本發(fā)明涉及再生醫(yī)學(xué)與細胞治療技術(shù)領(lǐng)域中的脂肪干細胞的培養(yǎng)，

技術(shù)實現(xiàn)要素：
是一種增強脂肪干細胞增殖與移植后存活能力的方法

背景技術(shù)：

脂肪干細胞(adipose derived stem cells,ADSC)是由中胚層發(fā)育而來的多能干細胞，是一種脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，能夠被誘導(dǎo)分化為多種細胞，包括同樣中胚層來源的成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞。還可以跨胚層分化為內(nèi)胚層來源的肝細胞、胰島β樣細胞，外胚層來源的神經(jīng)細胞、心肌細胞、表皮細胞等。與其他間充質(zhì)干細胞相比，脂肪干細胞來源豐富、取材簡便、便于培養(yǎng)，是優(yōu)秀的組織工程與細胞治療的種子細胞(Park Andrew,et al.2010,Vivek D.Desai,et al.2014,Du Y,et al.2010)。

2001年，Zuc等最先從脂肪組織中分離出間充質(zhì)干細胞(P.A.Zuk,et al.2001)。脂肪干細胞與其它來源的間充質(zhì)干細胞具有相同的特征，包括形態(tài)學(xué)特征，免疫表型，細胞周期和多向分化能力及支持造血功能(Shuyun Liu,et al.2012,L.L.Lu,et al.2006,Jiang Peng,et al.2011)。脂肪干細胞通過分泌多種細胞因子和成血管介質(zhì)以修復(fù)受損組織(Hsiao Sarah Tzu-Feng,et al.2012)。一系列的研究表明脂肪干細胞在皮膚修復(fù)、骨損傷、肝硬化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及自身免疫性疾病等的治療和整形與皮膚美容中具有廣泛的應(yīng)用前景(Agnieszka Banas,et al.2009,J.L.Dragoo,et al.2007,Lu Feng,et al.2008,Park In Su,et al.2014,W.S.Kim,et al.2008,Won-Serk Kim,et al.2009,Hyun Jung Lee,et al.2012,H Mizuno 2009,Kristine M Safford and Henry E Rice2005,G.Taylor,.,et al.2000,Wang Y-L,et al.2013)。但是，臨床應(yīng)用中需要的干細胞數(shù)量巨大，且對干細胞移植后的融合率及細胞功能的保持要求頗高。動物實驗表明間充質(zhì)干細胞在移植環(huán)境中不容易成活，移植的細胞不能很好地融入宿主組織，或者在成功融合后一個月內(nèi)消失(Tamama Kenichi,et al.2010,Mark F Pittenger and Bradley J Martin 2004,Freyman Toby,et al.2006)，這可能是由局部貧血和微環(huán)境的缺失導(dǎo)致的細胞活力降低或者移植部位的局部炎癥引起的(Song Heesang,et al.2010)。因此，如何建立穩(wěn)定高效的擴增體系，保持干細胞的生理特性使其移植后修復(fù)功能的發(fā)揮得到保障是臨床用干細胞培養(yǎng)中亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種提高增強脂肪干細胞增殖與移植后存活能力的方法。

本發(fā)明通過在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的生長因子增加了細胞外基質(zhì)的表達從而加快了脂肪干細胞的增殖并增強了其移植后的存活能力。

細胞外基質(zhì)(ECM)是圍繞細胞的復(fù)雜的蛋白網(wǎng)絡(luò)，在建立干細胞微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，其成分和機械性可以影響干細胞的形態(tài)和分化(Singh Purva and Jean E Schwarzbauer 2012)。ECM中的一大種類-纖連蛋白(FN)與其他ECM成分都具有結(jié)合位點，可以使細胞與ECM網(wǎng)絡(luò)相連接，從而幫助MSC存活和擴增(Ma Schwartz and Rk Assoian 2001,A D Whetton and G J Graham 1999)，另外，MSC的趨化性和歸巢也都與細胞外基質(zhì)有關(guān)。已有研究表明三種ECM蛋白成分：纖連蛋白(FN)，玻連蛋白和膠原蛋白Ⅰ(COL-Ⅰ),可以激活MSC的有絲分裂(Marc M Thibault,et al.2007)。ECM還可以激活MSC向神經(jīng)元的分化并使其更適于充當神經(jīng)再生支架(D P Basile,et al.1999,J.H.Lee,et al.2011)。

轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)在多種細胞中都可以通過smad信號通路激活ECM的合成，如腎細胞，血管平滑肌細胞和II型肺上皮細胞(H.A.Baarsma,et al.2011,Y C Lee and D E Rannels 1998,Cj O'Callaghan and B Williams 2000)。在MSC中，TGF-β1可以激活β-catenin介導(dǎo)的smad3依賴的核轉(zhuǎn)運從而促進細胞增殖(Ng Felicia,et al.2008,Jian Hongyan,et al.2006)。已有研究證明TGF-β1還可以誘導(dǎo)血管平滑肌細胞樣離子通道的表達和脂肪干細胞分化為血管平滑肌細胞(Park Won Sun,et al.2013)。

本發(fā)明在脂肪干細胞培養(yǎng)中加入特定濃度的TGF-β1，TGF-β1與TGF-βII型受體(TGF-βRII)結(jié)合后，再激活募集TGF-βI型受體(TGF-βRI)組合后形成二聚體形式的受體復(fù)合物。TGF-βRII磷酸化TGF-βRI的甘氨酸-絲氨酸富集區(qū)域(GS序列)并活化TGF-βRI的絲氨酸/蘇氨酸活性?；罨腡GF-βRI磷酸化受體相關(guān)smad2、smad3蛋白,然后smad2/smad3形成復(fù)合物并進一步結(jié)合smad4,形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)運入細胞核，Smad3和Smad4結(jié)合于稱為SBE的DNA序列，而Smad2通過與Smad4的相互作用與DNA復(fù)合物反應(yīng)，進而激活ECM合成基因的表達。

首先將TGF-β1溶解在含0.1％BSA的干細胞培養(yǎng)基中，配制濃度為100ng/ml。取傳代2-5代的脂肪干細胞，以含有間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)因子(FGF、EGF、VEGF、PDGF，各2ng/ml)，10％胎牛血清，100U/mL青鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24-48小時至細胞80％匯合。傳代后24h向培養(yǎng)基中添加TGF-β1。培養(yǎng)同批次脂肪干細胞不加TGF-β1作為對照組。培養(yǎng)24小時后，棄培養(yǎng)基，收獲脂肪干細胞進行細胞增殖與ECM蛋白表達的檢驗。

本發(fā)明操作簡單、方便實用，處理后的脂肪干細胞增殖加快，ECM蛋白表達增多，移植后存活率提高，并且細胞形態(tài)，免疫表型及多向分化能力不受影響。因此，本發(fā)明建立了穩(wěn)定的增強脂肪干細胞增殖能力與治療能力的培養(yǎng)技術(shù)體系，為脂肪干細胞的臨床應(yīng)用提供了更好的種子細胞來源。

附圖說明

圖1.不同劑量TGF-β1對脂肪干細胞增殖的影響

圖2.脂肪干細胞的免疫表型

圖3.TGF-β1對脂肪干細胞免疫表型的影響

圖4.TGF-β1對脂肪干細胞成骨分化與成脂分化能力的影響

(A)向成骨細胞分化茜素紅染色(B)堿性磷酸酶染色

(C)成脂誘導(dǎo)7天細胞形態(tài)(D)油紅-O染色

圖5.熒光實時定量PCR檢測TGF-β1對脂肪干細胞ECM相關(guān)基因表達的影響

圖6.細胞免疫熒光染色檢測TGF-β1對脂肪干細胞ECM相關(guān)蛋白表達的影響

圖7.Western-blot檢測TGF-β1對脂肪干細胞ECM調(diào)控通路的激活

圖8.TGF-β1調(diào)控脂肪干細胞增殖與存活相關(guān)信號通路示意圖

圖9.TGF-β1對脂肪干細胞移植入肺損傷小鼠中后存活時間的影響

具體實施方式

以下為本發(fā)明的具體實施方式,其實施方式為:

實施例1：脂肪干細胞的提取

1.固體脂肪

(1)將人脂肪組織用含雙抗生理鹽水反復(fù)沖洗脂肪2-3遍，再用無菌生理鹽水沖洗3-4遍。

(2)將沖洗過的脂肪置于無菌的平皿中，觀察是否存在腐壞變質(zhì)、脂肪顏色是否存在異常等情況，并及時記錄。

(3)用無菌剪刀將脂肪剪至2×2×2mm的小粒，將剪碎的脂肪小塊生理鹽水洗滌3遍，洗滌時用100微米濾網(wǎng)過濾，盡量洗滌并棄去紅細胞組分；

(4)取剪碎的組織塊以體積比1:5(1:3)的比例加入0.3％的Ⅰ型膠原酶/PBS消化液中，例如20mL脂肪加入100mL的消化液；

(5)將此管置于37℃恒溫氣浴旋轉(zhuǎn)振蕩箱中，以180rpm恒溫振蕩30min；

(6)將消化產(chǎn)物上端的油脂首先吸棄，然后將消化產(chǎn)物通過100微米濾網(wǎng)過濾到一個新的50mL離心管中，以1500rpm離心10min，棄上清；

(7)將細胞沉淀以PBS液重懸，以1500rpm離心10min再洗滌一次，棄上清；

(8)對細胞進行計數(shù)后，以3×10⁶個細胞/mL的密度，加入脂肪間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基并吹懸3-6次，置于通氣蓋培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入37℃5％CO2培養(yǎng)箱中；

(9)培養(yǎng)最初3-4d，保持培養(yǎng)瓶物理靜止。第4天后觀察細胞貼壁情況，吸掉培養(yǎng)液，用37℃，無菌PBS沖洗三遍，后加入培養(yǎng)基，以后按照細胞培養(yǎng)標準操作規(guī)程中的換液操作，2-3天換液一次。待細胞生長至80％匯合時，按脂肪間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)標準操作規(guī)程中傳代程序進行細胞傳代。

2.液體脂肪：

(1)取常規(guī)吸脂后靜置的上層脂肪，加入等量含慶大霉素、兩性霉素B生理鹽水，混勻后離心800g，5分鐘；

(2)離心結(jié)束后，將下層液體和沉淀的血細胞吸走棄掉，保留上層的脂肪組織；

(3)保留的脂肪組織中以體積比1:5的比例加入0.1％的Ⅰ型膠原酶/PBS消化液中，例如20mL脂肪加入100mL的消化液；

(4)以下步驟同固體脂肪提取方法。

實施例2：TGF-β1促進脂肪干細胞的增殖

取傳代3代的脂肪干細胞傳代，以6,000細胞/cm²的密度接種于24孔板，24h后加入不同濃度的TGF-β1，使其終濃度分別為0.1,0.5,1,5,10和20ng/mL，每組3個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24h，48h與72h后收集細胞，使用CCK-8細胞毒性檢測試劑盒對各實驗組進行檢測，結(jié)果表明0.1ng/ml是促進脂肪干細胞增殖的最適濃度。

實施例3：TGF-β1不影響脂肪干細胞的免疫表型

收集對照與TGF-β1處理的脂肪干細胞，分別使用抗人CD45,CD31,CD34,CD29,CD44,CD73,CD90和CD105的抗體進行標記，使用流式細胞儀檢測分析，結(jié)果表明所獲脂肪干細胞與其他來源的間充質(zhì)干細胞一樣，表達CD29,CD44,CD73,CD90和CD105；不表達CD31,CD34和CD45。且加入TGF-β1后，各分子表達量沒有明顯變化。

實施例4：TGF-β1不影響脂肪干細胞的成骨與成脂分化能力

成骨分化：取TGF-β1預(yù)處理的脂肪干細胞接種于24孔板，使用成骨分化培養(yǎng)基：L-DMEM含10％胎牛血清，0.1μM地塞米松，50mMβ-磷酸甘油和0.2mM維生素C。培養(yǎng)14天后使用4％多聚甲醛固定，分別使用堿性磷酸酶與茜素紅染色。

成脂分化：分化培養(yǎng)基成分為高糖DMEM，含10％胎牛血清，0.25mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，0.1μM地塞米松，0.1mM吲哚美辛，6.25μg/ml胰島素。培養(yǎng)7天后觀察可見細胞鋪展變大，14天后使用油紅O染色，可見胞質(zhì)內(nèi)脂滴。

結(jié)果表明TGF-β1并不影響脂肪干細胞向成骨細胞與脂肪細胞分化的能力。

實施例5：TGF-β1增強ECM相關(guān)基因的表達

取傳代3代的脂肪干細胞，傳代接種于6孔板，24h后加入不同濃度的TGF-β1，使其終濃度分別為0.1,1,10ng/mL，培養(yǎng)24h后收集細胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后使用熒光實時定量PCR對ECM相關(guān)基因進行檢測，GAPDH作為內(nèi)參。結(jié)果表明0.1ng/mL濃度的TGF-β1促進了ECM相關(guān)基因Col-I，Col-IV，F(xiàn)N，integrin和tenascin-C的表達。

實施例6：TGF-β1增強ECM相關(guān)蛋白的表達

取傳代3代的脂肪干細胞，以3×10⁵/孔的密度接種于6孔板，24h后實驗組細胞使用0.1ng/mL濃度的TGF-β1進行處理，24h后使用4％多聚甲醛固定，0.3％過氧化氫處理30分鐘去除內(nèi)源性過氧化物酶。使用相應(yīng)抗體37℃孵育1h，DAB法顯色并使用蘇木精復(fù)染。

結(jié)果顯示TGF-β1并未改變脂肪干細胞形態(tài)，并且增強了ECM蛋白Col-I和Col-IV特別是FN的表達，但是integrin的表達并未受到影響。

實施例7：TGF-β1激活了脂肪干細胞中的TGF-β-smad信號通路

取傳代3代的脂肪干細胞，以3×10⁵/孔的密度接種于6孔板，24h后實驗組細胞使用0.1ng/mL濃度的TGF-β1進行處理，24h后收集細胞提取蛋白，使用Western blot的方法對ECM合成調(diào)控相關(guān)的TGF-β-smad信號通路的下游蛋白RhoA，smad3及其磷酸化水平進行檢測。

結(jié)果顯示TGF-β1激活了smad3但不影響其本身的表達，且增加了RhoA的表達，從而激活了其下游ECM蛋白合成相關(guān)基因的表達。

實施例8：TGF-β1增加了脂肪干細胞在動物體內(nèi)的存活時間

急性肺損傷小鼠模型的建立：BALB/c小鼠購自山東大學(xué)實驗動物中心，6-8周齡，雌性，體重20-25g，共36只。飼養(yǎng)于IVC屏障系統(tǒng)中，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，12h/12h黑白交替。隨機分為4組，分別命名為對照、ALI/PBS、ALI/MSC和ALI/MSC-T組。對除對照外剩余3組小鼠按照10mg/kg的體重比，腹腔注射脂多糖；對照組注射生理鹽水。

1h后進行后續(xù)操作，對對照及ALI/PBS組小鼠尾靜脈注射PBS 300μl，對ALI/MSC尾靜脈注射含5×10⁵個脂肪干細胞的PBS 300μl，對ALI/MSC-T組小鼠尾靜脈注射含5×10⁵個TGF-β1預(yù)處理脂肪干細胞的PBS 300μl。

在注射后第1，7，14天分別處死每組中的3只小鼠以檢測脂肪干細胞的存活。在每10mg雌性小鼠肺組織中分別添加100,50,25,10,5,1和0×10³個脂肪干細胞的DNA，通過對雄性性別決定基因Sry進行熒光實時定量PCR檢測畫出標準曲線。同時對各組小鼠肺組織中的Sry基因進行檢測，與標準曲線比照后得出各組小鼠在各時間點肺中的脂肪干細胞存活數(shù)量。

結(jié)果表明，TGF-β1延長了脂肪干細胞移植后的存活時間。