本發(fā)明涉及皮膚模型的建立方法，具體地，涉及用于建立抗炎抗敏功效評(píng)價(jià)的新型三維皮膚模型的方法。

背景技術(shù)：

皮膚作為覆蓋和保護(hù)體表的重要組織器官，阻擋外界物質(zhì)干擾的第一道關(guān)卡，容易受到外傷、燒傷、炎癥、潰瘍、腫瘤術(shù)后及先天疾病等因素的損害，同時(shí)會(huì)通過某些特殊反應(yīng)進(jìn)行防御。全世界皮炎、濕疹等過敏性皮膚病的發(fā)病率超過10％。目前在進(jìn)行皮膚抗炎抗敏藥物或化妝品原料的篩選非常不方便，成本也很高，二甲苯致小鼠耳腫脹、蛋清致大鼠足跖腫脹、大鼠棉球肉芽腫慢性炎癥模型、小鼠局部淋巴結(jié)致敏實(shí)驗(yàn)是常用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。然而，隨著歐洲的化妝品法規(guī)頒布關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在化妝產(chǎn)品中的禁令，讓抗炎抗敏的化學(xué)品和化妝品原料的篩選和開發(fā)更難實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，由于皮膚致敏和炎癥機(jī)制的復(fù)雜性，同一個(gè)體外測(cè)試系統(tǒng)中很難全面反映整個(gè)致敏致炎過程，因此，需要開發(fā)更多體外實(shí)驗(yàn)為化學(xué)品和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品的皮膚抗炎抗敏功效提供預(yù)測(cè)和評(píng)估。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決前述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種三維皮膚模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明三維皮膚模型的建立方法，包括如下步驟：

1)制備細(xì)胞外基質(zhì)高分子水凝膠溶液；

2)將成纖維細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)高分子水凝膠溶液混合，放入培養(yǎng)小室中培養(yǎng)；

3)接種角質(zhì)形成細(xì)胞，通過氣-液界面培養(yǎng)，得到包含真皮層、表皮層和角質(zhì)層的三維皮膚模型。

步驟1)中，所述細(xì)胞外基質(zhì)高分子水凝膠溶液是透明質(zhì)酸、聚乙二醇二丙烯酸酯和i型膠原的混合溶液，其中，透明質(zhì)酸、聚乙二醇二丙烯酸酯和i型膠原的重量比為4:1:1，優(yōu)選地，它們的濃度分別為6.67mg/ml、1.67mg/ml、1.67mg/ml。

步驟2)中，將成纖維細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)高分子水凝膠溶液混合的同時(shí)，加入1.25×10⁵～2×10⁵個(gè)肥大細(xì)胞，混合；

優(yōu)選地，所述肥大細(xì)胞按照如下方法制備：取瘢痕組織，除去皮下脂肪，切成小塊，加入消化液消化4h，再剪切至乳白色懸液，過濾收集濾液；在4℃條件下離心濾液，棄上清液，重懸，再離心，棄上清液，將懸浮細(xì)胞接種入含10％fbs的dmem培養(yǎng)液中培養(yǎng)，即得肥大細(xì)胞；所述消化液是ⅰ型膠原酶和透明質(zhì)酸酶的混合溶液，其中ⅰ型膠原酶的濃度為0.3mg/ml，透明質(zhì)酸酶的濃度為100u/ml。

步驟2)中，每1ml水凝膠溶液加入5×10⁵～8×10⁵個(gè)成纖維細(xì)胞，放入培養(yǎng)小室中，置于培養(yǎng)板中培養(yǎng)，培養(yǎng)30min后形成水凝膠，培養(yǎng)的時(shí)間為5日。

步驟3)中，接種的角質(zhì)形成細(xì)胞的量為：步驟2)中采用12孔板培養(yǎng)時(shí)，每孔加入2×10⁵～4×10⁵角質(zhì)形成細(xì)胞。

步驟3)中，氣-液界面培養(yǎng)的方法是：

接種角質(zhì)形成細(xì)胞后，在dmem培養(yǎng)基淹沒培養(yǎng)小室的情況下培養(yǎng)5日，然后在dmem培養(yǎng)基處于培養(yǎng)小室底部的情況下培養(yǎng)14日；

或者接種角質(zhì)形成細(xì)胞后，先在dmem培養(yǎng)基淹沒培養(yǎng)小室的情況下培養(yǎng)1日，加入免疫細(xì)胞至培養(yǎng)小室的周圍，繼續(xù)培養(yǎng)4日，然后在dmem培養(yǎng)基處于培養(yǎng)小室底部的情況下培養(yǎng)14日，即制備得到；其中，接種的角質(zhì)形成細(xì)胞的量為：步驟2)中采用12孔板培養(yǎng)時(shí)，每孔加入2×10⁵～5×10⁵免疫細(xì)胞，所述免疫細(xì)胞為單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、t淋巴細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞。

所述成纖維細(xì)胞按照如下方法制備：取皮膚真皮層組織，切成小塊，采用含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)，其間每2天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)6天后，回收細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞篩選成纖維細(xì)胞，即可；

所述角質(zhì)形成細(xì)胞按照如下方法制備：取皮膚表皮層組織，切成小塊，采用含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)，其間每2天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)6天后，回收細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞篩選角質(zhì)形成細(xì)胞，即可；

所述單核細(xì)胞按照如下方法制備：取血液，采用淋巴細(xì)胞分層液處理，離心，取單個(gè)核細(xì)胞層，采用rpmi-1640培養(yǎng)基，貼壁2h后，去除未貼壁或者未貼牢的細(xì)胞，刮下的貼壁細(xì)胞為單核細(xì)胞；

所述粒細(xì)胞按照如下方法制備：取血液，采用淋巴細(xì)胞分層液處理，離心，取粒細(xì)胞層，洗滌，采用rpmi-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，即得；

所述樹突狀細(xì)胞按照如下方法制備：取血液，采用淋巴細(xì)胞分層液處理，離心，取單個(gè)核細(xì)胞層，采用rpmi-1640培養(yǎng)基，貼壁2h后，去除未貼壁或者未貼牢的細(xì)胞，收集貼壁細(xì)胞，免疫磁珠法分離cd14+單核細(xì)胞,用含有10％fbs、50ng/mlrhgm-csf和25ng/mlil-4的rpmi-1640培養(yǎng)液置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6d，得樹突狀細(xì)胞；

所述t淋巴細(xì)胞按照如下方法制備：取血液，采用淋巴細(xì)胞分層液處理，離心，取單個(gè)核細(xì)胞層，采用rpmi-1640培養(yǎng)基，貼壁2h后，收集未貼壁的細(xì)胞，加入含10％fbs的rpmi-1640培養(yǎng)液，即得t淋巴細(xì)胞；

所述巨噬細(xì)胞按照如下方法制備：取血液，采用淋巴細(xì)胞分層液處理，離心，取單個(gè)核細(xì)胞層，采用rpmi-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)1-2d，加入終濃度為125ng/ml的佛波酯(pma)的rpmi-1640培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞分化，培養(yǎng)2-3d，即得巨噬細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了前述方法建立的三維皮膚模型。

本發(fā)明還提供了前述三維皮膚模型在篩選皮膚抗炎抗敏藥物中的用途。

本發(fā)明還提供了一種篩選治療皮膚抗炎抗敏藥物的方法，包括如下步驟：

a、按照前述的方法建立的三維皮膚模型；

b、將候選物施用于a步驟所述的三維皮膚模型；

c、用三維皮膚模型評(píng)價(jià)潛在的抗炎抗敏藥物。

建立基于皮膚致敏發(fā)炎實(shí)驗(yàn)整合測(cè)試體系提供整合檢測(cè)策略，研發(fā)含有免疫細(xì)胞用于抗炎抗敏功效檢測(cè)的皮膚模型。應(yīng)用已經(jīng)構(gòu)建的皮膚模型建立一個(gè)規(guī)范化、安全、高效的體外護(hù)膚保健品三維皮膚評(píng)價(jià)體系，作為替代傳統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法之一，對(duì)單個(gè)化學(xué)品與產(chǎn)品安全性及功效性檢測(cè)的體外評(píng)價(jià)方法，驗(yàn)證其實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性、可重復(fù)性、以及作為替代方法的可行性，為三維皮膚研究提供重要參考，為化學(xué)品和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品的皮膚抗敏抗炎功效提供預(yù)測(cè)和評(píng)估，同時(shí)為我國(guó)在替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法方面提供具有參考意義的依據(jù)。

三維皮膚(3d-skin)是一種較為完善的組織工程化皮膚，是將真皮成纖維細(xì)胞、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)替代物混合制成的人工皮膚。組織工程化皮膚除在臨床使用以外，由于其穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)便也促進(jìn)了其在非臨床研究工作中的開展。在皮膚生物學(xué)研究領(lǐng)域，皮膚衰老、光保護(hù)、代替動(dòng)物測(cè)試實(shí)驗(yàn)等領(lǐng)域，體外構(gòu)建的三維皮膚均具有很高的應(yīng)用價(jià)值。三維皮膚模型可以滿足不同細(xì)胞間的相互作用，可以為invitro與invivo之間提供一個(gè)重要的橋梁。

本發(fā)明方法可以有效建立三維皮膚模型，而且制備方法簡(jiǎn)便，可以用于皮膚抗炎抗敏藥物的篩選，應(yīng)用前景優(yōu)良。

根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

附圖說明

圖1a、c生長(zhǎng)不良成纖維細(xì)胞；b、d生長(zhǎng)良好的成纖維細(xì)胞

圖2a、c生長(zhǎng)不良角質(zhì)形成細(xì)胞；b、d生長(zhǎng)良好的角質(zhì)形成細(xì)胞

圖3a單獨(dú)hystemtm(巰基修飾的透明質(zhì)酸ha)；b單獨(dú)extralinktm(聚乙二醇二丙烯酸酯,pegda)；c單獨(dú)i型膠原；d本發(fā)明透明質(zhì)酸-膠原蛋白水凝膠

圖4三維皮膚模型及he染色

圖5三維皮膚模型模擬圖

圖6全皮層皮膚模型的構(gòu)建示意圖

圖7外周血來源免疫細(xì)胞培養(yǎng)

圖8含有原代外周血來源免疫細(xì)胞(單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞等)的三維皮膚模型培養(yǎng)

圖9含有肥大細(xì)胞三維皮膚模型如

圖10含肥大細(xì)胞三維皮膚模型

圖11炎癥因子檢測(cè)指標(biāo)(固相芯片)

圖12he染色、掃描電鏡觀察

圖13經(jīng)受試物處理后細(xì)胞存活率

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1本發(fā)明三維皮膚模型的制備

在體外將皮膚全層包括免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)的所有類型細(xì)胞以及生物支架材料復(fù)合構(gòu)建出具有與正常皮膚結(jié)構(gòu)形態(tài)相似皮膚的方法。

1本發(fā)明三維皮膚模型的構(gòu)建方法

1.1各種細(xì)胞的來源和制備

1)成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的獲得：

取正常人的皮膚組織，將組織進(jìn)行消毒，分離出真皮層組織與表皮層組織小塊(3mm×3mm)。將組織小塊放于無菌培養(yǎng)皿中，添加培養(yǎng)基(含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基)。組織小塊貼壁于培養(yǎng)皿的貼面處，一部分細(xì)胞會(huì)貼在培養(yǎng)皿表面生長(zhǎng)，其間每2天更換一次培養(yǎng)液，并通過顯微鏡觀察其生長(zhǎng)情況，通過6天的培養(yǎng)后，回收細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞。前述方法種，細(xì)胞培養(yǎng)的條件為37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

獲得成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)圖如圖1b、d、圖2b、d所示。

2)原代外周血細(xì)胞的獲得：

無菌采集靜脈血6ml注入肝素抗凝管中，輕輕搖勻，室溫下加入等體積的pbs或hank,s液，輕輕吹打混勻。6ml淋巴細(xì)胞分層液置于離心管中，再將稀釋后的血樣品在分離液面上方，18-20℃，2000rpm，離心30min，離心后從管底至液面分四層，依次為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層、分層液層、單個(gè)核細(xì)胞層、血漿層。

其中單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)方法為：將上層淡黃色的稀釋血漿移除，輕輕吸出乳白色的單個(gè)核細(xì)胞層，放入新的離心管中，加入pbs洗滌兩次，加rpmi-1640培養(yǎng)基(含10％fbs)培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞。

其中單核細(xì)胞培養(yǎng)方法為：將上述單個(gè)核細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(rpmi-1640培養(yǎng)基)，貼壁2h后，吸去未貼壁的細(xì)胞，洗下未貼牢的細(xì)胞，刮下貼壁細(xì)胞為單核細(xì)胞，加rpmi-1640培養(yǎng)基(含10％fbs)培養(yǎng)單核細(xì)胞。

其中粒細(xì)胞培養(yǎng)方法為：依次將上層淡黃色的稀釋血漿移除，乳白色的單個(gè)核細(xì)胞層移除，分離層移除，輕輕吸取出粒細(xì)胞，放入新的離心管中，加入pbs洗滌兩次，加rpmi-1640培養(yǎng)基(含10％fbs)培養(yǎng)粒細(xì)胞。

其中樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)方法為：上述單個(gè)核細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶(rpmi-1640培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，貼壁2h后，吸去未貼壁的細(xì)胞，收集貼壁的單核細(xì)胞，免疫磁珠法分離cd14+單核細(xì)胞,用含有10％fbs、50ng/mlrhgm-csf和25ng/mlil-4的rpmi-1640培養(yǎng)液置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5-6d后細(xì)胞即可分化為樹突狀細(xì)胞。

其中t淋巴細(xì)胞分離方法為：上述單個(gè)核細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，貼壁2h后，收集未貼壁的細(xì)胞，加入含10％fbs的rpmi-1640培養(yǎng)液，即得t淋巴細(xì)胞。

其中巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)方法為：上述單核細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1-2d，加入終濃度為125ng/ml的佛波酯(pma)的rpmi-1640培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞分化，培養(yǎng)2-3d，即分化為巨噬細(xì)胞。

外周血來源免疫細(xì)胞培養(yǎng)如圖7所示。

3)原代肥大細(xì)胞的獲得

手術(shù)切取的人瘢痕組織，除去皮下脂肪，用tyrode液清晰皮片并切成1mm²大小的小塊，加入消化液(0.3mg/ml的ⅰ型膠原酶和100u/ml的透明質(zhì)酸酶)消化4h，再剪切至乳白色懸液，過濾收集濾液。在4℃條件下離心濾液，棄上清液，用冷的tyrode液重新懸浮沉淀，再離心，棄上清液，將懸浮細(xì)胞接種入含10％fbs的dmem培養(yǎng)液，即得肥大細(xì)胞。

1.2建模方法

1)制備細(xì)胞外基質(zhì)高分子水凝膠溶液：

透明質(zhì)酸-膠原蛋白水凝膠：hystem試劑盒(sigma)內(nèi)凍干狀固體hystemtm(巰基修飾的透明質(zhì)酸ha)和extralinktm(聚乙二醇二丙烯酸酯,pegda)分別用去離子水溶解后獲得10mg/ml儲(chǔ)存液，i型膠原(sigma)配制為10mg/ml，ph值為7.2的存儲(chǔ)液。ha、pegda與i型膠原(4:1:1)混合均勻后，即得水凝膠溶液。

水凝膠溶液凝固，即可得到水凝膠三維支架，其示意圖如圖3d所示。

2)構(gòu)建三維皮膚模型

a、第一種：全皮層皮膚模型

構(gòu)建示意圖如圖6所示：

將成纖維細(xì)胞接種入水凝膠溶液中，每1ml水凝膠溶液加入5×10⁵～8×10⁵個(gè)細(xì)胞，輕輕放入培養(yǎng)小室(transwell)中移入12孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，30分鐘后水凝膠溶液固化形成水凝膠，即為含有成纖維細(xì)胞的支架，添加dmem培養(yǎng)基淹沒培養(yǎng)小室，培養(yǎng)構(gòu)建真皮，培養(yǎng)5日后，在其支架表面接種角質(zhì)形成細(xì)胞(每孔加入2×10⁵～4×10⁵)，通過氣-液界面培養(yǎng)形成表皮：具體是先在dmem培養(yǎng)基淹沒培養(yǎng)小室的情況下培養(yǎng)5日，然后在在dmem培養(yǎng)基處于培養(yǎng)小室底部的情況下培養(yǎng)14日，即制備得到。

對(duì)皮膚模型進(jìn)行石蠟包埋處理后，進(jìn)行he染色，與正常人皮膚進(jìn)行形態(tài)學(xué)對(duì)比，判斷其培養(yǎng)狀況。三維皮膚模型及he染色如圖4所示；三維皮膚模型模擬圖如圖5所示。

b、第二種：含外周血來源免疫細(xì)胞的三維皮膚模型

構(gòu)建示意圖如圖8所示：

將成纖維細(xì)胞接種入水凝膠溶液中，每1ml水凝膠溶液加入5×10⁵～8×10⁵個(gè)細(xì)胞，輕輕放入培養(yǎng)小室(transwell)中移入12孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，30分鐘后水凝膠溶液固化形成水凝膠，即為含有成纖維細(xì)胞的支架，添加dmem培養(yǎng)基淹沒培養(yǎng)小室，培養(yǎng)構(gòu)建真皮，培養(yǎng)5日后，在其支架表面接種角質(zhì)形成細(xì)胞(每孔加入2×10⁵～4×10⁵個(gè)細(xì)胞)，通過氣-液界面培養(yǎng)形成表皮：具體是先在dmem培養(yǎng)基淹沒培養(yǎng)小室的情況下培養(yǎng)1日，加入免疫細(xì)胞(單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、t淋巴細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞)至培養(yǎng)小室的周圍，每孔加入2×10⁵～5×10⁵個(gè)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4日，然后在dmem培養(yǎng)基處于培養(yǎng)小室底部的情況下培養(yǎng)14日，即制備得到。

c、第三種：含有肥大細(xì)胞的三維皮膚模型

構(gòu)建示意圖如圖9所示：

將成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞接種入水凝膠溶液中，每1ml水凝膠溶液加入5×10⁵～8×10⁵個(gè)成纖維細(xì)胞和1.25×10⁵～2×10⁵個(gè)肥大細(xì)胞，輕輕放入培養(yǎng)小室(transwell)中移入12孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，30分鐘后水凝膠溶液固化形成水凝膠，即為含有成纖維細(xì)胞的支架，添加dmem培養(yǎng)基淹沒培養(yǎng)小室，培養(yǎng)構(gòu)建真皮，培養(yǎng)5日后，在其支架表面接種角質(zhì)形成細(xì)胞(每孔加入2×10⁵～4×10⁵)，通過氣-液界面培養(yǎng)形成表皮：具體是先在dmem培養(yǎng)基淹沒培養(yǎng)小室的情況下培養(yǎng)5日，然后在dmem培養(yǎng)基處于培養(yǎng)小室底部的情況下培養(yǎng)14日，即制備得到。

2模型檢測(cè)

1)he染色和檢測(cè)方法所構(gòu)建組織工程皮膚觀察所構(gòu)建的皮膚結(jié)構(gòu)以及各種免疫細(xì)胞的形成情況；

a)含有原代外周血來源免疫細(xì)胞(單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞等)的三維皮膚模型

培養(yǎng)24-72h將皮膚模型與免疫細(xì)細(xì)胞分離，并用生理鹽水將皮膚模型表面沖洗干凈并準(zhǔn)備進(jìn)行he染色；分離后的免疫細(xì)胞用于檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)；培養(yǎng)上清用于炎癥因子檢測(cè)。

he染色：取中性甲醛固定之標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，在石蠟切片機(jī)上做連續(xù)切片，裱于經(jīng)apes處理的玻片上，切片置于60℃恒溫烤箱內(nèi)烘烤，he染色后封固,光鏡觀察。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血來源免疫細(xì)胞(單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞等)的參數(shù)：從細(xì)胞培養(yǎng)板中取出細(xì)胞，每孔分別移入相應(yīng)ep管中，使用離心機(jī)離心(250g，5min，4℃)收集細(xì)胞，用facs緩沖液(pbs+0.1％的bsa)清洗一次，重懸細(xì)胞。再加入含有單克隆抗體稀釋液，室溫避光反應(yīng)20min，離心去上清液，加pbs液稀釋混勻后上機(jī)檢測(cè)，采用facs-calibur(美國(guó)bd公司產(chǎn)品)，氬離子激光，功率為15mw，激發(fā)光波長(zhǎng)488nm。

檢測(cè)結(jié)果：

中性粒細(xì)胞：gr-1，cd11b

成熟t細(xì)胞(cd3+)、t輔助誘導(dǎo)細(xì)胞(cd3+/cd4+)、

單核細(xì)胞cd14+

粒細(xì)胞cd15+

樹突狀細(xì)胞：cd11c+，mhcii+

巨噬細(xì)胞：cd14+，cd11b+

b)含有肥大細(xì)胞的三維皮膚模型

he染色：取中性甲醛固定之標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，在石蠟切片機(jī)上做連續(xù)切片，裱于經(jīng)apes處理的玻片上，切片置于60℃恒溫烤箱內(nèi)烘烤，he染色后封固,光鏡觀察。

肥大細(xì)胞(甲苯胺藍(lán))染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，甲苯胺藍(lán)染液中30min后稍水洗，冰醋酸液中分化，蒸餾水洗后吹干,二甲苯透明,中性樹膠封固后光鏡下觀察。

肥大細(xì)胞三維皮膚模型如圖10。

2)用已知刺激物檢測(cè)模型，檢測(cè)生物標(biāo)記物表達(dá)的改變。

刺激物對(duì)照組：脂多糖(lps)、2,4-壬二烯

保護(hù)物對(duì)照組：米諾地爾

陰性對(duì)照物：雙蒸水

將預(yù)孵育的皮膚模型(第二種：含外周血來源免疫細(xì)胞的三維皮膚模型)置于接種置于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；將樣品受試物涂抹于皮膚模型表面，于培養(yǎng)箱中后孵育24h，每組樣品進(jìn)行3組平行試驗(yàn)；24h后用生理鹽水將皮膚模型表面受試物沖洗干凈并準(zhǔn)備進(jìn)行mtt測(cè)試，掃描電鏡觀察，he染色，流式細(xì)胞檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)變化；上清液采用固相芯片proteomeprofilerhumancytokinearraykit(bd)檢測(cè)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。炎癥因子檢測(cè)指標(biāo)如圖11所示。

結(jié)果如圖12～13所示：

通過監(jiān)測(cè)暴露受試物后的細(xì)胞活率、形態(tài)變化、細(xì)胞因子表達(dá)情況、細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況和相對(duì)熒光強(qiáng)度，判斷化學(xué)物或個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品的皮膚抗炎抗敏功效。

對(duì)三維皮膚模型上添加500um的2,4-壬二烯醛或2ug/mllps培養(yǎng)6小時(shí)，然后除去培養(yǎng)液，重新添加培養(yǎng)液48h，之后制作成切片進(jìn)行觀察拍攝。對(duì)比無處理對(duì)照組，在縱剖切片上觀察到較多由于變態(tài)反應(yīng)和炎癥引起的皮膚空洞；在橫剖切片上觀察到皮膚表面形成了較多的鱗屑狀皮損。lps和2,4-壬二烯醛誘發(fā)的三維皮膚的損傷了皮膚的整體，對(duì)受損三維皮膚模型添加0.1mm的米諾地爾，對(duì)上側(cè)培養(yǎng)6小時(shí)，皮膚空洞與表面鱗屑皮損得到了有效的修復(fù)。

采用前述方法對(duì)前述第一種全皮層皮膚模型和第三種含有肥大細(xì)胞的三維皮膚模型進(jìn)行檢測(cè)，lps和2,4-壬二烯醛同樣可以誘發(fā)三維皮膚的損傷，對(duì)受損三維皮膚模型添加0.1mm的米諾地爾，對(duì)上側(cè)培養(yǎng)6小時(shí)，皮膚空洞與表面鱗屑皮損也得到了有效的修復(fù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明三維皮膚模型建立成功，可用于皮膚抗炎抗敏藥物的篩選。

該實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明建立了三維皮膚模型，可用于篩選皮膚抗炎抗敏藥物，應(yīng)用前景優(yōu)良。