化，e代表全消化。

圖3為不同條件以及不同時(shí)間牙髓干細(xì)胞cck-8檢測(cè)結(jié)果，其中tes代表在恒溫?fù)u床消化條件，te代表半消化，e代表全消化。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，實(shí)施例僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不是對(duì)本發(fā)明的限定。

牙體收集

經(jīng)患者提前預(yù)約和登記后，在指定的口腔醫(yī)院門(mén)診室收集拔除的無(wú)齲牙健康智齒(年齡≤30歲)。首先，利用無(wú)菌pbs緩沖液沖洗離體牙2次，每次1min；其次，利用無(wú)菌眼科彎鑷仔細(xì)清理離體牙表面的殘留軟組織，并用無(wú)菌pbs緩沖液再次沖洗清理后的離體牙2次，每次1min；最后，利用75％酒精棉球擦拭離體牙2次，每次1min，然后置于含有4℃牙齒儲(chǔ)存液的無(wú)菌牙齒收集管中，冰盒保存。

牙齒儲(chǔ)存液配置：無(wú)菌pbs緩沖液+雙抗(100u/ml青霉素+100ug/ml鏈霉素)，體積比例10∶1。

牙體運(yùn)輸

收集到的離體牙在2-4℃條件下，運(yùn)送至干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室并于24h內(nèi)提取牙髓組織。

牙髓提取

離體牙的前處理：首先，利用牙齒儲(chǔ)存液沖洗離體牙的牙體2次，每次1min；然后，利用1％聚維酮碘消毒液(pvp-i)浸泡離體牙1min；最后，再用牙齒儲(chǔ)存液沖洗離體牙2次，每次1min。

牙髓提?。菏紫龋醚揽骗h(huán)形裂鉆環(huán)切牙體牙頸部(不暴露牙髓)；然后，利用無(wú)菌紗布包裹牙體，將牙體分離，暴露牙髓，置于含有牙齒儲(chǔ)存液的培養(yǎng)皿中；最后，利用探針、鑷子等醫(yī)療器械分離牙髓，置于無(wú)菌pbs中，如圖1所示。

牙髓組織消化及干細(xì)胞培養(yǎng)

將提取的牙髓組織置于無(wú)菌pbs中，使用顯微眼科剪，剪碎牙髓組織(大小約1mm²)；然后，利用離心管收集牙髓組織，并于常溫條件下1000rpm，離心10min。棄上清，滴加3mg/mli型膠原酶+4mg/ml中性蛋白酶混合酶(體積比例為1∶1)吹散牙髓組織，置于37℃，180rpm恒溫?fù)u床環(huán)境中進(jìn)行消化。分別于5、10、15以及20min后，滴加血清培養(yǎng)基終止消化，離心收集組織塊及細(xì)胞(1000rpm，5min)，1ml完全α-mem培養(yǎng)基(20％fbs+100u/ml青霉素+100ug/ml鏈霉素)重懸，接種于35-mm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，放入37℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1d后補(bǔ)液2ml，每隔3d更換一次培養(yǎng)基。其中，牙髓組織在37℃恒溫環(huán)境中半消化30min和全消化60min(細(xì)胞懸液利用70um細(xì)胞篩過(guò)濾)作為對(duì)照組，其他培養(yǎng)條件與實(shí)驗(yàn)組一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

牙髓干細(xì)胞的傳代

當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80％-90％時(shí)，用胰酶/edta混合酶進(jìn)行消化，離心(1000rpm，5min)，收集細(xì)胞，用完全α-mem培養(yǎng)基分散細(xì)胞，細(xì)胞懸液平均分配到2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3d換液一次。

牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)功能檢測(cè)

cck-8檢測(cè)：選取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的p1代牙髓干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×10³接種于96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入復(fù)蘇培養(yǎng)液，放入37℃，5％c02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3d更換一次培養(yǎng)基。分別于培養(yǎng)后1，3和5d，每孔加入10μl的cck-8溶液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1h，然后在酶標(biāo)儀上觀察450nm處的吸光度值(0d值)，結(jié)果如圖3所示，tes為10min，牙髓干細(xì)胞的增殖活性明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(^*p＜0.05versuste30min，^#p＜0.05versuse60min)。

免疫熒光染色：將恒溫?fù)u床條件下消化10min的p3代牙髓干細(xì)胞接種于六孔板爬片上，培養(yǎng)結(jié)束后，4％多聚甲醛固定30min，bsa聯(lián)合0.1tritonx-100破膜封閉30min；cd146，stro-1一抗4℃孵育過(guò)夜；pbst沖洗3次，二抗避光孵育1h，pbst沖洗3次，dapi避光孵育5min，pbst沖洗3次；熒光顯微鏡觀察拍片。

成脂向分化：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的p3代牙髓干細(xì)胞(恒溫?fù)u床條件下消化10min)，常規(guī)消化，所得的細(xì)胞懸液按照20000個(gè)/cm²的密度接種于六孔板中，滴加完全α-mem培養(yǎng)基，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3d換液一次，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到100％左右時(shí)，在完全α-mem細(xì)胞培養(yǎng)基中加入oricell^tm成脂誘導(dǎo)劑(cyagen，usa)，放入co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3d更換一次含有成脂誘導(dǎo)劑的細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)21d后，終止誘導(dǎo)，4％多聚甲醛(pfa)固定10min，油紅-o染色劑染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

成骨向分化：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的p3代牙髓干細(xì)胞(恒溫?fù)u床條件下消化10min)，常規(guī)消化，所得的細(xì)胞懸液按照20000個(gè)/cm²的密度接種于35-mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，滴加完全α-mem培養(yǎng)基，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70％左右時(shí)，在完全α-mem細(xì)胞培養(yǎng)基中加入oricell^tm成骨誘導(dǎo)劑(cyagen，usa)，放入co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3d更換一次含有成骨誘導(dǎo)劑的細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)21d后，終止誘導(dǎo)，室溫條件下，4％多聚甲醛(pfa)固定10min，茜素紅-s染色劑染色3min，光學(xué)顯微鏡觀察。

成軟骨向分化：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的p3代牙髓干細(xì)胞(恒溫?fù)u床條件下消化10min)，常規(guī)消化，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×10⁵個(gè)/ml，取1ml細(xì)胞懸液放入15ml離心管中，常溫離心(1000rpm，5min)收集細(xì)胞，棄上清，在該離心管中直接加入含有oricell^tm成軟骨誘導(dǎo)劑(cyagen，usa)的完全α-mem細(xì)胞培養(yǎng)基(加入過(guò)程必須緩慢，以免沖散細(xì)胞)，細(xì)胞以細(xì)胞團(tuán)的形式放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3d換液一次。28d后，終止誘導(dǎo)，4％多聚甲醛(pfa)固定過(guò)夜，石蠟包埋切片(4-5μm)，阿爾新藍(lán)染色劑染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

牙髓干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇

牙髓干細(xì)胞的凍存：取符合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牙髓干細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80％-90％時(shí)，用胰酶/edta混合酶進(jìn)行消化，離心(1000rpm，5min)，收集細(xì)胞，用細(xì)胞凍存液(10％dmso+90％fbs)調(diào)整細(xì)胞濃度為3×10⁶個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液1ml分別裝入凍存管(1.5ml)中，然后將凍存管依次編號(hào)放入細(xì)胞專用凍存盒(溫度下降速度：1℃/min)中，放入-80℃冰箱凍存12h，最后細(xì)胞凍存管轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期貯存，并做好相應(yīng)的登記。

牙髓干細(xì)胞的復(fù)蘇：實(shí)行快速?gòu)?fù)蘇的原則，細(xì)胞凍存管從液氮中取出后，快速放入37℃水浴環(huán)境中進(jìn)行解凍，然后用5ml的完全α-mem培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，離心(1000rpm，5min)，收集細(xì)胞，用完全α-mem培養(yǎng)基吹散，轉(zhuǎn)入35-mm無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入37℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，3天更換一次培養(yǎng)基。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實(shí)施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。