本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，提供了控制多能干細胞分化的方法。特別是，本發(fā)明提供了控制多能干細胞向內(nèi)胚層來源細胞分化的方法。

發(fā)明背景

干細胞具有分化為構(gòu)成有機體的多種不同類型細胞的能力，它能夠分化為三個胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)來源的細胞。

人們對干細胞定向分化產(chǎn)生了極大的興趣。分化的第一個中間階段是形成定形層類型的細胞。為了獲得純化的目標(biāo)細胞，抑制不需要細胞類型的分化是有利的。但是，僅有非常有限的研究結(jié)果顯示了抑制向特定類型細胞的分化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是基于激活素A激活的內(nèi)源性TGFβ能促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)并依賴SNAI1形成定形內(nèi)胚層(DE)這一發(fā)現(xiàn)。阻斷SNAI1或加入TGFβ抑制劑會抑制干細胞的EMT，從而抑制干細胞在分化過程中獲得內(nèi)胚層特性。因此，可以控制DE來源細胞的形成。由于DE類型的細胞是在分化初始階段被抑制，所以通過分化生成其他層類型的純化細胞的效率更高。

已有研究證明，間充質(zhì)細胞狀態(tài)(M)和上皮細胞狀態(tài)(E)之間的轉(zhuǎn)化參與體細胞重編程過程中的細胞命運決定。多能狀態(tài)向體細胞狀態(tài)分化的過程中是否也存在類似的決定尚不清楚。

作為本發(fā)明的一項基礎(chǔ)研究，我們利用集群RNA-seq法繪制了hESCs向肝細胞分化過程中的細胞命運轉(zhuǎn)換圖對此進行了檢驗，結(jié)果顯示hESCs在開始分化時伴隨有一個同步的EMT，在獲得肝臟特性之前存在一個不同步的MET。我們在單細胞分辨率下對這些變化進行了驗證，進一步證明了EMT是由內(nèi)源性TGFβ經(jīng)SNAI1啟動向肝細胞分化來介導(dǎo)的。我們的研究證實了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是hESCs向肝譜系細胞分化過程中-決定細胞命運轉(zhuǎn)換的一種機制，進一步表明分化和重編程具有相似的細胞命運決定。

利用限定因子將體細胞重編程為多能干細胞，不僅為再生醫(yī)學(xué)提供了一種獲得功能性細胞的新方法，還為細胞命運決定建立了一種新模式。對于后者而 言，處于終末分化狀態(tài)的細胞在確定條件下能夠恢復(fù)多能性，這通過分子和細胞工具完全可以觀察到。實際上，為了揭示細胞命運轉(zhuǎn)換的機制，研究人員已經(jīng)對重編程過程進行了詳細地分析^1-3。尤其令人感興趣的是，通常作為重編程啟動細胞的間充質(zhì)細胞樣小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)在完成重編程后獲得了上皮細胞特性⁴。我們和其他研究者均認(rèn)為MET是重編程四因子(POU5F1、SOX2、KLF4、MYC)同時導(dǎo)入MEFs后細胞變化的最早標(biāo)記^5，6。但是，當(dāng)按照OK+M+S順序?qū)霑r，它們啟動了一個比同步法更有效地促進重編程的有序EMT-MET過程⁷，表明間充質(zhì)細胞命運和上皮細胞命運的轉(zhuǎn)換是導(dǎo)致重編程過程發(fā)生，即細胞獲得多能性的原因。通常情況下，干細胞分化過程被視為重編程的逆過程，因此我們推測在干細胞分化過程中，這種有序的EMT-MET過程可能是推動細胞命運發(fā)生轉(zhuǎn)換的原因。在本發(fā)明中，我們報道了有序的EMT-MET還能夠促進hESCs向肝細胞樣細胞分化。

在本發(fā)明中，研究顯示人胚胎干細胞分化成肝細胞樣細胞過程中經(jīng)歷了一個有序的EMT-MET過程，特別地，在人胚胎干細胞分化成DE來源細胞(如肝細胞樣細胞)的過程中，存在一種依賴TGFβ的上皮-間充質(zhì)細胞命運轉(zhuǎn)換。

特此提供了一種控制干細胞分化的方法，該方法包括：

(a)將TGFβ抑制劑或SNAI1抑制劑導(dǎo)入所述干細胞中，從而抑制所述干細胞獲得內(nèi)胚層特性；或

(b)敲除所述干細胞的SNAI1基因，從而抑制所述干細胞獲得內(nèi)胚層特性。

在細胞分化過程中，所述方法可用于抑制所述干細胞形成內(nèi)胚層來源細胞，如肝細胞和膽管細胞、胰腺外分泌細胞、胰腺內(nèi)分泌細胞、肺細胞、甲狀腺細胞以及其他類型的胃腸道細胞。

所述干細胞是哺乳動物干細胞；優(yōu)選地，人胚胎干細胞或iPS細胞。

可選地，所述TGFβ抑制劑系由TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑、TGFβ表達抑制劑、TGFβ干擾劑和TGFβ封閉抗體組成的群組中選出的。例如，TGFβ抑制劑系由RepSox和SB525334組成的群組中選出的。

作為可選的實施方案，抑制劑的濃度大于等于1μM；優(yōu)選地，1～20μM；更優(yōu)選地，1～10μM。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，用量為終濃度2μM。

可選地，所述SNAI1抑制劑是SNAI1 siRNAs。

同時，還提供了一種抑制干細胞向內(nèi)胚層來源細胞分化的方法，該方法包括在分化開始后的3天內(nèi)抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制干細胞獲得內(nèi)胚層特性。

另一方面，還提供了一種促進干細胞向內(nèi)胚層來源細胞分化的方法，該方法包括刺激上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，隨后刺激間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化。

促進干細胞向內(nèi)胚層來源的細胞分化的方法，其中包括刺激TGFβ和/或SNAI1的表達。

換個說法，本發(fā)明提供了用于抑制干細胞向內(nèi)胚層來源的細胞分化的制劑，或者一種促進干細胞向中胚層、外胚層來源的細胞分化的制劑，該制劑為TGFβ抑制劑或SNAI1抑制劑。

同時，本發(fā)明也提供了TGFβ抑制劑或SNAI1抑制劑在制備抑制干細胞向內(nèi)胚層來源的細胞分化的制劑方面的應(yīng)用，或者它們在制備促進干細胞向中胚層、外胚層來源的細胞分化的制劑方面的應(yīng)用。

利用本發(fā)明中公開的抑制劑可以研制相關(guān)的治療藥物。

在本發(fā)明中，我們有證據(jù)表明在hESCs分化成肝譜系細胞的過程中發(fā)生了有序的EMT-MET過程，反映了與體細胞重編程相類似的機制⁷。這些研究結(jié)果可能有助于為重編程和分化過程中的細胞命運轉(zhuǎn)換機制提供一個統(tǒng)一的認(rèn)識。由于重編程通常被認(rèn)為是分化的逆轉(zhuǎn)，這種統(tǒng)一的機制似乎很合理，因為細胞必須經(jīng)過相似的階段，盡管是在相反的方向上，因此會涉及到相似的過程和調(diào)節(jié)物。據(jù)報道，譜系特異性分子是有效的重編程因子^13，14，這很好地映證了上述推測。進一步研究的目標(biāo)應(yīng)該是，從細胞命運的角度闡明重編程和分化過程中協(xié)調(diào)這些細胞和分子過程的作用機制。另一方面，在體內(nèi)和體外都觀察到了間充質(zhì)細胞狀態(tài)和上皮細胞狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，即EMT和MET^15-17。因此，有必要在體內(nèi)和體外從多方面進一步分析它們在細胞命運轉(zhuǎn)換過程中的耦合作用，這為正常胚胎發(fā)育和疾病過程的發(fā)生機制提供了新見解和新思路。

附圖說明

圖1.有序的EMT-MET伴隨hESCs向肝細胞樣細胞分化

(A)分化實驗方法和細胞分化各階段示意圖。示意圖顯示了有代表性的真實圖片和特定階段的標(biāo)記分子免疫熒光染色圖像，比例尺為20μm。

(B)主成分分析顯示了細胞分化過程中發(fā)生的命運轉(zhuǎn)化。PC2大致對應(yīng)于從hESCs向肝細胞樣細胞的分化過程，PC3對應(yīng)于上皮/間充質(zhì)細胞表型。

(C)從RNA-seq數(shù)據(jù)中選出的標(biāo)記基因的表達情況。基因表達量被標(biāo)準(zhǔn)化為一定時間內(nèi)的平均表達量。標(biāo)記基因從上到下依次是與多能性、DE、成肝細胞、肝細胞和EMT/MET有關(guān)的基因。

(D)基于(C)中選出的標(biāo)記基因在定向分化過程中的表達趨勢

其中，

圖2.激活素A誘導(dǎo)DE使之處于過渡間充質(zhì)細胞狀態(tài)

(A)hESCs向肝細胞分化過程中特定階段的CDH1和CDH2動態(tài)表達。

(B)肝細胞分化過程中細胞的E-M-E轉(zhuǎn)換。CDH1/CDH2的比值被用作細胞上皮/間充質(zhì)狀態(tài)的標(biāo)記。

(C)D0和D3的間充質(zhì)細胞基因的相對表達水平。GAPDH的表達水平被任意設(shè)定為1。

(D)特定分化階段的CDH1和CDH2免疫熒光染色圖像。

(E)第0天和第3天細胞的F-肌動蛋白經(jīng)過羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色后的圖像。

(F-G)hESCs和DE的遷移實驗。(D和E)中的比例尺為20μm，(F)中的比例尺為100μm。

圖3.單細胞qPCR分析顯示在hESCs向DE分化過程中存在一個同步的EMT

(A)被選基因的表達熱圖。

(B)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖。不同的顏色表示處理的具體天數(shù)，節(jié)點大小用2^{[相對表達量]}表示。開口箭頭指示在第5/7天表達POU5F1、SOX2和NANOG的hESCs樣細胞。閉合箭頭指示同時表達多能標(biāo)記基因POU5F1、SOX2、NANOG以及DE標(biāo)記基因SOX17、GATA4和GATA6的細胞。

(C)CDH1和CDH2的單細胞基因表達散點圖，顏色與(B)中的相同。

(D)特定基因在0至3天表達的相關(guān)性。

(E)SOX17和GATA6與上皮細胞標(biāo)記基因CDH1和間充質(zhì)細胞標(biāo)記基因CDH2的單細胞基因表達散點圖。顏色與(B)中的相同。

(F)第3天CDH1與SOX17、CDH2與SOX17的免疫熒光染色圖像。

圖4.TGFβ介導(dǎo)激活素A誘導(dǎo)的EMT和DE形成

(A)培養(yǎng)基中細胞分泌的TGFβ1蛋白的含量。

(B)RepSox處理細胞后被選標(biāo)記基因的單細胞qPCR分析。

(C)與圖3B中構(gòu)建的關(guān)聯(lián)圖相同，節(jié)點大小用2^{[相對表達量]}表示。

(D)一組被選定的標(biāo)記基因的集群qPCR分析。

(E)有無RepSox情況下的第3天免疫熒光染色圖像。比例尺為20μm。

(F)有無RepSox情況下的第3天細胞的遷移能力。進行的實驗如圖2F所示。

(G)特定基因siRNA的qRT-PCR效率分析。

(H)用SNAI1siRNAs處理細胞有效地抑制了SOX17和FOXA2的誘導(dǎo)表達。

圖5.hESCs來源的肝細胞樣細胞在分化第21天的特征分析

(A)細胞色素P450和α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的免疫熒光染色圖像，紅色代表細胞中表達的細胞色素P450，綠色代表細胞內(nèi)表達的α-1-抗胰蛋白酶。

(B)糖原PAS染色，細胞中富含糖原的位置被染成紅色，成熟的肝細胞具有儲存糖原的功能。

(C)Alexa488標(biāo)記的LDL攝取，綠色部分代表已被細胞攝取的LDL，成熟的肝細胞具有能夠攝取低密度脂蛋白的功能。

(D，E)吲哚菁綠(ICG)的攝取與釋放。

圖6.在有無激活素A的情況下，hESCs來源的細胞TGFβ1表達水平的qRT-PCR分析

GAPDH表達水平被任意設(shè)定為1。數(shù)據(jù)用三次獨立生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD表示。hESCs中TGFβ1基因的表達作為對照。

圖7.陰性對照siRNA(siCK)或SNAI1 siRNA(siSNAI1)處理后細胞中特定中內(nèi)胚層和內(nèi)胚層標(biāo)記基因表達的qRT-PCR分析

在沒有用siRNA處理的情況下，這些基因的表達水平被設(shè)定為1。數(shù)據(jù)用三次獨立生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD表示。

圖8.hESCs向肝細胞樣細胞分化過程中EMT-MET模式圖

hESCs向肝細胞樣細胞分化的過程中，先后經(jīng)歷EMT-MET的命運轉(zhuǎn)變， 具體說來hESCs表達干細胞標(biāo)志基因POU5F1與NANOG，同時它還表達上皮細胞標(biāo)志基因CDH1；定型內(nèi)胚層(DE)細胞的標(biāo)志基因是是SOX17與FOXA2，它還表達間充質(zhì)細胞標(biāo)志基因CDH2；成肝細胞(HB)的標(biāo)志基因是HNF4A與AFP，它同時表達上皮細胞與間充質(zhì)細胞的標(biāo)志基因CDH1與CDH2；成熟的肝細胞(HC)的標(biāo)志基因是ALB與TTR，同時它還表達上皮細胞標(biāo)志基因CDH1。在肝分化階段前期，激活素A激活的內(nèi)源性TGFβ能促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)并依賴Snail1形成定形內(nèi)胚層(DE)。

附圖中涉及的英文或英文縮寫含義：

Day：天 Activin A：激活素A Definitive endoderm：定形內(nèi)胚層

Hepatoblast：成肝細胞 Hepatocyte：肝細胞 Change around mean of expression：平均表達量的變化 Average expression of selected markers：選定標(biāo)記基因的平均表達量 Pluripotency：多能性 Epithelial genes：上皮細胞基因 Mesenchymal genes：間充質(zhì)細胞基因

Relative gene expression：基因相對表達量 Migration distance：遷移距離24hr：24小時 48hr：48小時

Relative expression：相對表達量 Correlation：相關(guān)性

TGFβ1 protein： TGFβ1 蛋白 Blank：空白對照 Activin A：激活素A Relative expression： 相對表達量 Day：天 Fold change：倍性變化Migration(um)：遷移距離(um) Relative mRNA level： mRNA相對水平

ICG Uptake：ICG攝取 ICG Release： ICG釋放

Activin A：激活素A Day 3：第3天

Relative mRNA level：mRNA相對水平

詳細說明

為清楚說明本發(fā)明，并非要限制本發(fā)明，本發(fā)明的詳細說明被分為以下幾小部分，分別介紹本發(fā)明的一些特征、方法、實施例或申請。

實驗方法

人ESCs的培養(yǎng)及肝細胞定向分化

未分化的人H1ES細胞在37℃、5％CO₂條件下，以mTeSR1為培養(yǎng)基(Stemcell Technologies，05850)在基底膜基質(zhì)(BD Biosciences，354277)上進行單層培養(yǎng)。細胞每3至5天進行人工傳代培養(yǎng)，傳代比例為1：4-1：6。關(guān)于肝細胞定向分化方法，我們是在已有文獻報道的基礎(chǔ)上做了小的改進，制定了一種無血清的肝細胞定向分化方案^8，9。簡單來講，H1細胞在含有100ng/ml激活素A(Peprotech，A120-14E)的RPMI/B27培養(yǎng)基(不含胰島素，Gibco，A18956-01)中培養(yǎng)3天，然后在含20ng/ml BMP2(Peprotech，120-02)和30ng/ml FGF-4(Peprotech，100-31)的RPMI/B27(包括胰島素，Gibco，17504-044)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，接著在含20ng/ml HGF(Peprotech，100-39)和KGF(Peprotech，100-19)的RPMI/B27(包括胰島素)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天，最后在含20ng/ml抑瘤素M(R&D Systems，295-OM/CF)的肝細胞培養(yǎng)基(Lonza，cc-3198)中培養(yǎng)8天，肝細胞培養(yǎng)基中補充有SingleQuots(不含EGF)。

免疫熒光染色

蓋玻片上的細胞用4％多聚甲醛(PFA，井鑫，GI001，廣州)固定30min，PBS沖洗三次后，用0.3％Triton X-100(Sigma，T9284)/PBS膜通透處理30min。在用PBS簡單沖洗兩次后，將細胞置于10％FBS(ExCell Biology，F(xiàn)SP500)/PBS中，室溫下封閉1h。對于肌動蛋白染色，將細胞置于1單位/ml羅丹明鬼筆環(huán)肽(Invitrogen，R415)中，室溫下孵育60min。對于免疫熒光染色，樣品與第一抗體(稀釋于含0.3％Triton X-100/10％FBS的1xPBS中)在4℃孵育過夜，在用封閉液沖洗3次后，與第二抗體在室溫下孵育1h。細胞連續(xù)用封閉液和PBS沖洗后，用DAPI(Sigma，D9542)復(fù)染5min，然后在Zeiss LSM 710共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss)下成像。

實時RT-PCR

用Trizol試劑(MRC，TR1187)提取總RNA并用ReverTraAce試劑盒(TOYOBO，34520B1)對2μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。把產(chǎn)物(cDNA)進行適當(dāng)稀釋，用作PCR模板。利用Premix Ex Taq^TM試劑盒(TAKARA，RR420A)在CFX96 Touch^TM實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad)中進行PCR反應(yīng)。用GAPDH作內(nèi)對照。每項測定進行3至4次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)用平均值±SD表示。

siRNA處理

Ribobio(中國廣州)公司分別設(shè)計和合成了針對人SNAI1、SNAI2、TWIST1、TWIST2和ZEB1的三個獨立siRNAs。按照制造商的說明書，利用Lipofectamine RNAiMAX試劑(Life Technologies，13778-150)進行了siRNAs轉(zhuǎn)染，每個siRNA的最終濃度是30nM。對mTeSR1中培養(yǎng)的融合度達70～80％的H1細胞進行連續(xù)三次轉(zhuǎn)染(每隔48小時)。然后在上述第三次轉(zhuǎn)染24小時后用激活素A對細胞進行處理。在第三次轉(zhuǎn)染后的96h用實時RT-PCR測定siRNA的基因沉默效率。針對每個基因，選擇最有效的兩個siRNAs進行混合，用于進一步的實驗。

RNA-seq分析

在hESCs向肝細胞樣細胞分化過程的第0、1、2、3、5、7、9、11、13和21天分別提取其總RNA。利用TruSeq RNA樣品制備試劑盒(Illumina，RS-122-2001)，用大約4μg RNA構(gòu)建了cDNA快速測序文庫。利用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN，28704)從凝膠薄片中回收DNA片段(250-300bp)。利用dsDNA HS分析試劑盒(Invitrogen，Q32851)測定cDNA文庫的濃度。按照制造商的說明書，在MiSeq上對樣品進行測序，平均測序深度為2百萬序列標(biāo)簽。利用Bowtie2(v2.2.0)¹⁸和RSEM(v1.2.17)¹⁹對讀出序列和ENSEMBL(mm10v76)轉(zhuǎn)錄組進行比對，利用EDASeq(v2.0.0)²⁰對GC進行歸一化。利用glbase ²¹進行分析。讀出序列被保存在GEO中，編號為:GSEXXXXXX。

單細胞qPCR和分析

按照制造商的說明書，利用Fluidigm C1和BioMark HD進行單細胞qPCR。簡單來講，濃度為166～250K/mL的細胞懸浮液被置于10-17μm C₁^TM單細胞自動制備IFC室(Fluidigm，PN100-5479)中，由Fluidigm C₁^TM系統(tǒng)捕獲細胞。進一步分析時，無細胞的孔和被多個細胞占據(jù)的孔都被排除在外。細胞被捕獲后，利用Ambion Single Cell-to-CT試劑盒(Life Technologies，PN 4458237)和C₁^TM單細胞自動制備模塊2試劑盒(Fluidigm，PN100-5519)進行反轉(zhuǎn)錄和cDNA預(yù)擴增。在利用Gene Expression Master Mix(Life Technologies，4369016)和inventoried基因表達分析(20X，Applied Biosystems)進行分析前，預(yù)擴增產(chǎn)物被稀釋10倍后加入96.96dynamic Arrays ^TM on a BioMark System(Fluidigm)。單細胞qPCR采用的是Inventoried TaqMan引物。根據(jù)Buganim等人 于2012年所述方法²²計算了相對表達量，除了Ct值＝25用于低表達基因之外。作為glbase²¹的一部分，制作了關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖(mdsquish)，并將在其他處進行詳細說明。簡單來講，針對奇異值分解主成分2、3、4和5，測量了所有細胞之間的標(biāo)準(zhǔn)化歐式距離。然后利用弱連接(虛線)的閾值0.92和強連接(實線)的閾值0.99構(gòu)建一個網(wǎng)絡(luò)，每一節(jié)點最多有50條最佳評分邊，接著利用graphviz‘neato’布局器對網(wǎng)絡(luò)進行布局。節(jié)點大小用2^{[相對表達量]}表示。

細胞遷移實驗

劃痕試驗被用于測定H1來源細胞的遷移能力。簡單來講，即用針頭或槍頭在已完全長滿單層細胞的培養(yǎng)皿表面劃出一個無細胞區(qū)域，劃痕邊緣的細胞會進入無細胞區(qū)域。在遷移前，對空白區(qū)域進行拍照，測量劃痕的邊界。在24-48h期間每隔一定時間對細胞遷移拍照用于數(shù)據(jù)分析。

ELISA

按照制造商的說明書，利用ELISA試劑盒(R&D Systems，DB100B)測定培養(yǎng)基中的TGFβ蛋白的含量。

PAS染色

按照制造商的說明書，利用PAS染色試劑盒(Polysciences，24200-1)進行PAS染色。

LDL攝取

利用PBS沖洗細胞并將其置于含4μg/ml低密度脂蛋白(LDL)(Invitrogen，L23380)的培養(yǎng)基中37℃孵育30min。然后，用4％多聚甲醛對細胞進行固定并通透然后用DAPI(Sigma，D9542)進行染色。在熒光顯微鏡下檢測細胞攝取的LDL含量。

ICG攝取和釋放

吲哚菁綠(ICG)(Sigma，1340009)溶解在5mg/m DMSO中。 在準(zhǔn)備好細胞后，ICG被稀釋于新制的1mg/ml培養(yǎng)基中。稀釋的ICG被加入到培養(yǎng)細胞中，37℃下孵育30min。用PBS沖洗后，在顯微鏡下檢測細胞攝取的ICG。然后細胞被再次放入無ICG培養(yǎng)基中孵育6h，再在顯微鏡下檢測細胞是否釋放ICG。

有序的EMT-MET轉(zhuǎn)換與hESCs向肝細胞分化有關(guān)

由于存在E-鈣粘蛋白(CDH1)的顯著表達，hESCs應(yīng)當(dāng)被視為處于多能狀態(tài)的上皮細胞。同樣地，肝細胞也是上皮細胞，但卻是體細胞并且是完全分化的。因此，hESCs生成肝細胞應(yīng)當(dāng)遵循從一種類型的上皮細胞到另一種類型的上皮細胞的轉(zhuǎn)變過程，伴隨有多能性的逐漸喪失和肝特性的獲得，無需經(jīng)過間充質(zhì)細胞狀態(tài)。為了繪制細胞命運圖和hESCs向肝細胞分化途徑圖，我們采用了化學(xué)成分確定、不含血清的hESCs向肝細胞分化實驗方法，逐步加入激活素A、FGF4/BMP2，HGF/KGF和Oncostatin M^8，9。如圖1A所示，在第0、3、13和21天，用POU5F1/NANOG(多能)，SOX17/FOXA2(定形內(nèi)胚層；DE)，HNF4A/AFP(成肝細胞)和ALB/TTR(肝細胞)標(biāo)記出不同的階段?；谥鞒煞址治?，可以清楚地看到上皮細胞狀態(tài)從hESCs開始，然后hESCs在恢復(fù)到上皮細胞狀態(tài)之前在第3天轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞狀態(tài)(圖1B)。圖1C中詳細分析的分子標(biāo)記進一步證明了這種有序的EMT-MET轉(zhuǎn)換。實際上，這些基因表達模式可用于模擬分化體系中定型的相對各階段(圖1D)，表明從上皮細胞多能狀態(tài)到間充質(zhì)細胞狀態(tài)，然后到上皮成肝細胞/肝細胞，是一種協(xié)調(diào)好的動態(tài)變化。除了EMT-MET外，我們還觀察到多能性、DE、成肝細胞和肝細胞命運特有的基因顯著變化和動態(tài)變化(圖1D)。這些結(jié)果證明有序的上皮-間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化是hESCs向肝細胞分化的原因，反映了與重編程已知過程相似的EMT-MET過程⁷。

細胞分化過程中的過渡間充質(zhì)細胞狀態(tài)

圖1中，集群RNA-seq揭示的間充質(zhì)細胞狀態(tài)被定義為間充質(zhì)細胞標(biāo)記基因如CDH2(N-鈣粘蛋白)和SNAI1顯著表達、上皮細胞CDH1(E-鈣粘蛋白)快速喪失和多能標(biāo)記基因如POU5F1和NANOG下調(diào)。但是，在激活素A體外誘導(dǎo)的hESCs向DE分化過程中也觀察到了類似變化^10，11，這些過渡 型細胞是否完全具有間充質(zhì)細胞表型或者僅僅下調(diào)CDH1表達而未獲得真正的間充質(zhì)細胞功能和遷移功能尚不清楚。為進一步研究這一間充質(zhì)細胞狀態(tài)的特性，我們繪制了分化過程中CDH1和CDH2的表達圖，顯示在第3天CDH1下調(diào)，CDH2上調(diào)(圖2A)，即上皮細胞特性下調(diào)，同時獲得間充質(zhì)細胞特性。在蛋白質(zhì)水平上，我們對CDH1和CDH2進行染色顯示，在第3天CDH1幾乎完全消失，與此同時獲得CDH2(圖2D)。有趣地是，在以后的幾天細胞對CDH1和CDH2同時呈陽性，表明CDH1和CDH2的表達并不是互相排斥的(圖2D)。然后我們對一組間充質(zhì)細胞基因如VIM、SNAI1、SNAI2、ZEB1和TWIST1第0和3天的表達水平進行了比較，結(jié)果顯示這些基因上調(diào)，與之相反，CDH1下調(diào)(圖2C)。對第3天細胞中的F肌動蛋白進行鬼筆環(huán)肽染色顯示，肌動蛋白微絲結(jié)構(gòu)是間充質(zhì)細胞所特有的(圖2E).。為進一步證明這些細胞確實是間充質(zhì)細胞，我們進行了劃痕試驗，顯示僅第3天的細胞能夠遷移，與之相比，第0天hESCs完全沒有移動(圖2F和2G)?？傊覀冋J(rèn)為第3天的細胞確實是間充質(zhì)細胞。

hESCs分化從近乎同步的發(fā)生EMT開始

圖1B所示集群RNA-seq數(shù)據(jù)集顯示了從上皮細胞到間充質(zhì)細胞再到上皮細胞的命運總體變化。盡管我們可以按照時間梳理出E-M-E階段中從多能狀態(tài)到肝細胞狀態(tài)的不同模式(圖1C)，但是集群方法不能反映分化過程中的異質(zhì)性。為了進一步在單細胞分辨率下分析這一過程，我們在501個細胞(圖3A)中對選定的46個基因和2個對照基因(GAPDH，ACTB)進行了單細胞qPCR，并構(gòu)建了所有細胞的基因表達關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)(圖3B)。POU5F1在進入內(nèi)胚層后最初是上調(diào)的，但在第3天下調(diào)，盡管POU5F1和NANOG并未完全消失，并始終保持低水平一直持續(xù)到分化的第7天(圖3B)，這與集群RNA-seq的結(jié)果(圖1C)相一致。正如預(yù)期的那樣，SOX17和GATA6在第3天上調(diào)，GATA4和HNF4A隨后被輕度誘導(dǎo)(圖3B)。第3天的細胞在對激活素A的反應(yīng)和獲得DE特性方面表現(xiàn)出高度的同質(zhì)性(與集群RNA-seq相比，R²＝0.74)，表明它們幾乎是同時經(jīng)過EMT。這值得注意，或許反映了起始hESCs的同質(zhì)性或激活素A的同步能力。

出人意料地是，同步性似乎在第5天被終止，許多細胞同時表達CDH1和 CDH2，與集群的相關(guān)性也顯著降低(R²＝0.45)，表明存在高度異質(zhì)性。與同步轉(zhuǎn)異步相一致，起始EMT是專一的：細胞在第3天只表達CDH2，但是隨后的MET是異質(zhì)的，許多細胞在第5天同時表達CDH1和CDH2，僅有少量的細胞在第7天不再表達CDH2(圖3B和3C)。

有趣地是，在第5和7天，我們發(fā)現(xiàn)了少量(分別是11和12個)hESC樣細胞。這些細胞都表達POU5F1、SOX2、NANOG和CDH1，但是不表達HNF4A或SOX17(圖3B，開口箭頭)，表明它們可能抵抗細胞分化或分化的hESCs保留它們之前狀態(tài)的表觀遺傳記憶，以某種方式恢復(fù)到與未分化的hESCs更相似的狀態(tài)。此外，在第5和7天，分別有11和5個細胞同時表達POU5F1、SOX2、NANOG、SOX17、GATA4和GATA6(圖3B，閉合箭頭)，表明定型未完成。盡管有些細胞在第5天開始表達成肝細胞標(biāo)記基因HNF4A，但它卻在第7天廣泛表達。但是，第7天的細胞顯示有高度異質(zhì)性(與集群RNA-seq相比，R²＝0.29)，存在由hESC樣細胞(n＝12)、混合內(nèi)胚層前體細胞(n＝5)、成肝細胞(n＝62)，甚至表達低水平AFP的少量定形肝細胞樣細胞(n＝5)組成的混合細胞群體(圖3B)。然而，這些單細胞分析還顯示，在hESCs和肝細胞樣細胞之間存在一個有序的EMT-MET過程，這與集群-seq數(shù)據(jù)集相一致。

EMT發(fā)生在定形內(nèi)胚層形成之前

.接下來，我們希望解決EMT和獲得DE標(biāo)記之間的關(guān)系。之前的一項報告表明，當(dāng)EOMES基因沉默時，EMT可以與DE標(biāo)記分開¹¹。在本研究中，我們使用了單細胞qPCR分析技術(shù)，當(dāng)關(guān)聯(lián)圖形成后，就能顯示出獲得DE標(biāo)記和EMT發(fā)生的時間順序。當(dāng)我們對0-3天的單細胞qPCR相關(guān)基因表達(圖3D)進行聚類分析時，發(fā)現(xiàn)了以CDH1或CDH2為中心的兩大集群。CDH1集群包括POU5F1和SOX2，即多能狀態(tài)，而CDH2集群包括主要的DE標(biāo)記基因FOXA2、GATA6、GATA4和SOX17。為了更詳細地確定準(zhǔn)確的時間，我們?yōu)閱蝹€細胞中CDH1或CDH2與DE標(biāo)記基因SOX17和GATA6的表達繪制了散點圖(圖3E)。發(fā)現(xiàn)在第3天SOX17和GATA6表達與CDH1表達是互相排斥的，相反地，SOX17和GATA6表達與CDH2表達同時進行。為進一步分析這種變化，我們還進行了免疫熒光分析，結(jié)果顯示SOX17陽性細胞都對CDH1呈陰性，但是對CDH2呈陽性(圖3F)。更重要的是，存在對CDH2呈陽性但對SOX17呈陰性的細胞，表明發(fā)生了EMT， 但是這些細胞中的SOX17還沒有被充分誘導(dǎo)(圖3F)。這些結(jié)果表明，EMT發(fā)生在DE特化之前。

激活素A激活的內(nèi)源性TGFβ促進EMT發(fā)生和DE形成

分化過程開始時的快速同步EMT引起了我們的興趣。但是，激活素A不是 EMT的一個強效誘導(dǎo)劑，所以它可能通過其他EMT誘導(dǎo)信號的刺激發(fā)揮作用。我們之前報道了TGFβ是MEFs重編程為iPSCs的一個主要障礙：必須用重編程因子對其進行抑制從而促使MET和體細胞重編程的發(fā)生⁵。我們的RNA-seq數(shù)據(jù)表明，通過激活素A處理可以強效誘導(dǎo)TGFβ，這樣在DE形成過程中內(nèi)源性TGFβ可以誘導(dǎo)EMT。為了驗證這一假設(shè)，我們用qRT-PCR測定了TGFB1基因表達，結(jié)果顯示激活素A在第3天顯著激活TGFB1(圖6)。同樣地，我們利用ELISA法可以檢測培養(yǎng)基中第3天細胞的TGFβ蛋白(1.5ng/ml)生理水平(圖4A)。為了研究它在EMT中的作用，我們將TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑RepSox¹²加入到細胞中，單細胞qPCR分析顯示，它不僅抑制EMT還抑制DE的形成(圖4C)。很顯然，在第3天，用RepSox處理的細胞距離hESCs非常近，繼續(xù)抑制POU5F1和NANOG(圖4C)，表明TGFβ介導(dǎo)的EMT是激活素A處理的hESCs退出多能狀態(tài)所必需的。實際上，這些細胞保持與hESCs相同水平的CDH1和SOX2表達(圖4C)。然而，激活素A處理的細胞在第3天顯著表達SOX17，RepSox處理則完全抑制其誘導(dǎo)(圖4C)。另一方面，在RepSox處理的細胞中，外胚層標(biāo)記如SOX1和PAX6被輕度誘導(dǎo)(圖4C)。這些結(jié)果表明，在有RepSox的情況下，激活素A處理的hESCs未能經(jīng)歷EMT并分化成DE。

我們通過qRT-PCR分析EMT和其他譜系標(biāo)記進一步驗證了TGFβ的作用，結(jié)果顯示RepSox抑制CDH2、SNAI1、SNAI2、ZEB1、KLF8和VIM的表達，同時維持CDH1表達，并抑制中內(nèi)胚層/內(nèi)胚層標(biāo)記如GSC，EOMES、MIXL1、SOX17、FOXA2、GATA4、GATA6、HHEX和LGR5的表達(圖4D)。值得注意的是，其他譜系標(biāo)記如PAX6、GATA2、BMP4和GATA3似乎被輕微上調(diào)，表明存在中胚層/神經(jīng)外胚層這一不同的細胞命運。利用免疫染色進一步驗證了在有無RepSox情況下，CDH1和SOX17之間的相互排斥性以及CDH2和SOX17的共調(diào)控(圖4E)。同時我們測定了這些細胞的遷移能力，發(fā)現(xiàn)與DE細胞相比，在有RepSox的情況下，用激活素A誘導(dǎo)的細胞第3天的活動能力較差(圖4H)。這 些結(jié)果表明，TGFβ不僅是EMT所必需的，還是在激活素A誘導(dǎo)的hESCs中形成DE所必需的。

SNAI1是EMT和DE形成所必需的

然后我們把注意力轉(zhuǎn)向在第3天上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子，并決定根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)集重點研究SNAI1和TWIST家族成員(圖1C和2C)。我們首先設(shè)計了這些基因的siRNAs，并利用qRT-PCR檢驗了它們的基因沉默效率(圖4G)。我們發(fā)現(xiàn)，在這些候選基因中，SNAI1是激活CDH2以及DE標(biāo)記如SOX17和FOXA2的最關(guān)鍵基因(圖4H)。另外，當(dāng)SNAI1基因沉默時，檢測到的所有中內(nèi)胚層/內(nèi)胚層標(biāo)記基因其表達都受到了類似抑制(圖7)。這些結(jié)果表明，SNAI1是EMT和DE細胞命運特化所必不可少的?？傊覀兊臄?shù)據(jù)顯示，激活素A誘導(dǎo)TGFβ自分泌生成，這反過來誘導(dǎo)SNAI1介導(dǎo)的EMT程序，包括hESCs向肝細胞分化過程中固有的間充質(zhì)細胞階段。

具體實施方式

為了說明本發(fā)明，提供了以下實施例，這不應(yīng)被視為對本發(fā)明的限制。

實施例1

利用TGFβ抑制劑抑制hESCs向定形內(nèi)胚層分化。

分化過程中的細胞培養(yǎng)條件如下所示：融合度近50％的未分化人H1ES細胞在接種后用Accutase進行傳代培養(yǎng)24h，其融合度在37℃、5％CO2條件下達到近90％。然后，H1細胞在有無2μM Repsox的情況下，在補充有激活素A的RPMI/B27培養(yǎng)基(不含胰島素)中培養(yǎng)3天。

在hESCs開始分化的第0天加入TGFβ信號通路抑制劑RepSox，終濃度2μM。

在細胞分化過程中，對不同層類型細胞的各種標(biāo)志基因，即SOX1/PAX6(外胚層標(biāo)志基因)、GATA2/BMP4(中胚層標(biāo)志基因)、SOX17/FOXA2(內(nèi)胚層標(biāo)志基因)的表達進行了檢測，從而對分化細胞進行評估。

像單細胞qPCR和生物信息學(xué)、免疫熒光染色和實時RT-PCR等技術(shù)被用于評估TGFβ抑制劑對hESCs向肝細胞分化的影響。這些方法的詳細描述見實驗方法那一部分。

研究結(jié)果如圖4B-E所示。hESCs的標(biāo)志基因POU5F1/NANOG、外胚層的標(biāo)志基因SOX1/PAX6和中胚層的標(biāo)志基因分別進行了表達(圖4B-D)。然而在此期間卻無內(nèi)胚層標(biāo)志基因表達。

作為對照組，hESCs使用了相同的培養(yǎng)條件進行分化，但是沒有加入TGFβ信號通路抑制劑。大多數(shù)hESCs來源的細胞顯著表達了內(nèi)胚層標(biāo)志基因，例如SOX17、FOXA2、GATA4和GATA6，但是其他層類型細胞的標(biāo)志基因幾乎沒有被檢測到。

因此，可以斷定加入TGFβ信號通路抑制劑能夠抑制hESCs分化形成定形內(nèi)胚層來源的細胞。

同時，TGFβ抑制劑能夠提高外胚層和中胚層的標(biāo)志基因的表達(圖4B-D)。

實施例2

利用SNAI1siRNAs抑制hESCs向定形內(nèi)胚層分化。

細胞在分化過程中的培養(yǎng)條件如下所示。H1細胞在第三次轉(zhuǎn)染后在補充有20ng/ml激活素A的RPMI/B27培養(yǎng)基(不含胰島素)中培養(yǎng)3天。

在細胞分化過程中，對定形內(nèi)胚層的各種標(biāo)志基因，即SOX17、FOXA2、GSC、GATA4、GATA6等的表達進行了檢測，從而對分化細胞進行評估。

方法包括siRNA處理和實時RT-PCR。實驗方法的詳細說明見實驗方法那一部分。

研究結(jié)果見圖4G-H和圖7。在候選基因中，SNAI1是激活CDH2和DE標(biāo)志基因如SOX17和FOXA2的最關(guān)鍵基因(圖4H)。此外，當(dāng)SNAI1基因沉默時，檢測到的所有中內(nèi)胚層/內(nèi)胚層標(biāo)志基因其表達均受到了同樣地抑制(圖7)。這些結(jié)果表明，SNAI1是EMT和DE細胞命運定型所不可或缺的。當(dāng)SNAI1受到抑制或基因沉默時，能夠抑制hESCs分化形成定型層來源的細胞。

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