本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基及其制備方法。

背景技術(shù)：

肝臟作為人體中最重要的器官之一，承擔(dān)著合成、分泌、代謝、解毒等多種復(fù)雜的功能。一旦由各種原因造成肝細(xì)胞的大量壞死，將會(huì)出現(xiàn)肝衰竭，導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂和毒性物質(zhì)的堆積，而這反過來又加重了肝細(xì)胞的損傷，影響肝細(xì)胞的再生，進(jìn)而形成肝衰竭的惡性循環(huán)。急性肝功能衰竭是一種嚴(yán)重的肝臟疾病，死亡率高達(dá)60～90％。目前，對(duì)此最有效的治療方法為肝臟移植。然而，由于供體器官缺乏、費(fèi)用高昂、需長期使用免疫抑制劑等原因，往往在等待供體過程中，病人由于病情進(jìn)展而迅速死亡，極大地限制了肝移植手術(shù)的廣泛開展。因此，以培養(yǎng)肝細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物型人工肝技術(shù)成為終末期肝病患者向原位肝移植順利過渡、以及給急性肝功能衰竭患者受損肝臟提供得以再生和修復(fù)時(shí)機(jī)的重要手段。

中國專利申請(qǐng)CN102311938A公開了一種用于肝細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，其包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組分，其中，所述添加組分包括：胰島素0.1～10μg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白0.5～10μg/mL、亞硒酸鈉5～10μg/L、表皮生長因子1～100ng/mL、肝細(xì)胞生長因子1～100ng/mL、纖粘連蛋白0.1～1μg/mL、地塞米松0.1～10nmol/mL和胰高血糖素0.05～5μg/mL。

中國專利申請(qǐng)CN105087465A公開了一種肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其包括以下組分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500mL；絲膠蛋白0.05～0.5％；地塞米松0.1～1000nmol/mL；肝細(xì)胞生長因子5～20ng/mL；表皮生長因子10～50ng/mL；青鏈霉素100U/mL。

目前，雖然已經(jīng)研發(fā)出用于肝細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，但是，存在價(jià)格昂貴，不利于日常應(yīng)用、廣泛推廣及肝細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基成分明確且價(jià)格較低，有利于日常應(yīng)用、廣泛推廣及肝細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)。本發(fā)明提供的培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基不含有胎牛血清，不含任何動(dòng)物來源成份，能提供細(xì)胞生長增殖所需的充足營養(yǎng)與良好環(huán)境，

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：膽固醇4-7mg/L，硫辛酸0.2-0.4mg/L，細(xì)胞生長因子20-35μg/L，硫酸軟骨素0.2-0.5mg/L，生物素13-16μM，胰島素0.9-1.3mg/L，過氧化氫酶10-17mg/L，?；撬?.1-0.3g/L，肉豆蔻酸6-8mg/L，纖粘連蛋白14-22μg/L。

進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：膽固醇5mg/L，硫辛酸0.3mg/L，細(xì)胞生長因子28μg/L，硫酸軟骨素0.4mg/L，生物素15μM，胰島素1.1mg/L，過氧化氫酶14mg/L，?；撬?.2g/L，肉豆蔻酸7mg/L，纖粘連蛋白17μg/L。

進(jìn)一步地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12或RMPI 1640培養(yǎng)基。

進(jìn)一步地，所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子按重量比2-5∶7-11組成。

進(jìn)一步地，所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子按重量比3∶10組成。

另外，本發(fā)明還提供了所述培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基的制備方法，步驟如下：

S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞生長因子、?；撬岷屠w粘連蛋白，攪拌20-30分鐘，加入膽固醇、硫辛酸、硫酸軟骨素、生物素、胰島素和肉豆蔻酸，繼續(xù)攪拌23-35分鐘，加入過氧化氫酶，攪拌20分鐘，得混合物；

S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至6.7-7.3，用0.2-0.25微米濾膜過濾除菌，即得。

優(yōu)選地，所述步驟S1攪拌23分鐘。

優(yōu)選地，所述步驟S1繼續(xù)攪拌32分鐘。

優(yōu)選地，所述步驟S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至6.9。

優(yōu)選地，所述步驟S2用0.22微米濾膜過濾除菌。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，添加的添加劑包括細(xì)胞生長因子、膽固醇、硫辛酸、硫酸軟骨素和生物素等。在本發(fā)明的各種培養(yǎng)基的成分中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基能夠提供肝細(xì)胞的生存和最低的生理活動(dòng)。在本發(fā)明中，膽固醇作為一種脂類，參與形成細(xì)胞膜。在本發(fā)明中，硫辛酸與本發(fā)明所用其他原料協(xié)同作用，能夠提高肝細(xì)胞的細(xì)胞活率，另外，硫辛酸還起到抗氧化的作用。在本發(fā)明中，生物素能參與肝細(xì)胞的代謝，對(duì)肝細(xì)胞的生長和代謝起控制作用，并且與硫辛酸協(xié)同作用，起到抗氧化的作用，能消除氧自由基對(duì)細(xì)胞的損害。在本發(fā)明中，過氧化氫酶能夠清除自由基，保護(hù)肝細(xì)胞免受超氧自由基損害等。在本發(fā)明中，?；撬崮軌虼龠M(jìn)肝細(xì)胞的增殖，與本發(fā)明所用其他原料協(xié)同作用，能夠顯著提高的肝細(xì)胞的增殖倍數(shù)。在本發(fā)明中，胰島素可通過作用于肝細(xì)胞表面的胰島素受體，增強(qiáng)肝細(xì)胞對(duì)能源的攝入和利用，同時(shí)促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)的RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，抑制細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)肝細(xì)胞的活力與功能。在本發(fā)明中，纖粘連蛋白能夠促進(jìn)肝細(xì)胞的黏附，及其貼壁生長。在本發(fā)明中，細(xì)胞生長因子能夠促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，以及調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的功能。在本發(fā)明中，肉豆蔻酸能夠促進(jìn)肝細(xì)胞的生長。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入硫酸軟骨素，能增加細(xì)胞的信使核糖核酸和脫氧核糖核酸的生物合成以及具有促進(jìn)細(xì)胞代謝的作用，與其他原料配合使用，能夠達(dá)到更好的提高肝細(xì)胞的增殖倍數(shù)和細(xì)胞活率的效果。

本發(fā)明培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基搭配合理，各成分間協(xié)同作用，能提供細(xì)胞生長增殖所需的充足營養(yǎng)與良好環(huán)境，促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，提高肝細(xì)胞的細(xì)胞活率。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基具有以下優(yōu)勢：

(1)本發(fā)明提供的培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基成分明確且價(jià)格較低，有利于日常應(yīng)用、廣泛推廣及肝細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)。

(2)本發(fā)明提供的培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基，不含有胎牛血清，不含任何動(dòng)物來源成份，能提供細(xì)胞生長增殖所需的充足營養(yǎng)與良好環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞黏附、生長和增殖，顯著提高肝細(xì)胞的增殖倍數(shù)和細(xì)胞活率。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

本發(fā)明所用RMPI 1640培養(yǎng)基可購自Hyclone公司，F(xiàn)12培養(yǎng)基可購自Hyclone公司，硫酸軟骨素可購自嘉興恒杰生物制藥有限公司。

實(shí)施例1、一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基

所述培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：膽固醇4mg/L，硫辛酸0.2mg/L，細(xì)胞生長因子20μg/L，硫酸軟骨素0.2mg/L，生物素13μM，胰島素0.9mg/L，過氧化氫酶10mg/L，?；撬?.1g/L，肉豆蔻酸6mg/L，纖粘連蛋白14μg/L。

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。

所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子按重量比2∶11組成。

制備方法：

S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞生長因子、?；撬岷屠w粘連蛋白，攪拌20分鐘，加入膽固醇、硫辛酸、硫酸軟骨素、生物素、胰島素和肉豆蔻酸，繼續(xù)攪拌23分鐘，加入過氧化氫酶，攪拌20分鐘，得混合物；

S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至6.7，用0.2微米濾膜過濾除菌，即得。

實(shí)施例2、一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基

所述培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：膽固醇7mg/L，硫辛酸0.4mg/L，細(xì)胞生長因子35μg/L，硫酸軟骨素0.5mg/L，生物素16μM，胰島素1.3mg/L，過氧化氫酶17mg/L，?；撬?.3g/L，肉豆蔻酸8mg/L，纖粘連蛋白22μg/L。

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RMPI 1640培養(yǎng)基。

所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子按重量比5∶7組成。

制備方法：

S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞生長因子、?；撬岷屠w粘連蛋白，攪拌30分鐘，加入膽固醇、硫辛酸、硫酸軟骨素、生物素、胰島素和肉豆蔻酸，繼續(xù)攪拌35分鐘，加入過氧化氫酶，攪拌20分鐘，得混合物；

S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至7.3，用0.25微米濾膜過濾除菌，即得。

實(shí)施例3、一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基

所述培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：膽固醇5mg/L，硫辛酸0.3mg/L，細(xì)胞生長因子28μg/L，硫酸軟骨素0.4mg/L，生物素15μM，胰島素1.1mg/L，過氧化氫酶14mg/L，?；撬?.2g/L，肉豆蔻酸7mg/L，纖粘連蛋白17μg/L。

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RMPI 1640培養(yǎng)基。

所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子按重量比3∶10組成。

制備方法：

S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞生長因子、?；撬岷屠w粘連蛋白，攪拌23分鐘，加入膽固醇、硫辛酸、硫酸軟骨素、生物素、胰島素和肉豆蔻酸，繼續(xù)攪拌32分鐘，加入過氧化氫酶，攪拌20分鐘，得混合物；

S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至6.9，用0.22微米濾膜過濾除菌，即得。

對(duì)比例1、一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基

所述培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：膽固醇5mg/L，硫辛酸0.3mg/L，細(xì)胞生長因子28μg/L，硫酸軟骨素0.4mg/L，生物素15μM，胰島素1.1mg/L，過氧化氫酶14mg/L，?；撬?.2g/L，肉豆蔻酸7mg/L，纖粘連蛋白17μg/L。

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RMPI 1640培養(yǎng)基。

所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子按重量比1∶1組成。

制備方法與實(shí)施例3類似。

與實(shí)施例3的區(qū)別在于，所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子按重量比1：1組成。

對(duì)比例2、一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基

所述培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：膽固醇5mg/L，硫辛酸0.3mg/L，細(xì)胞生長因子28μg/L，硫酸角質(zhì)素0.4mg/L，生物素15μM，胰島素1.1mg/L，過氧化氫酶14mg/L，牛磺酸0.2g/L，肉豆蔻酸7mg/L，纖粘連蛋白17μg/L。

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RMPI 1640培養(yǎng)基。

所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子按重量比3∶10組成。

制備方法與實(shí)施例3類似。

與實(shí)施例3的區(qū)別在于，將硫酸軟骨素替換為硫酸角質(zhì)素。

試驗(yàn)例一、本發(fā)明培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基對(duì)肝細(xì)胞的培養(yǎng)效果

1、試驗(yàn)對(duì)象：本發(fā)明實(shí)施例1-3所得培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基，以及對(duì)比例1和對(duì)比例2所得培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基。

2、試驗(yàn)方法：

將肝細(xì)胞分別接種于實(shí)施例1-3所得培養(yǎng)基，以及對(duì)比例1和對(duì)比例2所得培養(yǎng)基，在5％CO2及37℃環(huán)境中傳代培養(yǎng)，傳代過程中使用0.25％胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行消化后，按1∶1體積比加入大豆胰蛋白酶抑制劑(1mg/mL)并重懸，然后以1000rpm離心5min，棄去上清，以各自培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)傳代培養(yǎng)，每24h更換培養(yǎng)基。不同培養(yǎng)基對(duì)肝細(xì)胞的細(xì)胞增殖結(jié)果如表1所示，不同培養(yǎng)基的細(xì)胞活率如表2所示。

表1：不同培養(yǎng)基對(duì)肝細(xì)胞的細(xì)胞增殖結(jié)果

由表1可以看出，在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，生長在本發(fā)明所得實(shí)施例1-3所得培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基中肝細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，明顯大于生長在對(duì)比例1和對(duì)比例2所得培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基中肝細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)。這說明，本發(fā)明培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基可以明顯促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，本發(fā)明培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基的擴(kuò)增效果好。

表2：不同培養(yǎng)基的細(xì)胞活率

由表2可以看出，在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，生長在本發(fā)明實(shí)施例1-3所得培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基中肝細(xì)胞的細(xì)胞活率，明顯高于生長在對(duì)比例1和對(duì)比例2所得培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)基中肝細(xì)胞的細(xì)胞活率。