本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種從人臍帶血中分離純化間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，應(yīng)用梯度離心原理快速分離大容量的臍帶血以制備單核細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上利用細(xì)胞培養(yǎng)分選技術(shù)制備臨床以及實(shí)驗(yàn)室所需的干細(xì)胞。

背景技術(shù)：

隨著單核細(xì)胞研究以及單核細(xì)胞臨床應(yīng)用的不斷深入，造血干細(xì)胞移植已成為根治惡性血液病(白血病、惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤)、再生障礙性貧血、以及某些遺傳性疾病的有效手段。近年來干細(xì)胞移植已逐步應(yīng)用于心臟病、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、組織器官修復(fù)、糖尿病、血管疾病等臨床治療。此外單核細(xì)胞還有增強(qiáng)人體免疫力、修復(fù)病變或衰老的組織、延長(zhǎng)人的壽命、改變?nèi)祟惿鏍顟B(tài)等潛能，具有不可估量的醫(yī)學(xué)價(jià)值。

然而，單核細(xì)胞的廣泛臨床應(yīng)用須有充足的健康單核細(xì)胞來源。因此，有效的、高純度的臍帶血單核細(xì)胞提取試劑盒已成為滿足患者需要、及時(shí)向患者提供健康單核細(xì)胞供臨床使用的基本保障。

健康干細(xì)胞的臨床運(yùn)用的第一步即是臍帶血、骨髓血、外周血的采集以及單核細(xì)胞的分離。能否將干細(xì)胞充分分離、提取、擴(kuò)增并純化，關(guān)系著干細(xì)胞數(shù)量的多少及純化率，這些又是移植成功與否的關(guān)鍵因素。

目前分離提取臍帶血造血干細(xì)胞的方法主要有流式細(xì)胞儀法，該方法的設(shè)備價(jià)格昂貴，臨床應(yīng)用成本高，不便推廣；培養(yǎng)擴(kuò)增法，該方法污染率高，時(shí)間長(zhǎng)，不適合臨床使用；免疫磁珠法，該方法細(xì)胞被標(biāo)記，篩選范圍小，活性低，標(biāo)記物對(duì)人體的影響與否還未知。目前主流的分離方法由于存在代價(jià)昂貴、活性低、污染率高、有標(biāo)記物等各種問題而不適用于醫(yī)學(xué)臨床使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種從人臍帶血細(xì)胞中分離純化干細(xì)胞的方法。用本發(fā)明的方法配合本發(fā)明的試劑盒以及新型細(xì)胞培養(yǎng)基，對(duì)人臍帶血細(xì)胞進(jìn)行分離提純制備干細(xì)胞，單核細(xì)胞回收率≥95％；間充質(zhì)干細(xì)胞存活率≥98％，間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)數(shù)量≥5×10⁷，達(dá)到了臨床治療的質(zhì)量要求。本發(fā)明的試劑盒各成分配制簡(jiǎn)便，純化操作針對(duì)性強(qiáng)，尤其是通過對(duì)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)的增殖培養(yǎng)，不僅去除了臍帶血中的紅細(xì)胞、死細(xì)胞等雜質(zhì)，還可大量擴(kuò)增mscs細(xì)胞使之成為理想種子來源。

本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提出的一種從人臍帶血中分離純化干細(xì)胞的方法，包括：將人臍帶血分離純化得到單核細(xì)胞樣本；將單核細(xì)胞樣本進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增得到所需數(shù)量的干細(xì)胞；其特征在于具體包括以下步驟：

(1)將存放在含有肝素或枸櫞酸鈉抗凝劑采血袋中的臍帶血倒入500毫升無菌試劑瓶中，按體積比為1:1比例加入注射用生理鹽水，蓋上瓶蓋，上下輕輕顛倒混勻，得到稀釋的細(xì)胞液，待混合均勻后按照試劑a與稀釋的細(xì)胞液之比為1:0.8的比例加入試劑a，混合均勻后，于37℃下靜置20～30分鐘；

(2)待觀察到有明顯的紅細(xì)胞沉淀至最下層時(shí)，用移液管收集上層血清至第一支50毫升無菌離心管中，設(shè)置離心條件為：1100g×5min；離心分離后棄去上清液，用含有質(zhì)量濃度為2％人血白蛋白的注射用生理鹽水洗滌沉淀并將洗滌后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至第二支50毫升無菌離心管中，得到懸浮細(xì)胞液，該懸浮細(xì)胞液含有單核細(xì)胞；

(3)將試劑b加入第三支50毫升無菌離心管中，然后將第二支離心管中的懸浮細(xì)胞液緩緩注入盛有試劑b的第三支50毫升無菌離心管中，使懸浮細(xì)胞液鋪在試劑b的液面上，其中，懸浮細(xì)胞液與試劑b的體積比為0.8:1；

(4)設(shè)置離心條件為700g×30min進(jìn)行離心分離，離心后分為4層，從上到下依次是：稀釋的血漿、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞；其中單核細(xì)胞層為云霧狀薄細(xì)胞層，將該單核細(xì)胞層吸取出來放入第四支50毫升無菌離心管中，用移液器加入注射用生理鹽水進(jìn)行稀釋，輕輕混勻后進(jìn)行離心分離，離心條件設(shè)置為700g×5min；離心后再用注射用生理鹽水洗滌下層沉淀兩次，每次洗滌后離心分離，洗滌用的生理鹽水中含有質(zhì)量濃度為2％的人血白蛋白，前后兩次離心分離的條件分別為570g×5min和450g×5min，最后收集離心管底部的單核細(xì)胞樣本以備用；

(5)將步驟(4)得到的細(xì)胞樣本用1ml～2ml干細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮后接種于裝有10毫升干細(xì)胞培養(yǎng)基的t25cm²的培養(yǎng)瓶中，置于溫度為37℃、二氧化碳體積濃度為5％、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3天后換新的干細(xì)胞培養(yǎng)基，去除未貼壁的細(xì)胞；之后每?jī)商鞊Q一次新的干細(xì)胞培養(yǎng)基，并每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，記錄其形態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80％～90％匯合度時(shí)，于37℃用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25％的胰酶消化貼壁細(xì)胞3～5分鐘后進(jìn)行傳代培養(yǎng)或凍存，凍存條件為：-196℃液氮凍存。

本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還可采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。

前述的分離純化單核細(xì)胞的方法，其中，所述試劑a為紅細(xì)胞沉淀劑，由重量分?jǐn)?shù)為6％的羥乙基淀粉溶液組成，該溶液以9％的生理鹽水為溶劑，以羥乙基淀粉為溶質(zhì)，該試劑a為醫(yī)用制劑，在潔凈條件下使用醫(yī)用無菌包裝試劑瓶分裝。

前述的分離純化單核細(xì)胞的方法，其中，所述試劑b為細(xì)胞分離液，由聚蔗糖400和泛影酸葡甲胺配制而成，是一種無菌水溶液。

前述的分離純化單核細(xì)胞的方法，其中，所述試劑b由聚蔗糖400和泛影酸葡甲胺配制而成，通過以下方法制備：

在室溫18～25℃，將密度為340g/ml的泛影酸葡甲胺溶液與重量分?jǐn)?shù)為9％的聚蔗糖溶液充分混合均勻，最終所得混合液的密度為1.075g/ml，然后過濾除菌，經(jīng)檢測(cè)，其毒素含量≤0.5eu/ml,ph為7～7.8，裝瓶于4℃避光保存。

前述的分離純化單核細(xì)胞的方法，其中，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基由dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑組成；所述添加劑的成分包括成分a和成分b，其中，成分a包括：超氧化物歧化酶、地塞米松和植物血凝素；成分b為自體富血小板血漿；

先將dmem培養(yǎng)基加入添加劑的成分a，混合均勻后，與f12培養(yǎng)基按照體積比為1:1的比例混合，得到dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在使用干細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)再臨時(shí)加入添加劑的成分b，最終得到所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基；

添加的成分b的體積占dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基體積的5％～10％；

最終所得干細(xì)胞培養(yǎng)基中超氧化物歧化酶、地塞米松和植物血凝素的濃度分別為：30μmol/l、0.1μmol/l、2μg/ml。

借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于：

由于臍帶血中單核細(xì)胞所含的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量最多，本發(fā)明所提供的工藝路徑及其所用的技術(shù)參數(shù)又經(jīng)過優(yōu)化處理，所以成效顯著。雖然市面上同類試劑盒利用ficoll分離方法制備的臍帶血單核細(xì)胞通過檢測(cè)cd34判斷其回收率達(dá)到85％以上，但在所分離的單核細(xì)胞中，間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)的數(shù)量極少，不到細(xì)胞總數(shù)的0.01‰～0.1‰，而且在制備的單核細(xì)胞懸液中存在少量的細(xì)胞血漿、血小板、粒細(xì)胞以及死細(xì)胞組分，分離的細(xì)胞種類以淋巴細(xì)胞居多。由于干細(xì)胞數(shù)量少，其所具備的自我更新和分化的潛能能力較弱起不到臨床治療作用。人體細(xì)胞治療所需細(xì)胞數(shù)量為10⁶/kg，所以mscs運(yùn)用于臨床之前需要在體外進(jìn)行擴(kuò)增。

本發(fā)明的方法將分離提純后的單核細(xì)胞經(jīng)過本公司發(fā)明的新型干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行選育培養(yǎng)后，單核細(xì)胞回收率≥95％；干細(xì)胞存活率≥98％，間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)數(shù)量≥5×10⁷，達(dá)到了臨床治療的質(zhì)量要求。

本發(fā)明技術(shù)方案中所使用的新型干細(xì)胞培養(yǎng)基是以dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑構(gòu)成，是以dmem培養(yǎng)基加入添加劑后無菌過濾和f12培養(yǎng)基以體積比為1:1比例混合，添加劑包含成分a和成分b，成分a包括30μmol/l超氧化物歧化酶(sod)、0.1μmol/l地塞米松、2μg/ml植物血凝素(pha)，先將成分a與基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合均勻；在使用時(shí)再添加成分b，成分b為自體富血小板血漿(platelet-richplasma,prp)，成分b添加體積占基礎(chǔ)培養(yǎng)基體積的為5％～10％。

在實(shí)際使用過程中該新型培養(yǎng)基在體外培養(yǎng)干細(xì)胞過程中較常規(guī)培養(yǎng)基擴(kuò)增速度提高2倍以上。prp來源于人類，輸注人體不會(huì)引起異種蛋白免疫反應(yīng)，尤其是prp含有的血小板源性生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、β、胰島素樣生長(zhǎng)因子ⅰ、胰島素樣生長(zhǎng)因子ⅱ、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等多種因子，可以迅速刺激間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞在其組織修復(fù)、成骨分化等方面能力更強(qiáng)。是在臨床大規(guī)模培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞所使用的培養(yǎng)基替代胎牛血清最適宜的人源化替代品。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，而可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，并且為了讓本發(fā)明的上述優(yōu)勢(shì)和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更明顯易懂，以下特舉較佳實(shí)施例，詳細(xì)說明如下。

附圖說明

圖1是試劑a沉淀全血中的紅細(xì)胞分層后的示意圖；

圖2是試劑b與懸浮細(xì)胞液離心后的分層示意圖；

圖3是為單核細(xì)胞用注射用生理鹽水洗滌離心后單核細(xì)胞分布圖；

圖4是單核細(xì)胞培養(yǎng)初期的照片；

圖5是間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)5d的照片；

圖6是間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)10d的照片；

圖7是間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)20d的照片；

圖8是臍血間充質(zhì)干細(xì)胞cd90陽性表達(dá)，cd34、cd11b、cd19、cd45、hla-dr陰性表達(dá)；

圖9是臍血間充質(zhì)干細(xì)胞cd105陽性表達(dá)，cd34、cd11b、cd19、cd45、hla-dr陰性表達(dá)；

圖10是臍血間充質(zhì)干細(xì)胞cd73陽性表達(dá)，cd34、cd11b、cd19、cd45、hla-dr陰性表達(dá)。

【元件及符號(hào)說明】

圖1：a：血清b：紅細(xì)胞

圖2：c：稀釋的血漿d：?jiǎn)魏思?xì)胞層e:粒細(xì)胞f：紅細(xì)胞

圖3：g：上清液h:單核細(xì)胞樣本

具體實(shí)施方式

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效，以下結(jié)合附圖及較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提出的一種從人臍帶血或胎盤組織細(xì)胞中分離純化干細(xì)胞的方法，其具體實(shí)施方式、結(jié)構(gòu)、特征及其功效，詳細(xì)說明如后。

實(shí)施例：

將存放在含有肝素或枸櫞酸鈉抗凝劑采血袋中的臍帶血倒入500毫升無菌試劑瓶中，按體積比為1:1比例加入注射用生理鹽水，蓋上瓶蓋，上下輕輕顛倒混勻，得到稀釋的細(xì)胞液，待混合均勻后按照試劑a與稀釋的細(xì)胞液之比為1:0.8的比例加入試劑a，混合均勻后，于37℃下靜置20～30分鐘；待觀察到有明顯的紅細(xì)胞沉淀至最下層時(shí)(如圖1)，用移液管收集上層血清至第一支50毫升無菌離心管中，離心條件設(shè)置為：1100g×5min；離心后棄去上清液，用含有質(zhì)量濃度為2％人血白蛋白的注射用生理鹽水洗滌沉淀并將洗滌后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至第二支50毫升無菌離心管中，得到懸浮細(xì)胞液，該懸浮細(xì)胞液含有單核細(xì)胞。

將試劑b加入第三支50毫升無菌離心管中，然后將第二支離心管中的懸浮細(xì)胞液緩緩注入盛有試劑b的第三支50毫升無菌離心管中，使懸浮細(xì)胞液鋪在試劑b的液面上，其中，懸浮細(xì)胞液與試劑b的體積比為0.8:1；離心條件設(shè)置為700g×30min；離心后分為4層，從上到下依次是：稀釋的血漿、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞(如圖2)；其中單核細(xì)胞層呈云霧狀薄細(xì)胞層，將該單核細(xì)胞層吸取出來放入第四支50毫升無菌離心管中，用移液器加入注射用生理鹽水進(jìn)行稀釋，輕輕混勻后進(jìn)行離心分離，離心條件設(shè)置為700g×5min；離心后再用注射用生理鹽水洗滌下層沉淀兩次，洗滌用的生理鹽水中含有質(zhì)量濃度為2％的人血白蛋白。每次洗滌后離心分離，前后兩次離心分離的條件分別為570g×5min和450g×5min，最后收集離心管底部的單核細(xì)胞樣本以備用(如圖3)；

將得到的單核細(xì)胞樣本用少量(1～2ml)新型干細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮后接種于裝有10毫升干細(xì)胞培養(yǎng)基的t25cm²的培養(yǎng)瓶中，置于溫度為37℃、二氧化碳體積濃度為5％、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3天后換液(換新的干細(xì)胞培養(yǎng)基)，去除未貼壁的細(xì)胞；之后每?jī)扇鞊Q液一次，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，記錄其形態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80％～90％匯合度時(shí)，于37℃用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25％的胰酶消化貼壁細(xì)胞3～5分鐘后進(jìn)行傳代培養(yǎng)或凍存，凍存條件為：-196℃液氮凍存。

具體的，試劑a由重量分?jǐn)?shù)為6％的羥乙基淀粉溶液組成，該溶液以9％的生理鹽水為溶劑，以羥乙基淀粉為溶質(zhì)，在潔凈條件下使用醫(yī)用無菌包裝試劑瓶分裝。

試劑b為細(xì)胞分離液，由聚蔗糖400和泛影酸葡甲胺配制而成：在室溫18～25℃，將密度為340g/ml的泛影酸葡甲胺溶液與重量分?jǐn)?shù)為9％的聚蔗糖溶液充分混合均勻，最終所得混合液的密度為1.075g/ml，然后過濾除菌，經(jīng)檢測(cè)，其毒素含量≤0.5eu/ml,ph為7～7.8，裝瓶于4℃避光保存。

新型干細(xì)胞培養(yǎng)基由dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑混合而成；所述添加劑的成分包括成分a和成分b，其中，成分a包超氧化物歧化酶(sod)、地塞米松和植物血凝素(pha)；成分b為自體富血小板血漿；

先將dmem培養(yǎng)基加入添加劑的成分a，混合均勻后，與f12培養(yǎng)基按照體積比為1:1的比例混合，得到dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基；在使用干細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)再臨時(shí)加入添加劑的成分b，添加的成分b的體積占dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基體積的5％～10％；最終所得干細(xì)胞培養(yǎng)基中超氧化物歧化酶(sod)、地塞米松和植物血凝素的濃度分別為30μmol/l、0.1μmol/l、2μg/ml；

培養(yǎng)過程中細(xì)胞分化增值結(jié)果如圖4～圖7所示，在實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞不斷增殖，mscs細(xì)胞活性及細(xì)胞性狀經(jīng)倒置顯微鏡下觀察無明顯差異。mscs細(xì)胞一般傳至3代時(shí)可獲得純度高且形態(tài)均一的長(zhǎng)梭形間充質(zhì)干細(xì)胞(如圖7所示)，其生物學(xué)特性通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果確認(rèn)(如圖8～圖10所示)。臍血mscs穩(wěn)定地表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)抗原的標(biāo)記：cd90、cd105、cd73，同時(shí)不表達(dá)與造血有關(guān)的表面抗原cd34、cd45、hla-dr。

圖4～圖7是實(shí)施例用干細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的周期照片。可以看出，在培養(yǎng)初期干細(xì)胞數(shù)量非常少，隨著培養(yǎng)周期的延長(zhǎng)，干細(xì)胞數(shù)量不斷增殖、純化，干細(xì)胞活性及細(xì)胞性狀經(jīng)倒置顯微鏡下觀察無明顯差異。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明做任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容做出些許更動(dòng)或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。