本發(fā)明涉及體外受精-胚胎移植技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種提高哺乳動(dòng)物體外受精-胚胎移植著床成功率的方法。

背景技術(shù)：

體外受精-胚胎移植技術(shù)(invitrofertilityandembryotransfer、ivf-et)是將男性精子和女性卵子取出后，在體外促使精卵結(jié)合，使卵子受精，再將受精卵在體外培育成胚胎，最終將胚胎移移植進(jìn)女性子宮，促使其植入女性子宮，達(dá)到使女性受孕的目的。盡管隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，胚胎移植后的臨床妊娠率有了較大的提升，但總體成功率仍然較低，約為54％。如何有效改善胚胎的著床，提高臨床妊娠率是ivf-et技術(shù)的研究熱點(diǎn)。本發(fā)明基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出：使用雌激素短時(shí)處理移植前胚胎，可以顯著提高胚胎移植的植入成功率。

著床是胚胎與子宮內(nèi)膜相互作用，逐漸植入子宮內(nèi)膜的過程。雖然不同動(dòng)物的著床過程存在差異，但都有賴于卵巢分泌的雌、孕激素的作用。成功著床必須具備兩個(gè)要素，這就是在雌激素的作用下，子宮內(nèi)膜具備對(duì)胚胎的接受性，以及與子宮內(nèi)膜同步發(fā)育到囊胚期的胚胎的激活。

雌激素對(duì)靶細(xì)胞的作用除了傳統(tǒng)的基因組效應(yīng)外，近期，以膜受體介導(dǎo)的雌激素快速效應(yīng)成為雌激素作用的研究熱點(diǎn)，g蛋白偶聯(lián)受體30(gproteincoupledreceptor30、gpr30)又稱為g蛋白偶聯(lián)雌激素受體(gproteincoupledestrogenreceptor1、gper1)是最近發(fā)現(xiàn)的一種膜結(jié)合的雌激素受體，可以介導(dǎo)雌激素對(duì)靶細(xì)胞的效應(yīng)。我們的研究已證實(shí)gpr30在動(dòng)物早期胚胎中有表達(dá)，并可以介導(dǎo)雌激素對(duì)動(dòng)物胚胎的激活作用，同時(shí)小鼠胚胎移植前用雌激素處理后，可以提高小鼠胚胎的著床率?；谇笆鲅芯拷Y(jié)果我們提出，在開展人類輔助生殖技術(shù)運(yùn)用ivf-et治療不孕患者時(shí)，將移植前胚胎采用雌激素預(yù)處理，可以提高患者胚胎的植入率，提升患者接受人類輔助生殖技術(shù)的臨床妊娠率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種提高哺乳動(dòng)物體外受精-胚胎移植著床成功率的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種提高哺乳動(dòng)物體外受精-胚胎移植著床成功率的方法，包括以下步驟：

(1)制備培養(yǎng)基和洗滌液：

所述培養(yǎng)基的組成為：17β-estrodiol0.5-1.5μmol/l、nacl4-7g/l、kcl0.2-0.5g/l、cacl2·2h2o0.1-0.35g/l、kh2po40.05-0.2g/l、mgso4·7h2o0.2-0.3g/l、nahco30.2-0.45g/l、hepes3-7g/l、sodiumlactate2-3g/l、sodiumpyruvate0.02-0.06g/l、glucose0.5-1.5g/l、bovineserumalbumin(bsa)2-6g/l、penicilling(potassiumsalt)0.02-0.08g/l、streptomycinsulfate0.02-0.08g/l；上述濃度為溶解后終濃度，溶質(zhì)用雙蒸水溶解后，用0.1-0.3mol/lnaoh調(diào)節(jié)ph至7.2-7.4、滲透壓285-287mosmole，采用微孔濾過器濾過后置于無菌容器，4℃保存，保質(zhì)期2周；

所述洗滌液的組成為：nacl6-10g，kcl0.1-0.3g，kh2po40.1-0.35g和k2hpo41-3g，溶于800ml蒸餾水中，用hcl調(diào)節(jié)ph值至7.4，最后加蒸餾水定容至1l，4℃保存；

(2)獲得培養(yǎng)到囊胚階段的胚胎：獲取雌性卵細(xì)胞，在體外正常受精，選取發(fā)育速度正常的胚胎，用上述培養(yǎng)基在體外培養(yǎng)至囊胚階段；

(3)將步驟(2)中所得囊胚階段的胚胎放置在co2培養(yǎng)箱內(nèi)的步驟(1)制備的培養(yǎng)基中孵育30分鐘，co2培養(yǎng)箱內(nèi)的co2氣體濃度為5％，co2培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度37℃；

(4)30分鐘后取出囊胚，用所述洗滌液洗滌囊胚3次，15秒/次；

(5)將洗滌后的囊胚放入移植液中，進(jìn)行宮腔內(nèi)移植。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟(2)中所述胚胎為哺乳動(dòng)物的胚胎。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述哺乳動(dòng)物包括人。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：步驟(1)中所述的培養(yǎng)基的組成為：17β-estrodiol1μmol/l、nacl5.53g/l、kcl0.36g/l、cacl2·2h2o0.25g/l、kh2po40.16g/l、mgso4·7h2o0.29g/l、nahco30.35g/l、hepes4.97g/l、sodiumlactate2.6g/l、sodiumpyruvate0.04g/l、glucose1g/l、bovineserumalbumin(bsa)4g/l、penicilling(potassiumsalt)0.06g/l、streptomycinsulfate0.05g/l。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：步驟(1)中所述洗滌液的組成為：nacl7.9g、kcl0.2g、kh2po40.24g和k2hpo41.8g。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：步驟(1)中所述洗滌液的組成為：nacl6-10g，kcl0.1-0.3g，na2hpo41-3g和k2hpo41-3g。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：步驟(1)中所述洗滌液的組成為：nacl7.9g、kcl0.2g、na2hpo41.44g和k2hpo41.8g。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以提高ivf-et動(dòng)物胚胎移植的植入率，為ivf-et的畜牧繁育及臨床運(yùn)用具有廣泛運(yùn)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

本發(fā)明實(shí)施例中，一種提高哺乳動(dòng)物體外受精-胚胎移植著床成功率的方法，包括以下步驟：

(1)制備培養(yǎng)基和洗滌液：

所述培養(yǎng)基的組成為：17β-estrodiol0.5μmol/l、nacl4g/l、kcl0.2g/l、cacl2·2h2o0.1g/l、kh2po40.05g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、nahco30.2g/l、hepes3g/l、sodiumlactate2g/l、sodiumpyruvate0.02g/l、glucose0.5g/l、bovineserumalbumin(bsa)2g/l、penicilling(potassiumsalt)0.02g/l、streptomycinsulfate0.02g/l；上述濃度為溶解后終濃度，溶質(zhì)用雙蒸水溶解后，用0.1mol/lnaoh調(diào)節(jié)ph至7.2、滲透壓285mosmole，采用微孔濾過器濾過后置于無菌容器，4℃保存，保質(zhì)期2周；

所述洗滌液的組成為：nacl6g，kcl0.1g，kh2po40.1g(或na2hpo41g)和k2hpo41g，溶于800ml蒸餾水中，用hcl調(diào)節(jié)ph值至7.4，最后加蒸餾水定容至1l，4℃保存；

(2)獲得培養(yǎng)到囊胚階段的胚胎：獲取雌性卵細(xì)胞，在體外正常受精，選取發(fā)育速度正常的胚胎，用上述培養(yǎng)基在體外培養(yǎng)至囊胚階段：所述胚胎為哺乳動(dòng)物的胚胎，包括人；

(3)將步驟(2)中所得囊胚階段的胚胎放置在co2培養(yǎng)箱內(nèi)的步驟(1)制備的培養(yǎng)

基中孵育30分鐘，co2培養(yǎng)箱內(nèi)的co2氣體濃度為5％，co2培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度37℃；

(4)30分鐘后取出囊胚，用所述洗滌液洗滌囊胚3次，15秒/次；

(5)將洗滌后的囊胚放入移植液中，進(jìn)行宮腔內(nèi)移植。

實(shí)施例2

本發(fā)明實(shí)施例中，一種提高哺乳動(dòng)物體外受精-胚胎移植著床成功率的方法，包括以下步驟：

(1)制備培養(yǎng)基和洗滌液：

所述的培養(yǎng)基的組成為：17β-estrodiol1μmol/l、nacl5.53g/l、kcl0.36g/l、cacl2·2h2o0.25g/l、kh2po40.16g/l、mgso4·7h2o0.29g/l、nahco30.35g/l、hepes4.97g/l、sodiumlactate2.6g/l、sodiumpyruvate0.04g/l、glucose1g/l、bovineserumalbumin(bsa)4g/l、penicilling(potassiumsalt)0.06g/l、streptomycinsulfate0.05g/l；上述濃度為溶解后終濃度，溶質(zhì)用雙蒸水溶解后，用0.2mol/lnaoh調(diào)節(jié)ph至7.3、滲透壓286mosmole，采用微孔濾過器濾過后置于無菌容器，4℃保存，保質(zhì)期2周；

所述洗滌液的組成為：nacl7.9g、kcl0.2g、kh2po40.24g(或na2hpo41.44g)和k2hpo41.8g，溶于800ml蒸餾水中，用hcl調(diào)節(jié)ph值至7.4，最后加蒸餾水定容至1l，4℃保存；

(2)獲得培養(yǎng)到囊胚階段的胚胎：獲取雌性卵細(xì)胞，在體外正常受精，選取發(fā)育速度正常的胚胎，用上述培養(yǎng)基在體外培養(yǎng)至囊胚階段：所述胚胎為哺乳動(dòng)物的胚胎，包括人；

(3)將步驟(2)中所得囊胚階段的胚胎放置在co2培養(yǎng)箱內(nèi)的步驟(1)制備的培養(yǎng)基中孵育30分鐘，co2培養(yǎng)箱內(nèi)的co2氣體濃度為5％，co2培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度37℃；

(4)30分鐘后取出囊胚，用所述洗滌液洗滌囊胚3次，15秒/次；

(5)將洗滌后的囊胚放入移植液中，進(jìn)行宮腔內(nèi)移植。

實(shí)施例3

本發(fā)明實(shí)施例中，一種提高哺乳動(dòng)物體外受精-胚胎移植著床成功率的方法，包括以下步驟：

(1)制備培養(yǎng)基和洗滌液：

所述培養(yǎng)基的組成為：17β-estrodiol1.5μmol/l、nacl7g/l、kcl0.5g/l、cacl2·2h2o0.35g/l、kh2po40.2g/l、mgso4·7h2o0.3g/l、nahco30.45g/l、hepes7g/l、sodiumlactate3g/l、sodiumpyruvate0.06g/l、glucose1.5g/l、bovineserumalbumin(bsa)6g/l、penicilling(potassiumsalt)0.08g/l、streptomycinsulfate0.08g/l；上述濃度為溶解后終濃度，溶質(zhì)用雙蒸水溶解后，用0.3mol/lnaoh調(diào)節(jié)ph至7.4、滲透壓287mosmole，采用微孔濾過器濾過后置于無菌容器，4℃保存，保質(zhì)期2周；

所述洗滌液的組成為：nacl10g，kcl0.3g，kh2po40.35g(或na2hpo43g)和k2hpo43g，溶于800ml蒸餾水中，用hcl調(diào)節(jié)ph值至7.4，最后加蒸餾水定容至1l，4℃保存；

(2)獲得培養(yǎng)到囊胚階段的胚胎：獲取雌性卵細(xì)胞，在體外正常受精，選取發(fā)育速度正常的胚胎，用上述培養(yǎng)基在體外培養(yǎng)至囊胚階段：所述胚胎為哺乳動(dòng)物的胚胎，包括人；

(3)將步驟(2)中所得囊胚階段的胚胎放置在co2培養(yǎng)箱內(nèi)的步驟(1)制備的培養(yǎng)基中孵育30分鐘，co2培養(yǎng)箱內(nèi)的co2氣體濃度為5％，co2培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度37℃；

(4)30分鐘后取出囊胚，用所述洗滌液洗滌囊胚3次，15秒/次；

(5)將洗滌后的囊胚放入移植液中，進(jìn)行宮腔內(nèi)移植。

體外受精-胚胎移植技術(shù)(invitrofertilityandembryotransfer、ivf-et)的妊娠率仍較低，本發(fā)明用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以提高ivf-et動(dòng)物胚胎移植的植入率，為ivf-et的畜牧繁育及臨床運(yùn)用具有廣泛運(yùn)用價(jià)值。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。