本發(fā)明屬于中藥血清藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及含左歸丸血清代謝物質(zhì)組有效成分的左歸丸血清及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

以中藥口服給藥后血清為樣品，按傳統(tǒng)藥物化學(xué)相同的研究方法，多種現(xiàn)代技術(shù)綜合應(yīng)用，從血清中分離、鑒定移行成分，研究血清中移行成分與傳統(tǒng)療效的相關(guān)性，闡明體內(nèi)直接作用物質(zhì)代謝及體內(nèi)動態(tài)的方法稱之為中藥血清藥物化學(xué)，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究、復(fù)方配伍機理的闡明、中藥有效成分的確定以及中藥給藥方案的科學(xué)化等方面具有重要的研究意義。

目前，中藥血清藥物化學(xué)在單味中藥方面的研究涉及茵陳蒿、當(dāng)歸、大黃、大青葉、補骨脂和東北紅豆杉等，在中藥復(fù)方方面的研究涉及六味地黃丸、黃連解毒湯、復(fù)方茵陳蒿湯、歸苓片、銀翹散和復(fù)方安替威膠囊等。

中藥左歸丸出自《景岳全書》卷五十一新方八陣方，是由熟地黃、菟絲子、牛膝、龜甲膠、鹿角膠、山藥、山茱萸、枸杞子八味中藥組成的復(fù)方，具有滋陰補腎的作用，用于真陰不足、腰酸膝軟、盜汗遺精、神?？谠铩Ｄ壳?，左歸丸的研究大多是質(zhì)量評估、基因表達、骨髓間質(zhì)細胞、卵巢細胞及左歸丸復(fù)方等方面的研究。左歸丸血清對體外分離、培養(yǎng)的成骨細胞分泌骨鈣素有顯著影響，對成骨細胞的骨形成有促進作用，對破骨細胞有直接的抑制作用，且可通過成骨細胞間接對破骨細胞產(chǎn)生抑制作用，是其防治骨質(zhì)疏松癥的機制之一。左歸丸血清能夠促使骨髓間充質(zhì)干細胞骨向分化中堿性磷酸酶表達。而堿性磷酸酶是成骨細胞的一種細胞表面標(biāo)志性酶，隨著成骨分化程度的增加，堿性磷酸酶表達增強。左歸丸血清也可明顯提高骨髓間質(zhì)細胞向肝細胞的轉(zhuǎn)化率，對骨髓細胞向肝細胞的分化具有促進作用。說明左歸丸血清代謝物質(zhì)組具有多靶點作用的特點。然而，含左歸丸血清代謝物質(zhì)組有效成分的左歸丸血清未有報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供含左歸丸血清代謝物質(zhì)組有效成分的左歸丸血清及其制備方法與應(yīng)用，該左歸丸血清中高度富集了苷類有效成分，可明顯提高高糖干預(yù)下受抑制的胚胎發(fā)育率，促進胚胎發(fā)育。

本發(fā)明提供的一種左歸丸血清的制備方法，包括如下步驟：(1)將制備左歸丸的藥材按照制備左歸丸的配方用量混合后進行水提，得水提液；(2)對動物給藥所述水提液，給藥結(jié)束后進行采血，將血液離心后收集血清，即可得到所述左歸丸血清；所述給藥步驟中，給藥量為10～20g·kg^-1·d^-1，連續(xù)給藥7～10天，每天1～2次。

本發(fā)明提供的一種左歸丸血清的制備方法，包括如下步驟：取離體血液，將離體血液離心后收集血清，即可得到所述左歸丸血清；所述離體血液為如下動物的離體血液：(1)將制備左歸丸的藥材按照制備左歸丸的配方用量混合后進行水提，得水提液；(2)對動物給藥所述水提液，給藥結(jié)束后，即得所述動物；所述給藥步驟中，給藥量為10～20g·kg^-1·d^-1，連續(xù)給藥7～10天，每天1～2次。

上述的制備方法中，步驟(1)中，所述藥材為制備左歸丸的常規(guī)藥材，具體為熟地、山藥(炒)、枸杞、山茱萸、川牛膝、鹿角膠、龜板膠和菟絲子，所述配方用量為制備左歸丸的常規(guī)配方用量，具體為：熟地(240g)、山藥(炒)(120g)、枸杞(120g)、山茱萸(120g)、川牛膝(90g)、鹿角膠(120g)，龜板膠(120g)、菟絲子(120g)。

上述的制備方法，步驟(1)中，所述水提液中的生藥量可為(0.5～1)g·mL^-1，具體可為1g·mL^-1。

上述的制備方法，步驟(1)中，所述水提的步驟可如下：將水加熱至提取溫度(如50℃)后，放入除鹿角膠和龜板膠外的藥材進行煎煮，得水提液Ⅰ；取龜板膠、鹿角膠加入水加熱使其溶解，待全部溶解后與所述水提液Ⅰ混合，得水提液Ⅱ；濃縮所述水提液Ⅱ，即可得到所述水提液。

上述的制備方法，步驟(1)中，所述水提步驟中，提取溫度可為50℃～沸點溫度，具體可為50℃；提取時間(每次提取的時間)可為1.0～1.5h，具體可為1.5h；水的用量(每次提取時水的用量)可為1g藥材：(8～10)mL水，具體可為1g藥材：10mL水；水提次數(shù)可為2～3次，具體可為3次。具體步驟如下：取8倍量水加熱至50℃，放入除鹿角膠和龜板膠外的藥材加熱煎煮1.5h；第二次取8倍量水煎煮1.5h；第三次取8倍水煎煮1.5h；分別用八層紗布過濾，合并三次浸出液，得水提液Ⅰ。

上述的制備方法，步驟(2)中，所述動物可為雌雄大鼠。

上述的制備方法，步驟(2)中，所述給藥量具體可為20g·kg^-1·d^-1；給藥時間具體可為連續(xù)給藥7天，每天1次。

上述的制備方法，步驟(2)中，所述給藥步驟中，給藥方式可為灌胃。

上述的制備方法，所述采血步驟中，在倒數(shù)第二次給藥完成后禁食12h，最后一次給藥后開始計時，采血的時間控制在最后一次給藥后的30～40min內(nèi)，具體可控制在最后一次采血的30min內(nèi)。采血方式可為眼眶毛細管采血或腹主動脈采血。

所述離體血液為如下動物的離體血液：在倒數(shù)第二次給藥完成后禁食12h，且為最后一次給藥后的30～40min內(nèi)的動物，具體可控制在最后一次采血的30min內(nèi)。

上述的制備方法，所述離心步驟中，離心轉(zhuǎn)速可為3000～4000r·min^-1，具體可為4000r·min^-1，離心時間可為15～20min，具體可為15min。

本發(fā)明進一步提供了一種由上述的制備方法制備得到的左歸丸血清，該左歸丸血清中高度富集了苷類有效成分，如環(huán)烯醚萜苷活性成分。

本發(fā)明還提供了上述左歸丸血清在制備具有如下1)-2)中任一項功能的藥物中的應(yīng)用：

1)提高高糖干預(yù)下受抑制的胚胎發(fā)育率；

2)促進胚胎發(fā)育中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有如下有益效果：

1.水加熱至50℃，再放入除鹿角膠和龜板膠外的藥材加熱煎煮，提高了水提液中的苷類有效成分的含量；

2.實驗動物給藥量達10～20g·kg^-1·d^-1，高于實驗動物的給藥劑量，提高了左歸丸血清代謝物質(zhì)組有效成分的含量，實現(xiàn)了苷類有效成分的高度富集；

3.由本方法制得的左歸丸血清代謝物質(zhì)組，可明顯提高高糖干預(yù)下受抑制的胚胎發(fā)育率，促進胚胎發(fā)育。

附圖說明

圖1為UPLC-Q-TOF/MS檢測的本發(fā)明左歸丸血清及空白血清的BPI圖，其中，圖1(A)為本發(fā)明左歸丸血清樣品；圖1(B)為空白血清樣品。

圖2為基于UPLC-Q-TOF/HDMS檢測的化學(xué)成分進行的多變量數(shù)據(jù)分析圖，其中，圖2(A)為給藥組(Group 1)與空白對照組(Group 2)血清UPLC-Q/TOP-MS數(shù)據(jù)經(jīng)OPLS-DA分析的得分圖；圖2(B)為OPLS-DA分析的S-Plot圖；圖2(C)為保留時間_質(zhì)核比為8.31-183.0978離子的變化趨勢圖。

圖3光鏡下4.5dpc時期正常囊胚和高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的囊胚圖，(注圖中：A.空白組；B.20mmol/L葡萄糖組；C.40mmol/L葡萄糖組；D.60mmol/L葡萄糖組；E.80mmol/L葡萄糖組)。

圖4光鏡下1.5dpc時期正常2-細胞和高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的2-細胞圖，(注圖中：A.空白組；B.20mmol/L葡萄糖組；C.40mmol/L葡萄糖組；D.60mmol/L葡萄糖組；E.80mmol/L葡萄糖組)。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

左歸丸藥材購于北京同仁堂山西連鎖藥店有限公司責(zé)任公司，熟地(河南，240g)、山藥炒(河南，120g)、枸杞(寧夏，120g)、山茱萸(浙江，120g)、川牛膝酒洗蒸熟(四川，90g)、鹿角膠(120g)，龜板膠(120g)、菟絲子(內(nèi)蒙古，120g)。

雌性SD大鼠購于中國食品藥品檢定研究院，許可證號：SCXK(京)2009-0017。

實施例1、左歸丸血清樣品的制備及成分分析

一、左歸丸血清樣品的制備

按照如下步驟制備左歸丸血清樣品：

1、左歸丸水提液的制備

按照熟地：山藥：山萸肉：枸杞子：菟絲子：鹿角膠：龜板膠：川牛膝＝8：4：4：4：4：4：4：3的質(zhì)量比稱取各藥材。除鹿角膠和龜板膠外，將各藥材混合加入水在50℃下煎煮三次，其中，第一次煎煮為取8倍量(w/v)水煎煮1.5h，第二次煎煮為取8倍量(w/v)水煎煮1.5h，第三次煎煮為取8倍水量(w/v)煎煮1.5h，合并三次浸出液過八層紗布過濾。取龜板膠、鹿角膠至燒杯中加入適量水加熱使溶解，待膠類全部溶解后置于煎煮好的藥液中，將左歸丸水煎液放入水浴鍋中濃縮至生藥量為1g·mL^-1。

2、左歸丸血清樣品的制備

將大鼠正常飼養(yǎng)5d，分為左歸丸給藥組和空白組。次日稱重并根據(jù)體重按生藥材量20g·kg^-1·d^-1給藥量分別給予給藥組左歸丸水提液，空白組蒸餾水，連續(xù)給藥7d，每天1次，每日給藥前稱重，嚴(yán)格控制給藥量，給藥方式為灌胃。6d灌胃完成后開始禁食12h，第7天灌胃后開始計時，30min內(nèi)進行采血，采血方式為腹主動脈采血。將血液在-4℃放置30min，4000r·min^-1離心15min，收集血清存放于-75℃超低溫冰箱待用，即可得到左歸丸血清樣品。

二、左歸丸血清樣品成分分析

1、樣品預(yù)處理

取左歸丸血清樣品2mL，加入磷酸40μL，震蕩混勻，上樣到預(yù)先以3mL甲醇、3mL水活化平衡好的SPE柱上，分別用2mL水淋洗，淋洗液棄去，再以2mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于37℃水浴下氮氣流吹干，殘渣用100μL 50％甲醇復(fù)溶，超聲1min，混懸震蕩30s后，4℃，13000rpm離心10min，取上清液用于UPLC-Q-TOF/MS分析。

2、UPLC-Q-TOF/MS分析

Waters Acquity^TM UPLC液相色譜儀(Waters公司，美國)；Waters Synapt^TMHighDefinition MS(HDMS/MS)System質(zhì)譜儀(Waters公司，美國)；SPE固相萃取柱WatersOasis HLB 3cc 60mg(Waters公司，美國)。

2.1色譜條件

色譜柱：ACQUTITY UPLC^TM HSS T₃column(100mm×2.1mm i.d.，1.8μm，WatersCorp，Milford，USA)；流速0.4mL/min；柱溫40℃；流動相：A：0.1％甲酸乙腈，B：0.1％甲酸水，洗脫程序見表1，進樣量均5μL。

表1左歸丸入血成分分析超高效液相色譜洗脫梯度

表1中，A：0.1％甲酸乙腈；B：0.1％甲酸水

2.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，掃描參數(shù)：正離子模式：毛細管電壓3.0kV，錐孔電壓30V，提取電壓3.5V，離子源溫度110℃，脫溶劑氣溫度350℃，錐孔氣流量為50L/h，脫溶劑氣流量600L/h。準(zhǔn)確質(zhì)量測定采用亮氨酸-腦啡肽(leucine-enkephalin，[M+H]⁺＝556.2771)溶液為鎖定質(zhì)量溶液；負離子模式：毛細管電壓2.6kV，錐孔電壓30V，提取電壓3.5V，離子源溫度110℃，脫溶劑氣溫度350℃，錐孔氣流量為50L/h，脫溶劑氣流量600L/h。準(zhǔn)確質(zhì)量測定采用亮氨酸-腦啡肽(leucine-enkephalin，[M-H]^-＝554.2615)溶液為鎖定質(zhì)量溶液，質(zhì)量掃描范圍：m/z 100-1000Da。

2.3指紋圖譜的采集及峰的提取

采集左歸丸血清樣品及空白對照血清在正負離子模式下UPLC-Q/TOF-MS色譜圖，見圖1。同時采集給藥樣品及其組方藥物的UPLC-Q-TOF/MS色譜圖，用于對血中移行成分進行來源歸屬和為結(jié)構(gòu)鑒定提供物質(zhì)基礎(chǔ)的信息。

采用MarkerLynx V4.1軟件(Waters公司，美國)對空白血清和左歸丸血清樣品的UPLC-Q/TOF-MS數(shù)據(jù)進行峰的提取。參數(shù)如下：檢測時間0.1-18.0min，質(zhì)量范圍100-1000Da，保留時間差異范圍0.2min，質(zhì)量數(shù)差異范圍0.05Da，噪音消除水平6，峰強度閾值100。提取的數(shù)據(jù)為包括了保留時間t_R，離子質(zhì)核比m/z及峰強度的三維數(shù)據(jù)矩陣，進一步應(yīng)用EZinfo 2.0插件來進行主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。OPLS-DA得到S-plot，在“S”圖形中，上端及下端分別代表在空白及給藥組的高表達水平的離子。同時根據(jù)各離子相應(yīng)的趨勢圖(trend plot)，由此篩選空白組為零，而給藥組非零的離子作為左歸丸的入血成分離子。

應(yīng)用OPLS-DA多變量模式識別的方法比較給藥組及空白組，以尋找給藥組的入血成分。在OPLS-DA得分圖中，見圖2(A)，可見空白組及給藥組明顯的區(qū)分為兩組，提示給予左歸丸后，大鼠血中成分發(fā)生了明顯的改變。為了尋找其差異成分，在S-plot圖，如圖2(B)所示，通過trend plot尋找空白組含量為零，給藥組含量非零的離子，如圖2(C)例舉了t_R-m/z為8.31-183.0978離子的trend plot，該離子僅存在于給藥組的血清中，由此可知該離子為左歸丸的入血成分。

對經(jīng)OPLS-DA分析挖掘的左歸丸入血成分離子的精確質(zhì)量進行元素組成分析，計算可能的分子式，并與左歸丸及其組方藥物的化學(xué)信息進行比對，初步鑒定結(jié)果見表2。

表2左歸丸給予雌性大鼠后含藥血清經(jīng)UPLC-Q/TOF-MS分析在負離子模式檢測到的入血成分信息

在負離子模式下共檢測了27個入血成分，包括12個原型成分和15個代謝物。在負離子模式下，對13個入血成分進行了鑒定，其中有來源于山茱萸的獐芽菜苷、馬錢苷、莫諾苷、馬錢苷酸、表馬錢苷酸，來源于熟地的5-羥甲基-2-糠醛葡萄糖醛酸苷、二氫5-羥甲基-2-糠醛葡萄糖醛酸苷、地黃苦苷元，來源于枸杞子的香豆酸，來源于菟絲子的山奈酚葡萄糖醛酸苷，cuscutamine。本發(fā)明左歸丸血清主要富集了環(huán)烯醚萜苷活性成分，是其重要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

實施例2、本發(fā)明左歸丸血清對小鼠胚胎體外發(fā)育的影響

一、左歸丸血清樣品的制備

按照實施例1相同的步驟制備左歸丸血清樣品。

二、實驗所用試劑與儀器

所有化學(xué)藥品均購自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)。PMSG和HCG購于寧波市激素制品有限公司，透明質(zhì)酸酶，操作液，KSOM培養(yǎng)液，DAPI染色液，超凈工作臺(Nu-301-330E英國NUVNR公司)，體視顯微鏡(261日本Olympus公司)，熒光顯微鏡(BX60日本Olympus公司)，CO₂培養(yǎng)箱(3110美國Forma公司)。

三、實驗內(nèi)容與方法

1、受精卵的收集和體外培養(yǎng)

腹腔注射PMSG 7.5IU/只，48h后注射HCG 7.5IU/只進行超數(shù)排卵，并與性成熟同系公鼠交配，次日晨(12h后)檢查陰道栓。有栓雌鼠于注射HCG 18h引頸處死，摘除輸卵管壺腹部置于盛有胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿蓋中，顯微鏡下用注射器針頭將輸卵管透明膨大處撕破，將游離出來的合子團在透明質(zhì)酸酶中脫除顆粒細胞，盡快用操作液清洗后在培養(yǎng)液洗盤中用培養(yǎng)液洗去操作液。分別放入正常培養(yǎng)液和含有高濃度葡萄糖的培養(yǎng)液滴中，于37℃，5％CO₂飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。合籠30h后統(tǒng)計2細胞數(shù)，102h后統(tǒng)計囊胚數(shù)。

2、實驗內(nèi)容

實驗一：將葡萄糖濃度從20mmol/L(標(biāo)準(zhǔn)KSOM培養(yǎng)液含量)逐漸上調(diào)到80mmol/L，分成5組：正常組，20mmol/L葡萄糖組，40mmol/L葡萄糖組，60mmol/L葡萄糖組，80mmol/L葡萄糖組。將一次實驗收集的所有1-細胞胚胎用移卵針隨機分入這5組。觀察不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液對小鼠胚胎早期發(fā)育的影響。實驗二：基于實驗一，通過篩選，取40mmol/L葡萄糖作為高糖抑制胚胎發(fā)育模型。將一次實驗收集的所有1-細胞胚胎用移卵針隨機分入4組：正常組，高糖組(40mmol/L葡萄糖)，左歸丸血清組(40mmol/L葡萄糖加5％左歸丸血清)。觀察左歸丸血清對小鼠胚胎早期發(fā)育的影響。

3、胚胎質(zhì)量評價

倒置顯微鏡體外動態(tài)觀測小鼠胚胎早期發(fā)育情況，進行形態(tài)學(xué)觀察，用囊胚率、觀察葡萄糖、左歸丸含藥血清對小鼠胚胎體外發(fā)育的影響。

4、統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析用SAS8.2軟件，計量資料組間比較用t檢驗，實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，以p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

三、實驗結(jié)果

1、胚胎囊胚形態(tài)學(xué)觀察

圖3所示，為光鏡下4.5dpc時期正常囊胚和高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的囊胚圖。正常培養(yǎng)液中囊胚率在70％以上，20mmol/L葡萄糖組與空白組相似，在形態(tài)上無明顯區(qū)別；60mmol/L葡萄糖組的囊胚率顯著下降(p<0.01)且囊胚腔較?。?0mmol/L葡萄糖組幾乎未見囊胚，胚胎從2-細胞到4-細胞不等，大多數(shù)胚胎永遠停留在了2-細胞時期。

2、胚胎2-細胞形態(tài)學(xué)觀察

圖4為光鏡下1.5dpc時期正常2-細胞和高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的2-細胞圖。40倍光鏡下無法區(qū)別各組2-細胞的形態(tài)，100倍數(shù)下發(fā)現(xiàn)80mmol/L組的2-細胞形態(tài)有些許改變，2-細胞率無統(tǒng)計學(xué)差異。

3、左歸丸血清組對40mmol/L高糖負荷下小鼠胚胎發(fā)育的影響如表3所示。

表3左歸丸血清代謝物質(zhì)組對40mmol/L葡萄糖負荷下小鼠胚胎發(fā)育率的影響

與空白組相比，#p<0.05，##p<0.01。

本研究選用40mmol/L作為葡萄糖抑制濃度，從囊胚率來看，左歸丸血清組能有效地促進胚胎發(fā)育，從而顯示本發(fā)明左歸丸血清能提高胚胎質(zhì)量，激發(fā)胚胎發(fā)育潛能。