本發(fā)明涉及細胞領域，特別涉及一種培養(yǎng)基及細胞培養(yǎng)方法。

背景技術：

間充質(zhì)干細胞是一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的干細胞，在1966年首先由Friedenstein等從骨髓中發(fā)現(xiàn)的。大量研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞不僅可以分化為多種間質(zhì)組織的細胞，如骨、脂肪、軟骨、肌肉、肌腱和韌帶等。同時在一定的誘導條件下還可以橫向分化為外胚層和內(nèi)胚層細胞。如上皮細胞、神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞、表皮干細胞等。目前研究表明，間充質(zhì)干細胞來源十分廣泛，除骨髓外，脂肪、臍帶華通膠、胎盤、羊膜、肌肉、韌帶等均已分離培養(yǎng)出。近年來大量研究證明人體和動物的顱頜面部，特別是牙源性組織中存在具有特殊分化和再生功能的間充質(zhì)干細胞。近年來因其在組織工程和細胞替代治療的臨床前研究而備受關注。

人牙齦間充質(zhì)干細胞(gingiva－derived mesenchymal stem cells，GMSCs)是組成牙齦結(jié)締組織的主要間充質(zhì)細胞。它是來源于中胚層的纖維母細胞，不僅具有活躍的自我更新的能力，并且還具有合成和降解膠原等細胞外基質(zhì)的功能：I型和Ⅲ型膠原、纖維粘連蛋白等。因此GF在許多生理和病理過程中都起著十分重要的作用，可以維持膠原動態(tài)平衡，調(diào)節(jié)細胞相互作用，保護和修復牙齦組織，維持牙齦組織自身穩(wěn)定性。

牙周病造成了牙齒周圍支持組織的不可逆性損壞，而目前廣泛用于牙周再生的治療方法都沒能完全實現(xiàn)牙周組織的生理性和功能性再生。牙周組織工程技術的發(fā)展為牙周缺損組織的修復和再生提供了新的思路和空間。牙周膜干細胞自被發(fā)現(xiàn)以來，其良好的干細胞性就已經(jīng)得到了廣泛認可，但其來源有限，需拔牙才能獲取牙周膜組織，使其臨床應用的潛能受到限制。而在組織工程學研究中，尋求來源廣泛、取材方便的種子細胞一直是研究的重點和核心。同是牙周組織來源的牙齦組織，則具有取材方便、組織愈合能力強并且能夠無疤愈合的特點。因此，來源于牙齦組織的牙齦間充質(zhì)干細胞近幾年受到了高度關注。

GMSCs目前體外擴增采用的培養(yǎng)方法大多為體積分數(shù)為10％胎牛血清+DMEM/F12或體積分數(shù)為10％胎牛血清+低糖DMEM培養(yǎng)基，但由于胎牛血清增加了病毒感染及異種蛋白所導致異基因免疫應答的可能，從而在臨床應用時存在潛在的風險。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)基及細胞培養(yǎng)方法。本發(fā)明公開一種更為有效的GMSCs體外擴增方法，在采用間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基的基礎上，添加適當比例的bFGF和EGF兩種生長因子，既避免了動物源血清所帶來的風險，且更有效的提高GMSCs體外擴增能力。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：

本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基，包括無血清培養(yǎng)基、bFGF和EGF。

堿性成纖維細胞生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)是含155個氨基酸的促有絲分裂的陽離子多肽，分子量為16～18.5KD。bFGF具有廣泛的生物學作用，對多種細胞的生長、分化及功能有影響，在正常生理和病理過程中發(fā)揮作用，其主要生物學作用有：(1)作為血管生長因子；(2)促進創(chuàng)傷愈合與組織修復；(3)促進組織再生；(4)參與神經(jīng)再生等。表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)是一種小肽，由53個氨基酸殘基組成，EGF是一種多功能的生長因子，在體內(nèi)體外都對多種組織細胞有強烈的促分裂作用。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)基中所述bFGF的濃度為5～25ng/ml。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)基中所述培養(yǎng)基中所述bFGF的濃度為10ng/ml。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)基中所述EGF的濃度為5～25ng/ml。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)基中所述EGF的濃度為10ng/ml。

本發(fā)明還提供了所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)細胞中的應用。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述應用中所述細胞為間充質(zhì)干細胞。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述應用中所述細胞為牙齦間充質(zhì)干細胞。

此外，本發(fā)明還提供了一種細胞培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

步驟1：獲得凍存的細胞；

步驟2：取步驟1獲得的細胞與無血清培養(yǎng)基混合后洗滌，棄上清，再與本發(fā)明提供的培養(yǎng)基混合復蘇，繼續(xù)培養(yǎng)。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述細胞培養(yǎng)方法中本發(fā)明提供的培養(yǎng)基的加入量為每5×10⁴個細胞加入1mL所述培養(yǎng)基。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述細胞培養(yǎng)方法中所述復蘇為取所述凍存的細胞于37℃水浴中溶解，1～2min液體融化后，用10mL無血清培養(yǎng)基稀釋細胞懸液，1000r/min離心5min，棄上清；10mL本發(fā)明提供的培養(yǎng)基重懸細胞，按5×10⁴個/mL密度細胞接種，在5％CO₂的條件下37℃培養(yǎng)。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述細胞培養(yǎng)方法中所述繼續(xù)培養(yǎng)為待細胞長滿80～90％，棄去培養(yǎng)液，加入0.25％胰蛋白酶，消化1～3min，鏡下觀察細胞收縮變圓時，加入本發(fā)明提供的培養(yǎng)基終止消化，收集細胞。

本發(fā)明公開一種更為有效的GMSCs體外擴增培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，在采用間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基的基礎上，添加bFGF和EGF兩種生長因子，尤其是10ng/mLbFGF和10ng/mL EGF兩種生長因子，既避免了動物源血清所帶來的風險，且更有效的提高GMSCs體外擴增能力。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示對比例與實施例3GMSCs形態(tài)圖；

圖2示各組活細胞總數(shù)均值比較；

圖3示各組細胞活率均值比較；

圖4示對比例GMSCs生長曲線圖；

圖5示實施例3GMSCs生長曲線圖。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)基及細胞培養(yǎng)方法，本領域技術人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。

本發(fā)明的GMSCs體外有效擴增方法所使用的培養(yǎng)基不含有動物源血清，避免了引入污染和過敏原的風險，與常規(guī)細胞培養(yǎng)方法相比具有更高的臨床安全性。

本發(fā)明的GMSCs有效擴增方法更有效的提高GMSCs體外擴增能力。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)基及細胞培養(yǎng)方法中所用原料及試劑均可由市場購得。

下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：

實施例1

取第3代凍存的GMSCs，凍存管取出立即放入37℃水浴鍋中溶解，溶解過程中需不斷搖晃凍存管。1-2min液體融化后，用10mL間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基稀釋細胞懸液(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍)，1000r/min離心5min，棄上清。10mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，按5×10⁴個/mL密度細胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，放入5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。待細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入2～3mL 0.25％胰蛋白酶，消化1～3分鐘，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入5mL完全培養(yǎng)基終止消化，收集細胞，進行細胞計數(shù)。

完全培養(yǎng)基配方為：5ng/mLbFGF+5ng/mL EGF+間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基。(其中，5n g/mL的意思為：每毫升間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基中含有5ng生長因子，下同。)

實施例2

取第3代凍存的GMSCs，凍存管取出立即放入37℃水浴鍋中溶解，溶解過程中需不斷搖晃凍存管。1-2min液體融化后，用10mL間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基稀釋細胞懸液(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍)，1000r/min離心5min，棄上清。10mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，按5×10⁴個/mL密度細胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，放入5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。待細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入2～3mL 0.25％胰蛋白酶，消化1-3分鐘，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入5mL完全培養(yǎng)基終止消化，收集細胞，進行細胞計數(shù)。

完全培養(yǎng)基配方為：10ng/mLbFGF+5ng/mLEGF+間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基。

實施例3

取第3代凍存的GMSCs，凍存管取出立即放入37℃水浴鍋中溶解，溶解過程中需不斷搖晃凍存管。1-2min液體融化后，用10mL間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基稀釋細胞懸液(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍)，1000r/min離心5min，棄上清。10mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，按5×10⁴個/mL密度細胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，放入5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。待細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入2～3mL0.25％胰蛋白酶，消化1-3分鐘，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入5mL完全培養(yǎng)基終止消化，收集細胞，進行細胞計數(shù)。

完全培養(yǎng)基配方為：10ng/mLbFGF+10ng/mLEGF+間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基。

實施例4

取第3代凍存的GMSCs，凍存管取出立即放入37℃水浴鍋中溶解，溶解過程中需不斷搖晃凍存管。1-2min液體融化后，用10mL間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基稀釋細胞懸液(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍)，1000r/min離心5min，棄上清。10mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，按5×10⁴個/mL密度細胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，放入5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。待細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入2～3mL0.25％胰蛋白酶，消化1-3分鐘，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入5mL完全培養(yǎng)基終止消化，收集細胞，進行細胞計數(shù)。

完全培養(yǎng)基配方為：15ng/mLbFGF+10ng/mL EGF+間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基。

實施例5

取第3代凍存的GMSCs，凍存管取出立即放入37℃水浴鍋中溶解，溶解過程中需不斷搖晃凍存管。1-2min液體融化后，用10mL間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基稀釋細胞懸液(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍)，1000r/min離心5min，棄上清。10mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，按5×10⁴個/mL密度細胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，放入5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。待細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入2～3mL 0.25％胰蛋白酶，消化1-3分鐘，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入5mL完全培養(yǎng)基終止消化，收集細胞，進行細胞計數(shù)。

完全培養(yǎng)基配方為：10ng/mLbFGF+15ng/mL EGF+間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基。

實施例6

取第3代凍存的GMSCs，凍存管取出立即放入37℃水浴鍋中溶解，溶解過程中需不斷搖晃凍存管。1-2min液體融化后，用10mL間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基稀釋細胞懸液(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍)，1000r/min離心5min，棄上清。10mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，按5×10⁴個/mL密度細胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，放入5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。待細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入2～3mL 0.25％胰蛋白酶，消化1-3分鐘，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入5mL完全培養(yǎng)基終止消化，收集細胞，進行細胞計數(shù)。

完全培養(yǎng)基配方為：25ng/mLbFGF+25ng/mL EGF+間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基。

對比例

取第3代凍存的GMSCs，凍存管取出立即放入37℃水浴鍋中溶解，溶解過程中需不斷搖晃凍存管。1-2min液體融化后，用10mL DMEM/F12基礎培養(yǎng)基稀釋細胞懸液(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍)，1000r/min離心5min，棄上清。10mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，按5×10⁴個/ml密度細胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，放入5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。待細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入2～3mL0.25％胰蛋白酶，消化1-3分鐘，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入5mL完全培養(yǎng)基終止消化，收集細胞，進行細胞計數(shù)。

完全培養(yǎng)基配方為：10％胎牛血清+DMEM/F12基礎培養(yǎng)基。

實施例8

把對比例與各個實施例的統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行比較。結(jié)果表明，實施例1、實施例6與對比例有顯著性差異(*，p<0.05)；其余實施例與對比例有極顯著性差異(**，p<0.01)；實施例3與其他實施例有極顯著性差異(※，p<0.01)。

結(jié)果如表1和圖2所示：

表1各實驗組細胞計數(shù)結(jié)果

注：*表示p<0.05；**，※表示p<0.01。

表2各實驗組細胞活率平均值

注：*，※表示p<0.01。

表2和圖3結(jié)果表明，實施例1、實施例6細胞活率與對比例無顯著性差異；實施例2、4、5與對比例、實施例1、6有極顯著性差異(*，p<0.01)；實施例3與其余各組皆有極顯著性差異(※，p<0.01)。

實施例9

取P3代GMSCs，分別采用對比例和實施例3中的培養(yǎng)基配方，細胞按1×10⁴個/mL密度接種于24孔板中，第四天換液一次。每天收集細胞進行細胞計數(shù)，每次收集計算3孔，連續(xù)7天。繪制細胞生長曲線。

實驗結(jié)果如圖1～圖3、表3～表4所示。

表3對比例GMSCs每天計數(shù)結(jié)果

表4實施例3 GMSCs每天計數(shù)結(jié)果

注：*表示p<0.01。

將對比例與實施例3細胞計數(shù)得到的數(shù)據(jù)制作生長曲線，結(jié)果表明(表3、表4，圖4、圖5)，采用本發(fā)明的間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的GMSCs生長曲線符合間充質(zhì)干細胞“S”型的增殖規(guī)律；細胞培養(yǎng)第5、6、7天，實驗組3的GMSCs增殖活性(同樣的初始接種密度，培養(yǎng)到了5、6、7天，細胞計數(shù)比較可知。)比對比例的GMSCs顯著增強(*，p<0.01)，說明了本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基配方更適用于GMSCs常規(guī)培養(yǎng)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。