牙髓干細胞的規(guī)模化生產(chǎn)工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種牙髓干細胞的規(guī)?；a(chǎn)工藝，包括以下步驟：（1）牙髓干細胞的分離提??；（2）牙髓干細胞的二維培養(yǎng)擴增；（3）牙髓干細胞的檢測；（4）牙髓干細胞的大規(guī)模培養(yǎng)；（5）牙髓干細胞的冷凍保存；（6）牙髓干細胞的長期冷凍保存。本發(fā)明提供了一種牙髓干細胞的體外規(guī)?；囵B(yǎng)擴增方法，建立了高質量高活性牙髓干細胞的長期、標準化、系統(tǒng)化凍存體系，以便為臨床及科研提供足夠高質量的干細胞資源，成本低廉，應用前景廣闊。
【專利說明】牙髓干細胞的規(guī)?；a(chǎn)工藝
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程領域，具體涉及干細胞的培養(yǎng)擴增及冷凍保存方法，更具體涉及牙髓干細胞的規(guī)?；a(chǎn)工藝。
【背景技術】
[0002]1999年，《Science》將人類胚胎干細胞研究成果評為當年世界十大科技進展之首，2000年，《Time》周刊將其列為20世紀末世界十大科技成就之首，并認為胚胎干細胞和人類基因組將同時成為新世紀最具發(fā)展和應用前景的領域。至此干細胞研究成為近年來生物學以及醫(yī)學領域中最引人注目的熱點之一。干細胞是在生物個體的生長和發(fā)育中起“主干”作用的原始細胞，是一種具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體，它包括胚胎干細胞和成體干細胞。雖然胚胎干細胞能分化成各種細胞類型，但這種分化是"非定位性"的，而且存在倫理道德等方面的問題。成體干細胞則不存在著倫理、法律、免疫排斥反應等問題，同時具有取材方便、來源廣等優(yōu)點，因而，成體干細胞在組織工程、基因治療及個體化治療的研究中具有較好的臨床應用前景。
[0003]由于各種原因導致的牙體缺損和牙齒缺失已成為危害口腔乃至人體健康的一種普遍存在的疾病，其發(fā)病率呈逐年增加的趨勢。目前主要借助于各種牙科材料填充來應對牙齒缺損疾病，雖然在一定程度上能阻止病變的繼續(xù)發(fā)展，但不能解決根本問題。對于牙齒缺失，盡管解決途徑很多，但最有效和最根本的辦法還是牙齒的生物性再生。
[0004]隨著組織再生醫(yī)學的快速發(fā)展，為牙體缺損和牙齒缺失的有效治療帶來了希望。目前已有許多研究利用牙源性上皮和牙源性間充質的相互作用再生出了牙齒組織。常用的牙源性間充質包括牙乳頭細胞和牙髓組織細胞。由于牙乳頭細胞在臨床上難以獲得，因此目前用于牙體及牙齒再生的種子細胞首選牙髓組織來源的細胞，其中最主要的是牙髓干細胞。
[0005]2000 年首次發(fā)現(xiàn)了牙髓干細胞(S.Gronthos, M.Mankani, J.Brahim, P.GehronRobey, and S.Shi, Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs)invitro and invivo, Proc Natl Acad Sci USA.2000 December 5; 97 (25): 13625-13630.)。牙髓干細胞是一類具有高增殖能力、高度自我更新能力、多向分化能力等干細胞特性的細胞，因此是構建牙體及牙齒組織的理想種子細胞。已有研究利用該細胞構建牙髓、牙本質以及牙齒組織。
[0006]牙髓干細胞的發(fā)現(xiàn)，為牙齒組織工程學帶來了突破性的進展。但同其它組織的工程學一樣，作為種子細胞的牙髓干細胞的快速獲取和快速擴增，是牙齒組織工程學發(fā)展的一個瓶頸。
[0007]在牙髓干細胞臨床應用過程中，目前突出的問題是一次成功的治療需要一定數(shù)量的細胞，這意味著如何在短時間內獲得大量有效高活性的細胞以提供給病人使用是一個很關鍵的問題。因此，體外大量擴增牙髓干細胞的研究越來越受到研究人員和臨床醫(yī)生的重視。目前已經(jīng)出現(xiàn)了一些擴增干細胞的方法和裝置，但是傳統(tǒng)的二維平面擴增干細胞方法，較難在短時間內得到足夠的細胞量，而且多次的傳代次數(shù)會造成干細胞質量降低，相對于強大的臨床需求，其數(shù)量也遠遠不夠。
[0008]而另一方面，從乳牙到恒牙替換，阻生牙、多生牙的拔除及畸牙校正，大量的牙齒被廢棄，其中的牙髓干細胞資源白白流失。因此，發(fā)明一種牙髓干細胞長期冷凍保存的方法同樣具有重要意義。
[0009]傳統(tǒng)的貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)采用靜止或者轉瓶等培養(yǎng)方法，操作復雜，耗費空間及人力。1967年，Van Wezel首次提出了“微載體系統(tǒng)”的概念，為貼壁依賴性細胞的高密度培養(yǎng)提供了思路，并創(chuàng)建了生物反應器微載體培養(yǎng)細胞工藝，使動物細胞培養(yǎng)進入高密度培養(yǎng)階段微載體是指由交聯(lián)葡聚糖或者其他聚合物組成微珠，直徑一般在60-200 μ m之間，適用于貼壁依賴性細胞的生長。使用此類小球為細胞提供貼附面積，通過輕輕攪拌使載體懸浮于培養(yǎng)液中，細胞也成為了懸浮狀態(tài)，這種培養(yǎng)方式被稱為微載體培養(yǎng)技術。目前使用的微載體有商業(yè)化的 Cytodex l/3、Cultispher G/S、Biosilon、Hillex 和 HyQSp,以及自制的纖維素、陶瓷、殼聚糖、膠原、明膠、PCL、PLA、PLGA等。由于微載體本身所占體積和質量不大，但有很大的有效面積可供細胞附著，因而大大提高了生產(chǎn)效率。比如5mg CytodexI表面積能達到30cm2/mL，而傳統(tǒng)的單層培養(yǎng)難以達到如此高的表面積/容積比。IL微載體培養(yǎng)生產(chǎn)的細胞相當于50個轉瓶所生產(chǎn)的細胞。這種培養(yǎng)方式對勞動力的需求也下降了許多，省卻了玻璃容器等的清洗和準備工作；細胞與培養(yǎng)液的分離簡單，一旦攪拌停止，3min后細胞即能依靠其重力而沉降，無需進行離心操作，減少了復雜的操作步驟。而且，細胞生理活性培養(yǎng)參數(shù)等容易控制，污染概率也大大降低。
[0010]大規(guī)模干細胞培養(yǎng)過程中的主要障礙包括供養(yǎng)限制，副產(chǎn)物積累，更加智能的過程控制，動物細胞對機械剪切力的極度敏感等問題。
[0011]干細胞臨床治療需要大量高活性的干細胞，所以如何在體外短期內培養(yǎng)足夠數(shù)量的高質量的治療用細胞以及提供一個規(guī)?；?、標準化、系統(tǒng)化的細胞儲存系統(tǒng)成為了學術界和產(chǎn)業(yè)界密切關注的焦點，目前關于這一方面的研究也剛剛起步。
[0012]發(fā)明概述
[0013]本發(fā)明針對現(xiàn)有作為種子細胞的牙髓干細胞的快速獲取、擴增與長期保存難等問題，尋找一種更為高效的培養(yǎng)擴增及長期保存方法。本發(fā)明使用生物反應器微載體培養(yǎng)牙髓干細胞技術大量擴增干細胞，并建立了牙髓干細胞的標準化，系統(tǒng)化凍存體系，解決了這類資源得不到重復利用的現(xiàn)狀，并建立了長期高質量儲存牙髓干細胞的細胞庫以方便為臨床以及科研提供足夠高質量的干細胞資源，成本低廉，應用前景廣闊。
[0014]本發(fā)明提供的牙髓干細胞的規(guī)模化生產(chǎn)工藝包括如下步驟:
[0015](I)牙髓干細胞的分離提取:將牙髓組織用膠原酶消化后，在含胎牛血清細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)器皿中進行，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，3天換液；
[0016](2)牙髓干細胞的培養(yǎng)擴增:將步驟(1)培養(yǎng)所得的原代細胞以
0.1X IO5-L OX IO5個細胞/cm2的密度接種于二維培養(yǎng)器皿中，加入新鮮細胞培養(yǎng)液，于37°C>5% CO2條件下培養(yǎng)，3天換液；
[0017](3)牙髓干細胞的檢測:進行細胞活性檢測、無菌性檢測和流式細胞檢測；
[0018](4)牙髓干細胞的大規(guī)模培養(yǎng):采用轉瓶培養(yǎng)或生物反應器培養(yǎng)，將牙髓干細胞接種在轉瓶或生物反應器中后，調整溶解氧濃度、PH值、攪拌轉速和通氣量，根據(jù)取樣分析細胞計數(shù)、存活率、營養(yǎng)成分和代謝物的結果更換培養(yǎng)基，從而達到細胞的高密度大規(guī)模培養(yǎng);
[0019](5)牙髓干細胞的冷凍保存:將檢測合格的細胞凍存于管內，細胞的詳細信息掃描入數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，自動化系統(tǒng)根據(jù)液氮情況自動尋找空缺位置，將細胞凍存于相應的空格中；
[0020](6)根據(jù)需要，進行牙髓干細胞的長期冷凍保存，保存期間定期從凍存環(huán)境中取出細胞進行復蘇檢測。
[0021]步驟(1)中，牙髓組織是在無菌條件下挑選的，用緩沖液沖洗后剪碎；牙髓組織的消化采用5~10倍體積的0.1%~0.6%膠原酶，于37°C培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)3(Tl80min后用含胎牛血清的細胞培養(yǎng)液終止消化，所述細胞培養(yǎng)液商品化的含10-20%胎牛血清的α -MEM、DMEM培養(yǎng)基及無血清培養(yǎng)基。這些細胞培養(yǎng)液中含有支持干細胞生長的糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等。
[0022]步驟(1)中的培養(yǎng)步驟包括將經(jīng)消化的牙髓組織在80(Tl500r/min離心3~10min后棄上清、加5~10倍體積細胞培養(yǎng)液重懸細胞，轉入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)，所述細胞培養(yǎng)液商品化的含10-20%胎牛血清的a-MEM、DMEM培養(yǎng)基以及無血清培養(yǎng)基。這些細胞培養(yǎng)液中含有支持干細胞生長的糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等。
[0023]步驟(2)中，原代細胞在長滿培養(yǎng)器皿底部80%_90%時用胰酶溶液消化并吹打細胞，使細胞完全脫離原代培養(yǎng)器皿后接種于二維培養(yǎng)器皿。所述二維培養(yǎng)器皿可選自細胞培養(yǎng)孔板、培養(yǎng)皿和組織培養(yǎng)方瓶。
[0024]步驟(4)中所述的轉瓶培養(yǎng)按以下過程進行:將微載體經(jīng)預處理、轉瓶硅化、121°C高溫滅菌后，接種細胞，微載體加入量為2-10g/L，大小范圍為60-300 μ m,接種密度為3X 104-3X 105個細胞/ml，轉瓶的大小范圍為25ml_500ml，轉速范圍50_75rpm。
[0025]步驟(4)中所述·的生物反應器選自細胞培養(yǎng)生物反應器，包括攪拌式生物反應器、固定床生物反應器、WAVE生物反應器等。
[0026]本發(fā)明的生產(chǎn)工藝中，所使用的攪拌式生物反應器、WAVE生物反應器按以下過程進行細胞培養(yǎng):將微載體用PBS沖洗2次，第三次加入PBS放入4°C冰箱內平衡水化過夜，高壓蒸汽滅菌后，接種牙髓干細胞，微載體的加入量為3-10g/L，接種密度為I X IO5-1O6個細胞/mL，細胞擴增至密度為5X 105-2X 107個細胞/mL。本發(fā)明的生產(chǎn)工藝中，所使用的固定床生物反應器按以下過程進行細胞培養(yǎng):在生物反應器中加入經(jīng)表面處理切割好的聚酯切片作為細胞載體，并加入磷酸緩沖液，高溫蒸汽滅菌后加入細胞培養(yǎng)液，接種牙髓干細胞，其中聚酯纖維載體的使用量為每升罐體積25-45g，接種密度為IXlO5-1O6個細胞/mL，細胞擴增至密度為5 X 105-2 X IO7個細胞/mL。上述生物反應器培養(yǎng)條件所述溶解氧濃度為 40%-60%、pH 值為 7.0-7.2、攪拌轉速為 50_100rpm。
[0027]本發(fā)明的生產(chǎn)工藝中，步驟(5)中輸入的細胞詳細信息包括供者姓名、細胞代數(shù)、細胞培養(yǎng)液成分和濃度、細胞接種密度、凍存液成分和凍存日期；所述冷凍保存包括將所獲得的牙髓干細胞按I X IO6^l X IO7個/ml細胞密度在凍存液中重懸，分裝入凍存管，經(jīng)過程序降溫后，將凍存管轉移至_196°C液氮中冷凍保存。所述凍存液包含DMS0、胎牛血清和a -MEM培養(yǎng)液1:2:7 (體積比)。
[0028]根據(jù)需要，進行牙髓干細胞的長期冷凍保存，保存期間定期從凍存環(huán)境中取出細胞進行復蘇檢測。[0029]發(fā)明詳述
[0030]下面詳細描述本發(fā)明的牙髓干細胞規(guī)模化生產(chǎn)工藝。
[0031]一、牙髓干細胞的分離提取
[0032]將供體新鮮牙齒組織采用含抗生素的緩沖鹽溶液完成轉移，在無菌條件下挑選牙髓組織并用緩沖液沖洗；將挑選出的牙髓組織剪碎，加入5^10倍的0.1%~0.6%膠原酶作為消化液，用吸管吹散均勻，置于37°C培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)3(Tl80min。消化完成后，在懸液中加入含15%胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)液終止消化，在80(Tl500r/min離心5~lOmin，棄上清后，加入5^10倍體積的含15%胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)液重懸細胞，轉入培養(yǎng)器皿中進行原代培養(yǎng)。
[0033]二、牙髓干細胞的培養(yǎng)擴增
[0034]當原代細胞長滿器皿底80~90%，用含0.25%EDTA的胰酶溶液消化并吹打細胞，使細胞完全脫離后，采用不同的培養(yǎng)方式重新接種，并加入細胞培養(yǎng)液，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)擴增。
[0035]當采用二維培養(yǎng)器皿進行牙髓干細胞培養(yǎng)擴增時，根據(jù)培養(yǎng)容器的底部表面積及原代細胞的數(shù)量，將原代細胞以0.1 X IO5-L O X IO5個細胞/cm2的密度接種于二維培養(yǎng)器皿中，加入細胞培養(yǎng)液(例如含15%胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)液)于37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，3天換液。
[0036]二維培養(yǎng)器皿常見的有各種細胞培養(yǎng)孔板、Petri培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)方瓶等。
[0037]三、牙髓干細胞的檢測
[0038]在牙髓干細胞 提取之后，進行細胞活性檢測、無菌性檢測、流式細胞檢測等。
[0039]細胞活性檢測，包括在顯微鏡下觀察細胞生長情況，將細胞接種于24孔板內，用cck-8法制作細胞生長曲線。
[0040]無菌性檢測，收集培養(yǎng)過細胞的培養(yǎng)液，在25°C、37°C的生化培養(yǎng)箱內培養(yǎng)后在顯微鏡下觀察進行真菌、細菌檢測。
[0041]流式細胞檢測，檢測細胞的特異性，包括間充質干細胞特異性表面標志物StiO-1、⑶29、⑶44、⑶71、⑶90、⑶106、CD 120等，以及其它系細胞表面標志物，如如⑶14、⑶34、CD45 等。
[0042]四、牙髓干細胞的大規(guī)模培養(yǎng)
[0043]采用轉瓶培養(yǎng)或生物反應器進行牙髓干細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，應調整溶解氧濃度、PH值、攪拌轉速和通氣量，根據(jù)取樣分析細胞計數(shù)、存活率、營養(yǎng)成分和代謝物的結果更換培養(yǎng)基，從而達到細胞的高密度大規(guī)模培養(yǎng)。
[0044]反應器培養(yǎng)的一個主要問題就是溶氧限制，培養(yǎng)基中的氧氣的溶解度很低(7.6 μ g/ml)，典型密度2X 106/ml培養(yǎng)的細胞在不到Ih的時間內就會耗盡培養(yǎng)基中的氧氣，因此必須在培養(yǎng)周期內不斷向培養(yǎng)基中通入氧氣。通過控制空氣、氮氣、二氧化碳、氧氣的比例維持培養(yǎng)液中的溶解氧在一個合適的水平供細胞消耗。培養(yǎng)過程中通過攪拌一方面使細胞懸浮于培養(yǎng)基中，另一方面可以促進液體混合傳質，提高供氧能力。細胞代謝的副產(chǎn)物積累會影響培養(yǎng)液的PH值從而影響到細胞生長，所以需要通過分析培養(yǎng)基成分控制添加新鮮培養(yǎng)基的速率，以提供給細胞一個良好的營養(yǎng)環(huán)境。
[0045]轉瓶培養(yǎng)擴增的過程包括:將微載體經(jīng)預處理、轉瓶硅化、121°C高溫滅菌后，接種細胞，微載體加入量為2-20g/L，接種密度為3X 104-3X IO5個細胞/ml，轉瓶的大小范圍為25ml-500ml，微載體的大小范圍為60-300 μ m，轉速范圍50-75rpm/min，培養(yǎng)方式是分批培養(yǎng)。
[0046]生物反應器培養(yǎng)擴增的過程包括:①微載體的預處理:將微載體用PBS沖洗2次，第三次加入PBS放入4°C冰箱內平衡水化過夜，高壓蒸汽滅菌；②將轉瓶或大量二維平皿擴增培養(yǎng)的牙髓干細胞用含15%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種在微載體上，反應器的體積為3-10L，微載體的加入量為3-10g/L，接種密度為I X IO5-1O6個細胞/mL，細胞培養(yǎng)擴增至密度為5X 105-2X IO7個細胞/mL ;③用含EDTA的胰酶收獲所擴增的牙髓干細胞，進行后續(xù)檢測。
[0047]生物反應器培養(yǎng)擴增可以是一級生物反應器培養(yǎng)，也可以是多級培養(yǎng)。在一級生物反應器中細胞生長到一定程度時，根據(jù)對細胞數(shù)量的要求可進行下一級細胞放大培養(yǎng)，即將微載體上的細胞完全消化之后作為種子細胞接種下一級生物反應器或者直接添加新的微載體進行球轉球放大培養(yǎng)。
[0048]生物反應器可選自攪拌式生物反應器、固定床生物反應器、波浪式(wave)生物反應器等，以及其他各種形式和基于各種原理的細胞體外大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)或裝置。
[0049]攪拌式生物反應器主要是通過攪拌器轉動來攪動培養(yǎng)液以增加傳質能力，確保細胞培養(yǎng)的氧濃度和營養(yǎng)物質的均一性，達到大規(guī)模培養(yǎng)細胞的目的，同時使培養(yǎng)液對細胞施加一定的剪應力。目前在醫(yī)學組織工程研究中最常用的是攪拌瓶反應器。其主要特點是采用磁力轉子攪動培養(yǎng)液，把干細胞接種在磁力攪拌的培養(yǎng)液中，細胞在持續(xù)攪動的培養(yǎng)液中生長。攪拌式生物反應器的最大優(yōu)點是，能培養(yǎng)各種類型的動物細胞，培養(yǎng)工藝容易放大，產(chǎn)品質量穩(wěn)定，非常適合于工廠化生產(chǎn)。
[0050]固定床生物反應器內部填充片狀載體，使細胞貼服生長，通過連續(xù)灌注新鮮培養(yǎng)液使細胞達到較高密度，培養(yǎng)過程中，細胞營養(yǎng)充足，代謝廢物能及時去除，為細胞生長提供一個良好的環(huán)境。使用的片狀載體包括NBS公司的聚酯纖維等一切可以利于細胞貼服生長的材料。
[0051]WAVE生物反應器是一次性使用的波浪袋生物反應器，用以替代傳統(tǒng)的不銹鋼發(fā)酵罐。一次性反應器適用于各種類型的細胞培養(yǎng)。溫和的波浪式運動可以起到良好的供氧和混合的目的，同時，這種運動方式所產(chǎn)生的剪切力也很小，遠遠小于傳統(tǒng)罐體中用攪拌或者氣升式方法所產(chǎn)生的剪切力；能夠支持高密度大規(guī)模細胞培養(yǎng)，并且不會形成泡沫和剪切力的破壞作用。
[0052]采用以上生物反應器進行細胞培養(yǎng)的模式包括分批培養(yǎng)模式、間歇式培養(yǎng)模式和連續(xù)灌注式培養(yǎng)模式。
[0053]分批培養(yǎng)模式是將壓碎干細胞和培養(yǎng)液一次性裝入生物反應器內進行培養(yǎng)，細胞不斷生長、大量擴增，經(jīng)過一段時間之后，將這個反應系統(tǒng)取出，消化得到高質量的牙髓干細胞。
[0054]間歇式培養(yǎng)模式采用間歇式生物反應器，在反應器中加入培養(yǎng)液，進行滅菌后，接入細胞株，在維持適合細胞生長和產(chǎn)物生成的條件下進行細胞培養(yǎng)，反應過程中除需要通入一定量的無菌空氣、消泡劑和酸堿外，一般不再加入培養(yǎng)基和培養(yǎng)物，也不取出產(chǎn)物，只有等反應進行到一定程度后，才全部將培養(yǎng)液放出，進行后處理。[0055]連續(xù)灌注式培養(yǎng)模式，在連續(xù)灌注式生物反應器系統(tǒng)中安裝細胞微載體截留裝置，將細胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應器內進行培養(yǎng)。一方面新鮮培養(yǎng)液不斷加入反應器內；另一方面又將反應液連續(xù)不斷地取出，使反應條件處于一種恒定狀態(tài)。連續(xù)灌注式生物反應器可以對細胞的微環(huán)境進行更為精確的監(jiān)測和控制，既省時省力，又減少了細胞發(fā)生污染的機會，培養(yǎng)細胞的密度及質量可以得到很大提高。
[0056]五、牙髓干細胞的冷凍保存
[0057]細胞收獲之后，用培養(yǎng)液反復吹打細胞，混勻，送入藥品非臨床研究質量管理規(guī)范標準實驗室進行質量檢測，包括無菌檢測，支原體檢測，病毒檢測，免疫表形檢測，細胞技術和活力測定，生物學效力檢測，細胞分化能力檢測以確定其是否到達合格標準。經(jīng)過檢測符合標準的牙髓干細胞按I X IO6~I X IO7個細胞/ml的密度在凍存液DMS0、胎牛血清和a-MEM培養(yǎng)液1:2:7中重懸，分裝入凍存管。
[0058]填寫細胞的詳細信息，包括供者姓名、細胞代數(shù)、細胞培養(yǎng)液成分和濃度、細胞接種密度、凍存液成分和凍存日期等，完整記錄每一樣本的真實冷凍狀況，凍存管上的信息感應部位對準掃描儀器，將信息準確無誤地掃描入數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，完成細胞庫信息錄入和構建。
[0059]各凍存管經(jīng)過程序降溫后，轉移至_196°C液氮中冷凍保存。系統(tǒng)根據(jù)液氮情況自動尋找空缺位置，將細胞凍存于相應的空格中。
[0060]凍存空間應符合國家相關文件規(guī)定，具有良好的衛(wèi)生環(huán)境，包括潔凈區(qū)、通風、采光環(huán)境。
[0061]凍存期間定期從凍存環(huán)境中取出細胞進行檢測。定期檢測的內容包括細胞復蘇、細胞活性檢測。
[0062]本發(fā)明提供的牙髓·干細胞規(guī)?；a(chǎn)工藝建立了牙髓干細胞大量擴增方法，并建立了牙髓干細胞的標準化、系統(tǒng)化凍存體系，建立了長期高質量儲存牙髓干細胞的細胞庫，以便為臨床及科研提供足夠高質量的干細胞資源，成本低廉，應用前景廣闊。
[0063]本發(fā)明的牙髓干細胞規(guī)模化生產(chǎn)工藝中尤其使用了生物反應器微載體培養(yǎng)技術大量培養(yǎng)干細胞。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點:
[0064](I)微載體表面積/體積比大,單位體積培養(yǎng)細胞的產(chǎn)率高。較傳統(tǒng)的單層細胞培養(yǎng)面積大大增加，可以在短期內大量得到牙髓干細胞；
[0065](2)微載體懸浮于培養(yǎng)基中，牙髓干細胞生長環(huán)境均一，簡化了培養(yǎng)條件的監(jiān)測和控制，同時培養(yǎng)基利用率高；
[0066](3)采樣重演性好，細胞最終收獲過程不復雜，勞動強度小，占用空間小，操作簡便，所需人員少，工藝容易放大生產(chǎn)，可以保證細胞質量；
[0067](4)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)符合最新的法規(guī)標準，安全性更好。
[0068]同時，本發(fā)明的牙髓干細胞規(guī)?；a(chǎn)工藝中尤其采用了標準化、系統(tǒng)化的牙髓干細胞長期凍存方法。干細胞通過體外大規(guī)模擴增后，按照標準化流程凍存，凍存空間具有良好的衛(wèi)生環(huán)境，包括潔凈區(qū)，通風，采光環(huán)境，符合國家相關文件規(guī)定。同時，詳細記錄的細胞信息以備未來科研和臨床使用。
[0069]本發(fā)明的牙髓干細胞規(guī)?；a(chǎn)工藝不僅能大大增加牙髓干細胞作為種子細胞的數(shù)量，而且能夠長期保持其生長與分化的能力，冷凍復蘇后也能夠保持其干細胞的基本特性，經(jīng)過冷凍保存后能夠為未來的臨床以及科研提供大量的牙髓干細胞資源。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0070]圖1是本發(fā)明牙髓干細胞規(guī)?；a(chǎn)工藝的流程圖。
【具體實施方式】
[0071]以下用實驗例對本發(fā)明作進一步闡述。本【技術領域】普通技術人員應當認識到，這些實驗例僅僅用于舉例說明本發(fā)明而不對本發(fā)明的范圍構成任何限制，對本發(fā)明所作的任何改變，只要不違背本發(fā)明的精神實質，都將落在權利要求范圍內。
[0072]實例中的操作均在嚴格無菌環(huán)境下進行，為保證細胞不受污染，在所有使用的磷酸鹽緩沖液、細胞培養(yǎng)液中均加有100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素。
[0073]實施例1、牙髓干細胞分離提取[0074]將供體新鮮牙齒組織采用含抗生素的PBS溶液完成轉移，在無菌條件下挑選出牙髓組織并用PBS緩沖液沖洗；將挑選出的牙髓組織剪碎，加入10倍體積的0.3% I型膠原酶，用吸管吹散均勻，置于37°C振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)120min ;完成消化后，在懸液中加入含15%胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)液，終止消化，在1000r/min離心5min，棄上清后，加入5倍體積的含15%胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)液重懸細胞，轉入6孔板中進行，于37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，3天換液。
[0075]實施例2、牙髓干細胞的二維培養(yǎng)器皿培養(yǎng)擴增(二維培養(yǎng)器皿包括細胞培養(yǎng)孔板、培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)方瓶)，本實施例采用的是平皿培養(yǎng)。
[0076]當細胞長滿平皿的80%時，棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗滌2遍，加入覆蓋皿底量的
0.25%含有EDTA的胰蛋白酶，消化3-4min，期間不間斷用倒置顯微鏡觀察，見胞質回縮，細胞間隙增大，細胞變圓，立即加入與胰酶等體積的細胞培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復吹打貼壁細胞，將細胞吹打下來，1000r/min離心5min，再用細胞培養(yǎng)液重懸細胞，按照密度為6X IO4個細胞/ml，接種到平皿中，加入新鮮細胞培養(yǎng)液于37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，3天換液。即可得到2 X IO5個細胞/ml細胞，細胞數(shù)量擴增3倍。
[0077]實施例3、牙髓干細胞在含微載體的轉瓶中培養(yǎng)擴增
[0078]在本實施例中使用的是含有微載體的轉瓶培養(yǎng)擴增細胞，轉瓶工作體積為125ml，微載體為Cytodex-3。
[0079]①轉瓶預處理:125ml轉瓶清洗干凈，烘干至完全干燥，20ml加入硅化液(Sigmacote, Sigma)于轉瓶中，緩慢旋轉轉瓶使娃化液浸潤瓶壁，吸去娃化液后，將轉瓶置于通風處風干12h，蒸餾水沖洗備用；
[0080]②微載體預處理:本實施例中微載體密度定為2g/L，由于培養(yǎng)體積為50ml，因此稱取0.lgCytodex-3轉瓶中，加入20ml PBS浸泡3h，吸去后加入20ml新的PBS，121 °C高壓蒸汽滅菌20min，吸去PBS并加入20ml含15%胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)液，37°C浸泡過夜；
[0081]③牙髓干細胞的接種:取4平皿生長至80%融合的牙髓干細胞，0.25%胰酶-EDTA消化后，以15%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，1000rpm離心5min，新鮮培養(yǎng)液重懸，以4X IO4個細胞/ml的密度接種在三維微載體上。將含有8 X IO6個細胞的懸液加入含有Cytodex-3的轉瓶中，再分別補足培養(yǎng)液至25ml，置于Wheaton磁力攪拌器上間歇攪拌，間歇攪拌條件為45rpm攪拌2min，停止13min，如此循環(huán)3h，37°C，5%C02。接種結束后，分別補入25ml培養(yǎng)液至50ml最終工作體積，轉速調整為55rpm，每2天更換2/3培養(yǎng)液直至培養(yǎng)結束。
[0082]④牙髓干細胞的獲取:停止轉瓶內的攪拌，棄去上清液，0.25%胰酶-EDTA消化后，以15%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，1000rpm離心5min，新鮮培養(yǎng)液重懸，可得到5.8 X IO5個細胞/ml密度的細胞，細胞數(shù)量擴增14.5倍。
[0083]實施例4、攪拌式生物反應器培養(yǎng)擴增牙髓干細胞
[0084]用平皿或轉瓶小規(guī)模培養(yǎng)擴增牙髓干細胞，達到足夠的細胞數(shù)量。
[0085]連接反應器氣路管，進液管，出液管等管路，121°C高壓濕熱滅菌40min，打入新鮮的細胞培養(yǎng)液，攪拌2天進行培養(yǎng)液檢菌。
[0086]微載體的水化過程:稱取15g微載體置一干凈容器，使用無Ca2+，Mg2+的PBS在室溫下水化過夜并不時溫和攪拌。棄去上清，加入新鮮的無Ca2+，Mg2+的PBS，溫和攪拌后洗滌2次，棄去洗滌的PBS，加入PBS，121 °C高壓濕熱滅菌20min。
[0087]將預先水化、滅菌的微載體接種到3L培養(yǎng)液中。
[0088]挑選形態(tài)健康，生長良好的平皿生產(chǎn)細胞用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，按照6 X IO5個/mL制成細胞懸液，半量接種至反應器中，調節(jié)反應器的溫度，培養(yǎng)液pH，溶氧等參數(shù)，是細胞生長于最適宜環(huán)境進行細胞培養(yǎng)。80rpm轉3min,靜置12min,如此重復12個循環(huán)，結束后接種剩余細胞，以IOOrpm的轉速連續(xù)培養(yǎng)。
[0089]采用灌注模式進行培養(yǎng)，溶氧是細胞代謝中的重要參數(shù)，它可以影響細胞的產(chǎn)率，所以需要時時觀測調節(jié)溶氧量維持在50%，此過程可通過計算機有序定量地控制加入動物細胞培養(yǎng)罐內的空氣、氧氣、氮氣和二氧化碳四種氣體的流量使其保持最佳的比例來實現(xiàn)。
[0090]計算機實時自動將反應器溫度控制在37±0.2°C,pH:7.0-7.2。
[0091]細胞接種第2天，根據(jù)細胞的生長匯合情況判斷是否進行灌注培養(yǎng)及灌注體積，一般灌注體積為反應器I個工作體積，之后可控制在l_2vvD。
[0092]每天取樣觀察拍照，計算細胞數(shù)目。當細胞長滿微載體表面，數(shù)目達到約5.4 X IO6個/mL時，停止培養(yǎng)。
[0093]通過反應器的微載體/細胞截留裝置將高壓液體排出，加入500mLPBS沖洗2_3次，IOOmL胰酶/EDTA加入罐子，消化20min，加入等體積培養(yǎng)液終止消化，收獲細胞，細胞數(shù)量擴增9倍。
[0094]實施例5、固定床式生物反應器培養(yǎng)擴增牙髓干細胞
[0095]①米用美國BBA Fiberweb的Reemay公司(Old Hickory, TN, USA)生產(chǎn)的無紡布聚酯類纖維(Non Woven Polyester Fabric), N0.2214型,經(jīng)表面處理并切割成直徑為6mm的圓形小片體。
[0096]②細胞生物反應器選擇的是購買自美國NBS公司的5L生物反應器CelligenPlus,工作體積3.5L，采用固定床籃式攪拌系統(tǒng)。在生物反應器中加入上述處理切割好的直徑為6mm的圓形聚酯切片作為細胞載體，并加入磷酸緩沖液，121°C滅菌30min。滅菌后，排空磷酸緩沖液，加入含15%胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)液，并開始控制細胞生物反應器條件。
[0097]③挑選形態(tài)健康，生長良好的牙髓干細胞用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，作為細胞生物反應器的種子細胞，以3Χ IO5個細胞/mL的密度接種到生物反應器中的無紡布/聚酯纖維圓形小片載體上，用細胞 培養(yǎng)液進行擴增培養(yǎng)。其中聚酯纖維圓形小片載體的使用量為每升罐體積35g，所使用的細胞培養(yǎng)液為a-MEM培養(yǎng)基加15%胎牛血清。細胞生物反應器培養(yǎng)條件為酸堿度(pH)值7.2，溫度37°C，溶氧濃度(DO)為空氣飽和的50%，攪拌速度80rpmo
[0098]④每天通過生化分析儀檢測葡萄糖和乳酸含量等參數(shù)，接種后培養(yǎng)約8天，排空培養(yǎng)液，加入500mLPBS沖洗2_3次后，加入IOOmL胰酶/EDTA，消化20min，加入等體積培養(yǎng)液終止消化，收獲細胞，可得到3.8 X IO6個細胞/ml的細胞，細胞數(shù)量擴增12.6倍。
[0099]實施例6、WAVE生物反應器
[0100]①采用GE的WAVE Bioreactor系統(tǒng)，它由一個帶有一次性塑料細胞培養(yǎng)袋的搖動平臺組成，配備CO2氣體混合器(C02MIX20)或WAVEP0D?控制塔用于控制pH、溫度、氧氣和混合。牙髓干細胞在Cellbag-2L的生物反應器中培養(yǎng)。
[0101]②微載體預處理:在用不含Ca2+和Mg2+離子的PBS中洗滌3次后，微載體在121°C高壓滅菌15min，并在4°C下無菌保存。微載體先用培養(yǎng)基洗滌并在接種前24h轉移到Cellbag中進行平衡。所使用的Cytodex 3量為3g/l。
[0102]③挑選形態(tài)健康，生長良好的牙髓干細胞用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，作為細胞生物反應器的種子細胞，以2 X IO5個細胞/ml的密度接種到微載體上，用細胞培養(yǎng)液進行擴增培養(yǎng)。所使用的細胞培養(yǎng)液為a-MEM培養(yǎng)基加15%胎牛血清。細胞生物反應器培養(yǎng)條件為酸堿度(pH)值7.2，溫度37°C，溶氧濃度(DO)為空氣飽和的50%。
[0103]④每天通過生化分析儀檢測葡萄糖和乳酸含量等參數(shù)，接種后培養(yǎng)約7天，排空培養(yǎng)液，加入500mLPBS沖洗2_3次后，加入IOOmL胰酶/EDTA，消化20min，加入等體積培養(yǎng)液終止消化，收獲細胞?？傻?.2 X IO6個細胞/ml密度的細胞，細胞數(shù)量擴增11倍。
[0104]實施例7、牙髓干細·胞的冷凍保存
[0105]將平皿中長滿至80-90%的牙髓干細胞，去除舊的培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍，接著加Λ 0.25%含有EDTA的胰酶37°C消化3min，待細胞全部脫落后，加入等體積的牙髓干細胞培養(yǎng)液終止消化，1000rpm/min離心5min，去除上清，再用干細胞凍存液(含有DMS0、胎牛血清和a -MEM培養(yǎng)液，1:2:7)將細胞重懸，獲得的牙髓干細胞懸液加入到細胞凍存管中，置于含異丙醇的程序式降溫盒中-80°C過夜，第二天轉移到_196°C的液氮中長期保存。
【權利要求】
1.一種牙髓干細胞的規(guī)?；a(chǎn)工藝，包括如下步驟: (1)牙髓干細胞的分離提取:將牙髓組織用膠原酶消化后，在含胎牛血清細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)器皿中，于37°c、5% CO2條件下培養(yǎng)，3天換液； (2)牙髓干細胞的培養(yǎng)擴增:將步驟(1)培養(yǎng)所得的原代細胞以0.1 X IO5-L O X IO5個細胞/cm2的密度接種于二維培養(yǎng)器皿中，加入新鮮細胞培養(yǎng)液，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，3天換液； (3)牙髓干細胞的檢測:進行細胞活性檢測、無菌性檢測和流式細胞檢測； (4)牙髓干細胞的大規(guī)模培養(yǎng):采用轉瓶培養(yǎng)或生物反應器培養(yǎng)，將牙髓干細胞接種在轉瓶或生物反應器中后，調整溶解氧濃度、PH值、攪拌轉速和通氣量，根據(jù)取樣分析細胞計數(shù)、存活率、營養(yǎng)成分和代謝物的結果更換培養(yǎng)基，從而達到細胞的高密度大規(guī)模培養(yǎng)； (5)牙髓干細胞的冷凍保存:將檢測合格的細胞凍存于管內，細胞的詳細信息掃描入數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，自動化系統(tǒng)根據(jù)液氮情況自動尋找空缺位置，將細胞凍存于相應的空格中； (6)根據(jù)需要，進行牙髓干細胞的長期冷凍保存，保存期間定期從凍存環(huán)境中取出細胞進行檢測。
2.如權利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其中所述步驟(1)中，所述牙髓組織是在無菌條件下挑選的，用緩沖液沖洗后剪碎；所述膠原酶消化是用5~10倍體積的0.1%~0.6%膠原酶，于37°C培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)3(Tl80min，然后用含胎牛血清的細胞培養(yǎng)液終止消化，所述細胞培養(yǎng)液選自商品化的含10-20%胎牛血清的a -MEM、DMEM培養(yǎng)基及無血清培養(yǎng)基。
3.如權利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其中所述步驟(1)的培養(yǎng)步驟包括將經(jīng)消化的牙髓組織在80(Tl500r/min離心3~IOmin后棄上清、加5~10倍體積細胞培養(yǎng)液重懸細胞，轉入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)，所述細胞培養(yǎng)液選自商品化的含10-20%胎牛血清的a -MEM,DMEM培養(yǎng)基及無血清培養(yǎng)基。
4.如權利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其中所述步驟(2)中，所述原代細胞在長滿培養(yǎng)器皿底部80%-90%時用胰酶溶液消化并吹打細胞，使細胞完全脫離原代培養(yǎng)器皿后接種于二維培養(yǎng)器皿，所述二維培養(yǎng)器皿選自細胞培養(yǎng)孔板、培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)方瓶。
5.如權利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其中所述步驟(4)中，所述溶解氧濃度為40%-60%、pH值為7.0-7.2、攪拌轉速為50-100rpm。
6.如權利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其中所述步驟(4)中的所述轉瓶培養(yǎng)按以下過程進行:將微載體經(jīng)預處理、轉瓶硅化、121°C高溫滅菌后，接種細胞，微載體加入量為2-10g/L，大小范圍為60-300 μ m，接種密度為3 X 104-3 X IO5個細胞/ml，轉瓶的大小范圍為25ml-500ml，轉速范圍 50_75rpm。
7.如權利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其中所述步驟(4)中的所述生物反應器選自細胞培養(yǎng)生物反應器，包括攪拌式生物反應器、固定床生物反應器和WAVE生物反應器。
8.如權利要求7所述的生產(chǎn)工藝，其中所述攪拌式生物反應器、WAVE生物反應器按以下過程進行細胞培養(yǎng):將微載體用 PBS沖洗2次，第三次加入PBS放入4°C冰箱內平衡水化過夜，高壓蒸汽滅菌后，接種牙髓干細胞，微載體的加入量為3-10g/L，接種密度為IXlO5-1O6個細胞/mL，細胞擴增至密度為5X 105-2X IO7個細胞/mL ;其中所述固定床生物反應器按以下過程進行細胞培養(yǎng):在生物反應器中加入經(jīng)表面處理切割好的聚酯切片作為細胞載體，并加入磷酸緩沖液，高溫蒸汽滅菌后加入細胞培養(yǎng)液，接種牙髓干細胞，其中聚酯纖維片狀載體的使用量為每升罐體積25-45g，接種密度為I X IO5-1O6個細胞/mL，細胞擴增至密度為4X 106-2X IO7個細胞/mL。上述生物反應器培養(yǎng)條件所述溶解氧濃度為40%-60%、pH 值為 7.0-7.2、攪拌轉速為 50_100rpm。
9.如權利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其中所述步驟(5)中，所述細胞的詳細信息包括供者姓名、細胞代數(shù)、細胞培養(yǎng)液成分和濃度、細胞接種密度、凍存液成分和凍存日期；所述冷凍保存包括將所獲得的牙髓干細胞按I X IO6^l X IO7個/ml細胞密度在凍存液中重懸，分裝入凍存管，經(jīng)過程序降溫后，將凍存管轉移至_196°C液氮中冷凍保存。
10.如權利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其中所述牙髓干細胞的冷凍保存使用的凍存液包含體積比為1:2:7的DMSO、 胎牛血清和a -MEM培養(yǎng)液。
【文檔編號】C12N5/02GK103849595SQ201210514497
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月5日 優(yōu)先權日:2012年12月5日
【發(fā)明者】傅強, 陳彥田, 馮見, 齊瀚實 申請人:上海坤愛生物科技有限公司