本發(fā)明具體涉及干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牙髓干細(xì)胞復(fù)蘇液及牙髓干細(xì)胞的復(fù)蘇方法。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新、高度增殖和多向分化能力的細(xì)胞，在特定條件下能向人體成熟組織、器官進(jìn)行誘導(dǎo)分化，已被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)各個(gè)方面的研究。干細(xì)胞的來(lái)源主要為胚胎干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，其中胚胎干細(xì)胞由于涉及倫理學(xué)問(wèn)題而限制其臨床轉(zhuǎn)化研究；間充質(zhì)干細(xì)胞主要來(lái)源骨髓，即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但其在臨床轉(zhuǎn)化研究過(guò)程中存在給供體造成侵入性損傷等缺點(diǎn)。自從2000年gronthos等[gronthoss，mankanim，brahimj，etal.postnatalhumandentalpulpstemcells(dpscs)invitroandinvivo.procnatlacadsciusa，2000，97(25)：13625-13630.]從健康成人第三磨牙中發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞(dentalpulpstemcells，dpscs)以來(lái)，以前作為口腔醫(yī)療廢棄物的脫落牙齒和拔除智齒等已經(jīng)“變廢為寶”，成為dpscs研究的主要來(lái)源。牙髓干細(xì)胞是一種具有高度增殖能力和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有來(lái)源豐富、取材安全方便、不涉及倫理學(xué)問(wèn)題、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了很大進(jìn)展，具有廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，dpscs在適當(dāng)條件下能被誘導(dǎo)分化為骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神經(jīng)組織、肌組織、角膜等多種組織細(xì)胞，并能夠被誘導(dǎo)為具有類(lèi)胚胎干細(xì)胞特性的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，ipscs)，能夠作為以后多種疾病臨床轉(zhuǎn)化研究中的種子細(xì)胞。

dpscs作為種子細(xì)胞應(yīng)用于臨床研究過(guò)程中，大多數(shù)時(shí)候并不是立即取用，而是事先建立有干細(xì)胞庫(kù)，貯存dpscs，等臨床需要時(shí)及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇和擴(kuò)增，以達(dá)到臨床治療的需求。因此，建立一種有效的dpscs復(fù)蘇方法，使得細(xì)胞復(fù)蘇后活力快速恢復(fù)并保持相關(guān)干性功能顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種牙髓干細(xì)胞復(fù)蘇液及牙髓干細(xì)胞的復(fù)蘇方法，可以使dpscs活力在短時(shí)間內(nèi)快速恢復(fù)，并保持原有干細(xì)胞的干性和多向分化潛能，能夠縮短干細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)間以及提高干細(xì)胞臨床使用存活率。

本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案是：一種牙髓干細(xì)胞復(fù)蘇液，其特征在于，所述的牙髓干細(xì)胞復(fù)蘇液由間充質(zhì)干細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)組成，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基由α-mem培養(yǎng)基+10-20％胎牛血清+100u/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素組成，所述的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)作用的終濃度為10-20ng/ml。

所述的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)作用的終濃度為20ng/ml

一種牙髓干細(xì)胞的復(fù)蘇方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)牙髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定：收集健康患者牙齒，先用75％酒精擦拭牙體表面，再用含青霉素和鏈霉素的無(wú)菌pbs浸洗2次備用，在無(wú)菌條件下，利用裂鉆環(huán)切牙齒，取出牙髓，剪成組織塊，用i型膠原酶和中性蛋白酶混合酶在37℃環(huán)境中消化30min，消化結(jié)束后吹散，離心收集細(xì)胞，接種于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，滴加完全α-mem培養(yǎng)基，放入37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，5d后更換第一次培養(yǎng)基，隨后常規(guī)3d更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合達(dá)到80％一90％后，利用胰酶/edta常規(guī)消化細(xì)胞，傳代，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第二代dpscs，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶個(gè)/ml，分裝至1.5ml的ep管中，分別加入適量的鼠抗人cd90、cd73以及cd14，室溫避光將細(xì)胞與抗體的混合液孵育1h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)；

(2)牙髓干細(xì)胞的凍存：第二代牙髓干細(xì)胞融合度達(dá)到80-90％以后，常規(guī)消化，1000rpm條件下離心5min收集細(xì)胞，加入細(xì)胞凍存液吹散，然后將細(xì)胞以濃度為3×10⁶個(gè)/ml分裝入細(xì)胞凍存管中，移入細(xì)胞專(zhuān)用凍存盒內(nèi)，放入-80℃條件下過(guò)夜，最后轉(zhuǎn)入液氮環(huán)境中進(jìn)行長(zhǎng)期凍存；

(3)dpscs的復(fù)蘇：選取在液氮中凍存3個(gè)月的牙髓干細(xì)胞，在37℃恒溫水浴環(huán)境中快速解凍，然后利用常規(guī)α-mem培養(yǎng)稀釋?zhuān)x心收集細(xì)胞，然后添加含有bfgf的牙髓干細(xì)胞復(fù)蘇液，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天更換一次培養(yǎng)基。

所述的步驟(1)中完全α-mem培養(yǎng)基由20％fbs+100u/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素組成。

所述的步驟(2)中細(xì)胞凍存液由10％dmso+90％fbs組成。

所述的步驟(3)中常規(guī)α-mem培養(yǎng)由10％fbs+100u/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素組成。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種牙髓干細(xì)胞復(fù)蘇液及牙髓干細(xì)胞的復(fù)蘇方法，通過(guò)在常規(guī)干細(xì)胞培養(yǎng)基中添加添加一定量的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子構(gòu)建新的干細(xì)胞復(fù)蘇液，并用這種復(fù)蘇液應(yīng)用于dpscs的復(fù)蘇過(guò)程，可以使dpscs活力在短時(shí)間內(nèi)快速恢復(fù)，并保持原有干細(xì)胞的干性和多向分化潛能，能夠縮短干細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)間以及提高干細(xì)胞臨床使用存活率，增殖速度超過(guò)常規(guī)培養(yǎng)基組，同時(shí)維持細(xì)胞干性和多向分化潛能，能夠有效為臨床干細(xì)胞治療提供性能和狀態(tài)較好的種子細(xì)胞，節(jié)省了大量的時(shí)間、人力以及物力成本。

說(shuō)明書(shū)附圖

圖1為dpscs原代培養(yǎng)的7d以及14d的光鏡圖片。

圖2為dpscs表面標(biāo)記物cd90、cd73以及cd14的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。

圖3為含有不同濃度bfgf復(fù)蘇液培養(yǎng)第一代dpscs(p1-ac)的cck-8結(jié)果。

圖4為第一代dpscs經(jīng)過(guò)不同濃度bfgf作用，第二代dpscs(p2-ac)恢復(fù)為常規(guī)培養(yǎng)基的cck-8結(jié)果.

圖5為第一代dpscs經(jīng)過(guò)20ng/mlbfgf作用，第二代dpscs(p2-ac)恢復(fù)為常規(guī)培養(yǎng)基的免疫熒光結(jié)果。

圖6為第一代dpscs經(jīng)過(guò)20ng/mlbfgf作用，第二代dpscs(p2-ac)恢復(fù)為常規(guī)培養(yǎng)基的western-blotting結(jié)果。

圖7為第一代dpscs經(jīng)過(guò)20ng/mlbfgf作用，第二代dpscs(p2-ac)恢復(fù)為常規(guī)培養(yǎng)基的成神經(jīng)誘導(dǎo)后表面標(biāo)記物nestin/gfap免疫熒光結(jié)果。

圖8為第一代dpscs經(jīng)過(guò)20ng/mlbfgf作用，第二代dpscs(p2-ac)恢復(fù)為常規(guī)培養(yǎng)基的成脂誘導(dǎo)后脂滴油紅-0染色結(jié)果。

圖9為第一代dpscs經(jīng)過(guò)20ng/mlbfgf作用，第二代dpscs(p2-ac)恢復(fù)為常規(guī)培養(yǎng)基的成骨誘導(dǎo)后鈣化結(jié)節(jié)茜素紅-s染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，實(shí)施例僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不是對(duì)本發(fā)明的限定。

牙髓干細(xì)胞復(fù)蘇液的配制：

主要由間充質(zhì)干細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)共同組成，其中，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基為：a-mem培養(yǎng)基(gibco，usa)+10％胎牛血清(fbs，gibco，usa)+100u/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素(gibco，usa).bfgf作用的終濃度分別為5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，80ng/ml和100ng/ml。

牙髓干細(xì)胞的復(fù)蘇過(guò)程：

dpscs的分離、培養(yǎng)及鑒定：收集臨床上19-29歲健康患者牙齒，先用75％酒精擦拭牙體表面，再用含青霉素和鏈霉素的無(wú)菌pbs浸洗2次備用。在無(wú)菌條件下，利用裂鉆環(huán)切牙齒，取出牙髓，剪成大小約1mm²的組織塊，用i型膠原酶和中性蛋白酶混合酶在37℃環(huán)境中消化30min，消化結(jié)束后吹散，離心收集細(xì)胞，接種于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，滴加完全α-mem培養(yǎng)基(20％fbs+100u/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，放入37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，5d后更換第一次培養(yǎng)基，隨后常規(guī)3d更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合達(dá)到80％-90％后，利用胰酶/edta常規(guī)消化細(xì)胞，傳代，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第二代dpscs，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶個(gè)/ml，分裝至1.5ml的ep管中，分別加入適量的鼠抗人cd90、cd73以及cd14，室溫避光將細(xì)胞與抗體的混合液孵育1h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

dpscs的凍存：第二代dpscs融合度達(dá)到80-90％以后，常規(guī)消化，離心收集細(xì)胞(1000rpm，5min)，加入細(xì)胞凍存液(10％dmso+90％fbs)吹散，然后將細(xì)胞以濃度為3×10⁶個(gè)/ml分裝入細(xì)胞凍存管中，移入細(xì)胞專(zhuān)用凍存盒內(nèi)，放入-80℃冰箱中過(guò)夜，最后轉(zhuǎn)入液氮環(huán)境中進(jìn)行長(zhǎng)期凍存。

dpscs的復(fù)蘇：選取在液氮中凍存3個(gè)月的dpscs，在37℃恒溫水浴環(huán)境中快速解凍，然后利用常規(guī)α-mem培養(yǎng)基(10％fbs+100u/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)稀釋?zhuān)x心收集細(xì)胞，然后添加含有bfgf的復(fù)蘇培養(yǎng)基(α-mem+10％fbs+100u/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天更換一次培養(yǎng)基。bfgf作用的終濃度分別為5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，80ng/ml和100ng/ml，且bfgf只作用于復(fù)蘇第一代的dpscs，復(fù)蘇第二代dpscs培養(yǎng)基更換為常規(guī)干細(xì)胞培養(yǎng)基。復(fù)蘇第一代和第二代的dpscs分別標(biāo)記為p1-ac和p2-ac。

bfgf作用后牙髓干細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)性能檢測(cè)：

細(xì)胞增殖活性檢測(cè)(cck-8檢測(cè))：選取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的dpscs(p1-ac)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×10³接種于96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入復(fù)蘇培養(yǎng)液，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天更換一次培養(yǎng)基。同時(shí)，細(xì)胞傳代以后(dpscs(p2-ac))培養(yǎng)基全部更換為常規(guī)培養(yǎng)基(α-mem+10％fbs+100u/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，分別于培養(yǎng)后1，3，5和7d，每孔加入10μl的cck-8溶液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1h，然后在酶標(biāo)儀上觀察450nm處的吸光度值(od值)。同等條件下，常規(guī)培養(yǎng)基設(shè)為對(duì)照組。

免疫熒光染色：主要通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物cd146和stro-1熒光染色來(lái)檢測(cè)dpscs的干性功能，具體步驟如下：將細(xì)胞接種于六孔板爬片上，培養(yǎng)結(jié)束后，pbs沖洗3次，4％多聚甲醛固定30min，pbs沖洗3次，bsa聯(lián)合0.1tritonx-100破膜封閉30min；cd146，stro-1一抗4℃孵育16h；pbst沖洗3次，二抗避光孵育1h，pbst沖洗3次，dapi避光孵育5min，pbst沖洗3次；熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，拍照記錄。

western-blotting檢測(cè)：將細(xì)胞接種于六孔板，培養(yǎng)結(jié)束后，pbs沖洗3次，ripa及pmsf冰上裂解細(xì)胞，4℃離心取上清，westernblotting檢測(cè)cd146以及nanog的表達(dá)。每孔蛋白量一致，10％sds-page膠進(jìn)行電泳，結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至pvdf膜，牛奶封閉2h，tbst沖洗3次，一抗4℃孵育16h，tbst沖洗3次，二抗孵育1h，tbst沖洗3次。最后，通過(guò)bio-rad蛋白凝膠成像系統(tǒng)觀察和分析相關(guān)靶蛋白的量。

成神經(jīng)誘導(dǎo)：將一定密度細(xì)胞(4×10³cells/cm2)接種于六孔板，1d后，更換神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(dmem高糖培養(yǎng)基含10-7m地塞米松，50μg/ml維生素c，50μm吲哚美辛，10μg/ml胰島素，45mmibmx)，每3d更換一次培養(yǎng)液。誘導(dǎo)6d后，pbs沖洗3次，4％多聚甲醛固定30min，pbs沖洗3次，bsa聯(lián)合0.1tritonx-100破膜封閉30min；nestin和gfap一抗4℃孵育16h；pbst沖洗3次，二抗避光孵育1h，pbst沖洗3次，dapi避光孵育5min，pbst沖洗3次；熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，拍照記錄。

成脂誘導(dǎo)：將一定密度細(xì)胞(2×10⁴cells/cm2)接種于六孔板，每孔加入2ml常規(guī)培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到100％時(shí)，培養(yǎng)基更換為2mloricell^tm成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(cyagen，usa)a液，誘導(dǎo)3d后，更換為2mloricell^tm成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基b液，1d后再次換回a液，a液和b液交替作用4次后(16d)，繼續(xù)用b液維持培養(yǎng)6d，每3d更換一次誘導(dǎo)液。成脂誘導(dǎo)分化結(jié)束后，固定，油紅o染料工作液染色，顯微鏡下觀察成脂染色效果。

成骨誘導(dǎo)：將細(xì)胞按照一定密度(2×10⁴cells/cm2)接種于六孔板，孔加入2ml常規(guī)培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60％-70％時(shí)，更換為2mloricell^tm干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基(cyagen，usa)。每3d更換一次新鮮誘導(dǎo)液，2w后固定，茜素紅染色，顯微鏡下觀察成骨染色效果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，結(jié)果顯示原代培養(yǎng)第7d時(shí)，組織塊周?chē)延醒浪韪杉?xì)胞爬出，14d時(shí)細(xì)胞基本長(zhǎng)滿，呈典型成纖維細(xì)胞樣形狀。

如圖2所示，結(jié)果顯示，dpscs陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物cd90(98.82％)、cd73(99.72％)以及陰性表達(dá)cd14(0.85％)。

如圖3所示，結(jié)果顯示，dpscs在各種濃度bfgf作用下呈現(xiàn)一個(gè)持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，且bfgf作用終濃度為20ng/ml時(shí)，細(xì)胞增殖速度明顯高于其他組，在第5d和7d時(shí)，od值分別為0.9970和2.0912，是對(duì)照組的1.37倍和1.24倍。

如圖4所示，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)20ng/mlbfgf預(yù)處理的dpscs增殖速度明顯高于其他組，且在第7d時(shí)達(dá)到一個(gè)高峰值(od：2.0482)，說(shuō)明只需要利用含有20ng/mlbfgf的復(fù)蘇培養(yǎng)液作用于復(fù)蘇后第一代dpscs，傳代后，第二代dpscs同樣具有較好的生長(zhǎng)和增殖作用，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組bfgf濃度只選用20ng/ml。

如圖5所示，結(jié)果顯示，dpscs(p2-ac)陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物cd146和stro-1，dpscs(p2-ac)仍具有間充質(zhì)干細(xì)胞的干性功能。

如圖6所示，結(jié)果顯示dpscs(p2-ac)表達(dá)cd146和nanog，說(shuō)明dpscs(p2-ac)的干性功能未受影響。

如圖7所示，結(jié)果表明，dpscs(p2-ac)陽(yáng)性表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)記物nestin和gfap，能夠成功向神經(jīng)樣細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

如圖8所示，結(jié)果顯示，dpscs(p2-ac)有明顯脂滴出現(xiàn)，說(shuō)明能夠成功向成脂肪樣細(xì)胞方向進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

如圖9所示，結(jié)果顯示，dpscs(p2-ac)有明顯鈣化結(jié)節(jié)出現(xiàn)，說(shuō)明能夠成功向成骨細(xì)胞方向進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

表1不同濃度bfgf作用于復(fù)蘇第一代dpscs(p1-ac)的450nm處od值

表2經(jīng)過(guò)不同濃度bfgf預(yù)處理后第二代dpscs(p2-ac)的450nm處od值

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實(shí)施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。