專利名稱：提高脂肪移植物存活率的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明，在其一些實施例中，涉及脂肪組織，更具體地，但不局限于，涉及促進其植入的方法。
背景技術(shù)：
在血管生成中，血管內(nèi)皮細胞將其表型變?yōu)檠苌杀硇?，產(chǎn)生蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，并可進行遷移和增殖。該過程依賴多種生長因子的活性，例如，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，堿性成纖維生長因子(bFGF)和血小板衍生生長因子(PDGF) -BB0促紅細胞生成素(EPO)是一種刺激紅細胞生成的糖蛋白激酶，其已被報道具有血管生成活性。Ribatti等人論證了 EPO在培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞中可誘導(dǎo)產(chǎn)生促血管生成表型且刺激體內(nèi)血管生成[Ribatti 等，(2003) Eur J Clin Invest 33:891-896]。EPO 還可在 缺血組織中通過增加VEGF蛋白的表達或補充內(nèi)皮祖細胞，間接刺激血管生成[Nakano等，(2007)Circ ReslOO :662-669 ;Aicher 等，(2005)Hypertension 45:321-325]。在小鼠中，EPO還可動員骨髓的祖細胞[Hamed等，(2006)Eur Heart J 27:1876-83]以及增加VEGF的心肌表達[Westenbrink 等，(2007)Eur Heart J 28:2018-2027]。Wang 等人論證了 EPO 可通過促進神經(jīng)祖細胞分泌VEGF和促進腦血皮細胞中VEGF受體的表達促進血管生成[Wang等，(2008)J Cereb Blood Flow Metab 28:1361-8]?？傮w來說，這些結(jié)果表明EPO為間接作用的血管生成因子，其作用通過刺激血管生成因子的分泌而介導(dǎo)。EPO還被報道具有其他非造血作用，包括血管內(nèi)皮細胞的細胞保護作用[Chong等，(2003) Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord 3 141-154]和血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞中的抗凋亡作用[Somervaille等，(2001) Blood 98:1374-1381]。這些抗凋亡作用包括阻止線粒體釋放細胞色素C、抑制半胱氨酸蛋白酶的活性、上調(diào)蛋白激酶B(PKB)信號途徑活性和表達抗凋亡蛋白Bcl-xl。由于外傷和老化，自體脂肪移植是用于軟組織增添和填充軟組織缺損的普遍和理想的技術(shù)。最新證據(jù)表明由于其吸收和生存性，脂肪移植物的早期和足夠的血管化是必不可少的。然而，由于移植后脂肪細胞死亡增加，脂肪移植物的相對較高的再吸收率降低了該技術(shù)的效力[Nishimura 等，(2000) Laryngoscope 110:1333-1338]。雖然血管生成因子[Rophael 等，(2007) Am J Pathol 171 :2048-2057 ；Kuramochi 等，(2008) ) Eur J ClinInvest 38 :752-759]，以及 VEGF 基因治療[Lei 等，(2008) Chin J Traumatolll :49-53 ；Lu 等，(2009) Plast Reconstr Surg 124 :1437-1446 ;Yi 等，(2007) J Plast ReconstrAesthet Surg 60 =272-278]已被單獨用于在脂肪移植物中刺激血管生成，以提高脂肪細胞的存活率和生存能力，但是臨床結(jié)果卻令人失望[Henry等，(2003) Circulation 107 1359-1365]。因此，降低移植脂肪的再吸收率是臨床上的一個挑戰(zhàn)。已經(jīng)嘗試各種促進移植的方法，以下總結(jié)其中的一些。PCT公布NO. 2005/018549公開了用于組織修復(fù)(如骨、軟骨)的方法和組合物。根據(jù)其教導(dǎo)，組織移植物(如脂肪組織、肌肉組織)可離體與一種或更多種的生物活性劑(如促紅細胞生成素)接觸，從而刺激組織中的至少一部分細胞分化成所需類型的細胞(如骨細胞)，然后將該組織植入受試者中。美國專利NO. 7459152公開了通過給予促紅細胞生成素，提高移植物存活率。根據(jù)其教導(dǎo)，在遞送或給予受試者之前、期間或之后，借助促紅細胞生成素處理組織移植物的細胞(例如神經(jīng)或神經(jīng)旁來源的細胞，如腎上腺嗜鉻細胞)，以便治療神經(jīng)學(xué)疾病(如帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、脊髓損傷)。美國專利NO. 5，681，561公開了用于促進自體脂肪移植的方法和組合物。根據(jù)美國專利NO. 5，681，561的教導(dǎo)，自體脂肪細胞(如忙脂細胞(lipocytes))連同非甾體類合成代謝激素(如胰島素或三碘甲狀腺原氨酸/甲狀腺素或二者)一起注入患者體內(nèi)。自體脂肪細胞可進一步與生長激素[如上皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)] —起注入受試者中。另外，激素與營養(yǎng)培養(yǎng)基相結(jié)合。PCT公布NO. 2008/019434公開了利用試劑，增強脂肪形成并提高脂肪移植物的存活率。根據(jù)其教導(dǎo)，生長因子[如，血小板衍生生長因子(PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和/或成纖維細胞生長因子(FDF)]通過局部或持續(xù)給藥遞送至受試者，從而增強血管生成和脂肪形成并提高脂肪移植物存活率。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的一方面，提供了提高對其有需要的受試者中脂肪細胞存活率的方法，該方法包括(a)將脂肪細胞群植入受試者，然后(b)給予受試者促紅細胞生成素，從而提高受試者中的脂肪細胞存活率。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的一方面，提供了提高對其有需要的受試者中脂肪細胞存活率的方法，該方法包括(a)將脂肪細胞群與促紅細胞生成素接觸；然后(b)將該脂肪細胞群植入受試者，從而提高受試者中的脂肪細胞存活率。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的一方面，提供了促紅細胞生成素在制備用于治療軟組織缺陷的藥物中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的一方面，提供了促紅細胞生成素在提高脂肪細胞的存活率中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的一方面，提供了包含脂肪細胞群和促紅細胞生成素的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，該方法進一步包括在植入前，使脂肪細胞與促紅細胞生成素接觸。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在植入該脂肪細胞前，利用促紅細胞生成素對受試者進行處理。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，該方法進一步包括在植入后，給予受試者促紅細胞生成素。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在所述植入后，進行給藥。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在將促紅細胞生成素直接注入該脂肪細胞群后，進行給藥。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，促紅細胞生成素的劑量為約每注入每1，000，000個脂肪細胞為1-1000IU。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，通過全身途徑給予促紅細胞生成素。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，促紅細胞生成素的劑量為約每kg體重10-7500IU。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，至少需要進行兩次給藥。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，該方法包括將選自由胞外基質(zhì)組分、生長因子、激素、血管生成因子、凝結(jié)因子(凝血因子)、細胞因子、趨化因子、酶、神經(jīng)遞質(zhì)、維生素、碳水化合物、離子、鐵螯合劑、脂肪酸、抗生素和氨基酸組成的組中的至少一種因子給予受試者。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，軟組織缺陷選自由皮膚狀況、皮膚病、創(chuàng)傷、燒傷、癌癥、手術(shù)、整形手術(shù)(功能重建手術(shù))、皮膚凹陷、先天畸形和獲得性疾病組成的組。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，脂肪細胞包括自體細胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，脂肪細胞包括非自體細胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，該非自體細胞為同種異體細胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，該非自體細胞為異種細胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，該非自體細胞來自哺乳動物。 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在取出脂肪細胞之前，該哺乳動物利用促紅細胞生成素進行處理。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，藥物組合物包括選自由胞外基質(zhì)組分、生長因子、激素、血管生成因子、凝結(jié)因子、細胞因子、趨化因子、酶、神經(jīng)遞質(zhì)、維生素、碳水化合物、離子、鐵螯合劑、脂肪酸、抗生素和氨基酸組成的組中的至少一種因子。除非另外定義，否則本文使用的全部技術(shù)性和/或科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所述領(lǐng)域的每個普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。與本文描述的相似或相同的方法和材料可于本發(fā)明實施例的實踐或?qū)嶒炛?，而下面描述了示例性的方法?或材料。在沖突的情況下，以說明書，包括定義為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實施例僅是示例性的，且不應(yīng)理解為必要的限制。


這里參照附圖描述的本發(fā)明的一些實施例僅是示例性的?，F(xiàn)詳細參考附圖，應(yīng)該注意示出的細節(jié)僅是示例性的并其為了說明本發(fā)明實施例的目的。為此，參照附圖描述，使本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可顯見如何實施本發(fā)明實施例。在圖中圖IA-C示出15周研究期結(jié)束時，五張代表性的含脂肪移植物的小鼠的照片。圖IA示出頭皮上五個經(jīng)PBS處理的不同大小的小腫塊的脂肪移植物。圖IB示出頭皮上五個經(jīng)高劑量促紅細胞生成素(100IU ΕΡ0)處理的大小相同的腫塊的脂肪移植物。圖IC示出切割自移植15周后的小鼠的脂肪移植物。從左至右分別為來自PBS處理的脂肪移植物的代表性的小脂肪移植物，中等大小的用低劑量EPO處理的脂肪移植物，大的用高劑量EPO處理的脂肪移植物。比例尺10mm。圖2A-C示出脂肪移植15周后，從PBS處理、低劑量EPO和高劑量EPO處理的小鼠上切除的脂肪移植物的組織切片的照片。利用蘇木精和曙紅對切片進行染色，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察(i )通過移植的脂肪組織結(jié)構(gòu)中完整和有核的脂肪細胞的組織程度，觀察其整合程度；(ii)通過膠原蛋白和彈性纖維的數(shù)量，觀察其纖維化程度；(iii)觀察是否存在包囊和液泡jP(iv)通過淋巴細胞和巨噬細胞浸潤程度，觀察炎癥反應(yīng)強度。每個評定標(biāo)準(zhǔn)分為0-5級，其中，O=無，1=極少存在，2=極少到中等存在，3=中等存在，4=中等到廣泛存在，且5=廣泛存在。代表性的組織顯微圖如下所示圖2A，經(jīng)PBS處理的脂肪移植物，其中包括脂肪細胞變性、纖維化和有核炎性細胞，但是有些細胞仍具有活力和完整性；圖2B，經(jīng)低劑量促紅細胞生成素(EPO)處理的脂肪移植物，其中組織中的脂肪細胞界限清晰，組織中具有中等數(shù)量的纖維化；和圖2C，經(jīng)高劑量EPO處理的脂肪移植物，其中包括有活力、界限清晰且具有少量結(jié)締組織的完整的脂肪細胞。比例尺200 μ m。圖2D-F示出脂肪移植后，促紅細胞生成素(EPO)對脂肪移植物中炎癥反應(yīng)的影響的照片。植入三組小鼠后，脂肪移植物在脂肪注入當(dāng)天，利用PBS (100μ 1，圖2D)、20IUEP0/100 μ I PBS (低劑量，圖2Ε)或100IU ΕΡ0/100 μ I PBS (高劑量，圖2F)進行處理，且每三天重復(fù)一次，總共18天。得到最后的脂肪移植物后，對其切片，通過⑶68陽性細胞浸潤，評估炎癥反應(yīng)。箭頭所指的即為染成褐色的CD68陽性細胞。圖2G-I示出脂肪移植后，促紅細胞生成素(EPO)對脂肪移植物中新血管形成的影響的照片。植入三組小鼠后，脂肪移植物在脂肪注入當(dāng)天，利用PBS (100μ 1，圖2G)、20IUΕΡ0/100μ I PBS (低劑量，圖2Η)或100IU ΕΡ0/100μ I PBS (高劑量，圖21)進行處理，且每三天重復(fù)一次，總共18天。得到最后的脂肪移植物后，對其切片，評估微血管密度(MVD)。箭頭所指的即為染成褐色的CD31陽性內(nèi)皮細胞。圖2J-L示出移植后，EPO對脂肪移植物中炎癥反應(yīng)和MVD影響的圖表。圖2J的柱形圖示出EPO處理降低脂肪移植物中炎癥反應(yīng)的嚴重程度。圖2Κ的柱形圖示出EPO處理增大微血管密度(MVD)，劑量越大，MVD越大。每個柱表示15周研究期結(jié)束時，每個處理組的每個脂肪移植物中五個感興趣區(qū)中的平均MVD土 SDdPW. 05，#*Ρ〈0. 001，表示經(jīng)低劑量或高劑量EPO處理的脂肪移植物與經(jīng)PBS處理的移植物間的差異顯著性。比例尺50 μ m。圖2L的線形圖示出MVD對脂肪移植物中巨噬細胞的浸潤程度呈負相關(guān)。圖3A-J表示EPO對脂肪移植物中的血管生成生長因子表達水平的影響。來自三個不同小組小鼠的脂肪移植物在脂肪注入當(dāng)天，利用PBS (100μ1)、20 υ ΕΡ0/100μ I PBS(低劑量)或100IU ΕΡ0/100μ I PBS (高劑量)進行處理，且每三天重復(fù)一次，總共18天。圖3Α-Ι為經(jīng)PBS處理、低劑量EPO處理和高劑量EPO處理的脂肪移植物(如所示)的代表性組織顯微照片，圖3A-C為VEGF的表達，圖3D-F為VEGFR-2的表達且圖3G-I為EPOR的表達。圖3J示出15周研究期結(jié)束時，經(jīng)PBS處理和EPO處理的脂肪移植物中反映血管生成因子表達水平的代表性的免疫印跡照片。bFGF :堿性成纖維細胞成長因子；IGF-1 :類胰島素生長因子-I ；PDGF-BB :血小板衍生生長因子-BB ；MMP-2 :基質(zhì)金屬蛋白酶_2 ；PKB :蛋白激酶B ;磷光體 PKB (phosphoPKB):磷酸化 PKB。圖4A-F表示促紅細胞生成素(EPO)對脂肪移植物中血管生成生長因子表達水平的影響。植入三組小鼠后，脂肪移植物在脂肪注入當(dāng)天，利用PBS (100μ1)、20 υΕΡ0/100μ I PBS(低劑量)或100IU ΕΡ0/100μ I PBS(高劑量)進行處理，且每三天重復(fù)一次，總共18天。圖表代表每個處理小組的脂肪移植物中平均的血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的含量(圖4Α)、平均的VEGFR-2表達(圖4Β)和平均的EPOR表達(圖4C) ±SD。圖4D-F示出每個小組中VEGF和MVD之間的相關(guān)性(圖4D)以及平均的VEGFR-2 (圖4E)和EPOR (圖4F)的表達與平均MVD間的相關(guān)性，*P〈0. 05，**P〈0. 01，***P〈0. 001表示經(jīng)低劑量或高劑量EPO處理的脂肪移植物與經(jīng)PBS處理的移植物間的差異顯著性。比例尺200 μ m。圖5A-B表示脂肪移植物中，促紅細胞生成素(EPO)對細胞凋亡程度的影響。脂肪移植物植移入三個不同小組的小鼠后，將PBS (100μ 1),20IU ΕΡ0/100μ I PBS (低劑量)或100IU ΕΡ0/100μ I PBS (高劑量)注入脂肪移植物中，每三天重復(fù)一次該處理，總共18天。圖5Α示出在經(jīng)PBS處理的脂肪移植物中由TUNEL方法測得的細胞凋亡程度并以百分比表示。每個柱表示15周研究期結(jié)束時，每個處理小組的脂肪移植物中的平均細胞凋亡程度土 SD。*Ρ〈0. 05，#Ρ〈0. 01，*#Ρ〈0. 001表示經(jīng)低劑量或高劑量EPO處理的脂肪移植物與經(jīng)PBS處理的移植物間的差異顯著性。圖5Β示出15周研究期結(jié)束時，經(jīng)PBS處理和EPO處理的脂肪移植物中反映半胱氨酸蛋白酶3 (Casp 3)和細胞色素c (Cyt c)的表達水平的代表性蛋白免疫印跡照片。圖6A-D表示脂肪移植物中，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)對微血管密度(MVD)和細胞凋亡程度的影響。在脂肪注入兩個不同小組的小鼠的當(dāng)天，將PBS (100μ1)或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF，200ng VEGF/100 μ 1PBS)注入脂肪移植物中，每三天重復(fù)一次該處理，總共 18天。圖6Α的柱形圖表不每個玻片(玻片制備自15周研究期結(jié)束后,每次處理組獲得的脂肪移植物)上來自五個感興趣區(qū)的平均微血管密度(MVD) 土SD。圖6Β的柱形圖表示15周研究期結(jié)束后，每個處理小組獲得的脂肪移植物中的平均VEGF含量土SD。圖6C的柱形圖表示由TUNEL方法測得的細胞凋亡程度。結(jié)果以百分比表示經(jīng)PBS處理的脂肪移植物中細胞凋亡程度。每個柱表示15周研究期結(jié)束時，每個處理組的脂肪移植物中的平均細胞凋亡程度土SD。**P〈0. 01表示經(jīng)VEGF處理的脂肪移植物與經(jīng)PBS處理的移植物間的差異顯著性。圖6D示出15周研究期結(jié)束時，經(jīng)PBS處理和VEGF處理的脂肪移植物中反映半胱氨酸蛋白酶3 (Casp 3)和細胞色素c (Cyt c)的表達水平的代表性的蛋白免疫印跡照片。圖7A表示促紅細胞生成素(EPO)對基質(zhì)膠中人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)管形成的影響。在基質(zhì)膠上接種細胞后，利用20IU/ml或100IU/ml EPO對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)處理48小時。24小時后在10X放大倍數(shù)的光學(xué)顯微鏡下觀察基質(zhì)膠上的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)管形成程度。按照基質(zhì)膠上管形成的相對形成階段，對管結(jié)構(gòu)進行半定量分級，分為0-5個等級0=完全分離的單個細胞，1=細胞開始遷移并進行排列，2=可見毛細管且沒有出芽，3=可見新毛細管出芽，4=封閉多邊形的早期形成，5=發(fā)展為復(fù)雜的類網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。每個柱表示基質(zhì)膠中管形成的平均等級土SD。其中*Ρ〈0· 05，**Ρ〈0· 01且*#Ρ〈0· 001。圖7Β-Η表示EPO或VEGF對基質(zhì)膠中人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)管形成的影響。在基質(zhì)膠上接種細胞后，在存在或不存在0. 25mg/ml貝伐單抗時，利用100IU/ml EPO或200ng/100y I VEGF對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)處理48小時。24小時后在10X放大倍數(shù)的光學(xué)顯微鏡下觀察基質(zhì)膠上的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的管形成程度。按照基質(zhì)膠上管形成的相對形成階段，對管結(jié)構(gòu)進行半定量分級，分為0-5個等級0=完全分離的單個細胞，I =細胞開始遷移并進行排列，2=可見毛細管且沒有出芽，3=可見新毛細管出芽，4=封閉多邊形的早期形成，5=發(fā)展為復(fù)雜的類網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。圖7B中，白色的條形柱代表未處理的HUVECJ^ VEGF或EPO處理的HUVEC的基質(zhì)膠中的管形成的平均等級土SD。黑色條形柱代表暴露于貝伐單抗的未處理的HUVECJ^ VEGF或EPO處理的HUVEC的基質(zhì)膠中的管形成的平均等級土SD。*P〈0. 05和*#P〈0. 001表示暴露于貝伐單抗的HUVEC與未暴露于貝伐單抗的HUVEC間的差異顯著性。NS=沒有顯著差異。圖7C表示基質(zhì)膠上未處理的HUVEC ；圖7D表示平面接種24小時后，經(jīng)EPO處理的HUVEC ；圖7E表示平面接種24小時后，經(jīng)VEGF處理的HUVEC ;圖7F表示貝伐單抗存在時，未處理的HUVEC ;圖7G表示貝伐單抗存在時，平面接種24小時后，經(jīng)EPO處理的HUVEC ；圖7H表示貝伐單抗存在時，平面接種24小時后，經(jīng)VEGF處理的HUVEC。圖71表示EPO或VEGF對基質(zhì)膠中人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)管形成的影響。培養(yǎng)的HUVEC在貝伐單抗、PD173074、或酪氨酸磷酸化抑制劑(tyrphostin)和在貝伐單抗、PD173074和酪氨酸磷酸化抑制劑的組合物的存在下,或在渥曼青霉素(wortmannin)的存在下，有或沒有100IU/EP0進行處理。將[3H]胸腺嘧啶摻入DNA測量HUVEC的增殖。3個實驗都進行重復(fù)細胞計數(shù)，并計算其平均值且數(shù)據(jù)以控制百分數(shù)表示。*P〈0. 05、**P〈0. 01和***p〈o. 001表示暴露于貝伐單抗、PD173074、酪氨酸磷酸化抑制劑或渥曼青霉素的未處理或經(jīng)EPO處理的HUVEC間的差異。NS=沒有顯著差異。
具體實施例方式本發(fā)明，在一些實施例中，涉及脂肪組織，更具體地，但不局限于，涉及提高其植入 的方法。參照附圖和相應(yīng)描述，可更好理解本發(fā)明原理和操作。在詳細說明至少一個本發(fā)明實施例之前，應(yīng)該理解在其應(yīng)用中，本發(fā)明不限制于下面描述或示例的內(nèi)容。本發(fā)明可以有其他實施例或可以用不同方式執(zhí)行或?qū)嵤?。同樣地，?yīng)該理解這里使用的措辭或術(shù)語僅用于說明且不應(yīng)該被視為具有限制性。將本發(fā)明歸納到實踐層面，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)借助促紅細胞生成素(EPO)處理移植的脂肪組織可刺激多種血管生成因子(如VEGF)的釋放，提高脂肪組織的血管生成并防止脂肪移植物的細胞凋亡。此外，本發(fā)明還示出借助EPO處理的脂肪移植物可使移植的脂肪細胞長期存活。這綜合了描述促紅細胞生成素治療價值的現(xiàn)有教導(dǎo)及將促紅細胞生成素用于脂肪組織移植中的啟發(fā)。如下和下面的示例部分所示，本發(fā)明者通過反復(fù)的實驗發(fā)現(xiàn)EPO可提高脂肪組織的植入。本發(fā)明者具體示出了在脂肪移植后的15周，利用EPO處理的移植的脂肪組織顯示出較高的重量和體積(圖IA-C和表2)。在利用EPO處理的脂肪組織中，脂肪整合程度較高，而這些組織中的包囊形成程度和纖維化較低(圖2A-C和表3)。此外，經(jīng)EPO處理的脂肪組織具有高微血管密度(MVD)和⑶31表達增加的完全血管化區(qū)域，且具有許多內(nèi)皮島(圖2G-I和圖2K)，移植后表現(xiàn)出較低的炎癥反應(yīng)(圖2D-F和圖2J)。在這些細胞中，EPO處理也導(dǎo)致劑量依賴性的脂肪細胞凋亡減少(圖5A)，但增加了血管生成因子VEGF、bFGF、IGF-UPDGF-BB, MMP-2、PKB和磷酸化PKB的表達(圖3J和圖4A)并增加了組織VEGFR-2和EPOR的表達(圖3D-I和圖4B-C)。綜合考慮，這些結(jié)果證實了在移植手術(shù)中EPO可提高脂肪細胞的植入的值。因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了提高對其有需要的受試者中脂肪細胞存活率的方法，方法包括將脂肪細胞群植入受試者并給予受試者促紅細胞生成素。這里使用的術(shù)語“脂肪細胞”指任何包含在脂肪組織中的細胞或細胞群，例如，包括貯脂細胞、脂肪細胞、包含前脂肪細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的脂肪細胞前體。應(yīng)該注意根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)，該脂肪細胞可以是分散的或也可包含在組織中。
脂肪細胞的數(shù)量可在較寬范圍內(nèi)變化且本領(lǐng)域內(nèi)的每個普通技術(shù)人員應(yīng)該認識到該數(shù)量依據(jù)處理位置的類型和大小、處理位置相對的血管化程度、處理的受試者年齡和相對的移植脂肪細胞的活力而變化。應(yīng)該注意可根據(jù)使用方法、注入位置和注入位置上相對的血管化，對移植的脂肪細胞數(shù)量進行調(diào)整。本領(lǐng)域內(nèi)的每個普通技術(shù)人員應(yīng)該認識到某些情況下，有必要對脂肪細胞數(shù)量調(diào)整為下面描述的范圍以外。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，用于移植的脂肪細胞數(shù)量的范圍為每Iml約10，000到約10，000，000個脂肪細胞。根據(jù)另一個實施例，移植了 O. 01-2000毫升的脂肪組織。應(yīng)該注意如下面進一步的詳細描述，可對受試者提供單次移植或多次移植(如，約2、5、10、20、50、100或更多移植程序)。這里使用的短語“脂肪細胞存活率”指的是脂肪細胞移植后，其保持生存和完整性的能力。優(yōu)選地，移植后，脂肪細胞存活幾天、幾周、幾個月或幾年。這里關(guān)于脂肪細胞存活率使用的術(shù)語“提高”指在脂肪移植物中提高脂肪細胞壽命的過程和/或降低脂肪移植物內(nèi)經(jīng)歷再吸收、細胞凋亡或細胞死亡的脂肪細胞的數(shù)量。因此，在本發(fā)明的一些實施例中，提高指的是至少為脂肪細胞增加約10%、20%、50%、80%、90% 的生存能力和/或至少抑制約10%、20%、50%、80%、90%的細胞死亡。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)該理解可利用不同的方法和檢測，評估細胞的生存能力，且類似地，可利用不同的方法和實驗，評估細胞死亡或細胞凋亡(如FACS分析、脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記檢測(TUNEL)、細胞活力檢測如MultiTox檢測)。如上所述，根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)，通過為受試者提供促紅細胞生成素(EPO)提高脂肪細胞存活率。這里使用的術(shù)語“促紅細胞生成素”指的是哺乳動物(如，人)的促紅細胞生成素蛋白(可與多肽交換使用)或其模擬物，如GenBank編號NO. NP 000790中所述。促紅細胞生成素可利用重組DNA技術(shù)或固相技術(shù)合成。促紅細胞生成素還可從市場購得(如，Cytolab/Peprotech, Rehovot, Israel ；Arenesp, Amgen, Thousand Oaks, CA, USA 和 Epogen, Amgen,Thousand Oaks, CA, U SA, Bristol-Myers Squibb, Roche 和 Sanofi-Aventis)。促紅細胞生成素還可作為完整的糖蛋白或僅為沒有與糖結(jié)合的蛋白亞基。由于本發(fā)明的促紅細胞生成素應(yīng)用于臨床，所有其最好為無菌或?qū)赡芪廴镜囊蛩剡M行純化(例如，細菌或細菌組合，可用濾波器進行純化)。根據(jù)本發(fā)明的一方面，代表性的受試者包括哺乳動物，如人或馴養(yǎng)動物，包括，但不局限于，馬(即，馬科動物)、牛、山羊、綿羊、豬、狗、貓、駱駝、羊駝、美洲駝和牦牛，雌性或雄性，任何年齡均可，只要其需要進行脂肪移植。一般而言，脂肪移植可用于治療任何軟組織缺陷，從而填充任何軟組織缺損和填補由于手術(shù)、組織老化或疾病、創(chuàng)傷或損傷導(dǎo)致的身體外部和內(nèi)部的表面和結(jié)構(gòu)的缺失。示例包括，但不局限于，泌尿外科手術(shù)、腫瘤切除手術(shù)、重建技術(shù)和皮膚手術(shù)。而且，脂肪移植可替換硅膠或膠原蛋白填充劑。脂肪移植用于填補損傷或外科手術(shù)，如整容手術(shù)，包括，但不局限于，面部拉皮術(shù)、乳房切除術(shù)、腫瘤切除術(shù)或由于其他手術(shù)，例如癌組織切除，尤其是腫瘤位于受試者皮膚或靠近皮膚時造成的凹陷(即，相比正常身體相同部位的身體和體積，該身體部位為空洞或凹陷且缺乏細胞物質(zhì))。脂肪移植還有許多其他應(yīng)用，包括涉及建造虛弱或損壞結(jié)構(gòu)組織的的泌尿手術(shù)，治療皺紋、燒傷、皮膚狀況、皮膚病和創(chuàng)傷以及填補身體部位，例如臀部、二頭肌、三頭肌、小腿肌肉、乳房、手和陰莖。此外，脂肪移植還可用于治療先天畸形，如半側(cè)面部肢體發(fā)育不良和后天疾病，如Romberg脂肪代謝障礙綜合征和獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)。應(yīng)該理解脂肪細胞從受試者身體獲得且以自體方式使用(即移植入相同的獲得脂肪細胞的受試者)。在執(zhí)行自體脂肪移植時，自體脂肪細胞通常取自受試者，以便填補相同受試者身體中除脂肪細胞所移除位置的部位中的凹陷或軟組織缺損。
可選擇地，脂肪細胞可以非自體方式從一個受試者(“供體”)獲得，然后移植進一個不同的個體(“受體”)。在執(zhí)行非自體脂肪移植時，脂肪細胞可從作為受體受試者的同類(即，同種異體脂肪細胞，如從人供體到人受體)或不同類(即，異種細胞，如從豬供體到人受體)的受試者獲得。這些方法對本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員而言都是眾所周知的。根據(jù)本發(fā)明實施例，非自體細胞來自哺乳動物。根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)，脂肪細胞一般從胃、腿部位或其它可發(fā)現(xiàn)大量脂肪細胞的部位的皮下脂肪層獲得(如，通過抽吸)。優(yōu)選地，本發(fā)明的脂肪細胞不含無關(guān)細胞，如紅細胞、其它血細胞、成纖維細胞和其他可污染脂肪細胞的細胞。而且，用于移植的這些脂肪細胞在用于移植前，均保存在無菌環(huán)境中。應(yīng)該理解脂肪細胞在使用前，進一步將其與可在吸氣式脂肪發(fā)現(xiàn)的其他成分分離，例如，其他不需要成分中的甘油三酸酯、溶解酵素、其他的細胞碎片、血液成分、血細胞和大的結(jié)締組織碎片。本領(lǐng)域內(nèi)的任何已知方法都可用于從這些其他成分中分離出脂肪細胞，但優(yōu)選地，至少要使用一個離心步驟。根據(jù)一個實施例，脂肪細胞被立即植入受試者。優(yōu)選地，脂肪細胞在收集的30分鐘、一個小時、兩個小時、三個小時、四個小時或一天內(nèi)植入(例如見下述實施例部分的實施例I)。應(yīng)該理解本發(fā)明的脂肪細胞通過轉(zhuǎn)變可保存更長時間，例如，通過在液氮中冷凍。根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)，可利用本領(lǐng)域內(nèi)任何已知方法進行脂肪細胞的植入，例如，在移植大量脂肪細胞或脂肪組織時，通過顯微外科手術(shù)和外科手術(shù)將其注入所需部位(如下面實施例I的詳細描述)。根據(jù)本發(fā)明的一方面，植入脂肪細胞后，給予受試者促紅細胞生成素。應(yīng)該理解促紅細胞生成素可以是全身給藥，也可以是局部給藥。這里使用的短語“全身給藥”指的是通過口服、靜脈注射、腹膜注射或肌肉注射，進行本發(fā)明促紅細胞生成素給藥。這里使用的短語“局部給藥”指的是將本發(fā)明的促紅細胞生成素直接施加至植入的脂肪細胞或靠近脂肪細胞進行施加。根據(jù)示例性實施例，本發(fā)明的促紅細胞生成素通過注射直接給予移植的脂肪細胞。應(yīng)該理解根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)，用于局部給藥(如，直接注入植入的脂肪細胞)的促紅細胞生成素的預(yù)期劑量范圍為每注射每1，000, 000個脂肪細胞為1-1000IU。同樣地，用于全身給藥的促紅細胞生成素劑量范圍為每千克體重為10-7500IU之間。用于治療的促紅細胞生成素的劑量依賴于脂肪細胞的數(shù)量和濃度、治療的受試者和移植的位置。應(yīng)該理解當(dāng)使用模擬物時，促紅細胞生成素的劑量需要校準(zhǔn)，如根據(jù)摩爾值校準(zhǔn)。這樣的校準(zhǔn)對本領(lǐng)域內(nèi)的那些普通技術(shù)人員而言為常規(guī)計算。植入脂肪細胞后立即給予促紅細胞生成素。因此，根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)，在植入后的幾分鐘或幾小時內(nèi)，給予受試者促紅細胞生成素。根據(jù)具體實施例，從脂肪細胞移植的第一天開始，給予受試者促紅細胞生成素，并持續(xù)給予脂肪細胞在受試者中整合和血管化為止(如，至少5-50天)。根據(jù)具體實施例，本發(fā)明意圖在植入前，利用促紅細胞生成素處理脂肪細胞。這可以使得在植入后不需要給予促紅細胞生成素或代替植入后給予促紅細胞生成素。通過任何本領(lǐng)域內(nèi)每個普通技術(shù)人員熟知的方法處理脂肪細胞，例如在細胞培養(yǎng)板中將促紅細胞生成素與脂肪細胞進行體外接觸或直接將促紅細胞生成素注入脂肪組織。可選擇地，脂肪細胞在從供體移出前，與促紅細胞生成素進行接觸。用于移植前處理脂肪細胞的促紅細胞生成素的預(yù)期濃度為每注入每1，000，000個脂肪細胞為1-1000IU。植入前利用促紅細胞生成素治療的受試者可如上面所述的在植入脂肪細胞后繼續(xù)給予促紅細胞生成素。促紅細胞生成素可單獨或作為藥物組合物給予受試者。另外，本發(fā)明的脂肪細胞·可單獨或作為藥物組合物的一部分給藥。這里使用的“藥物組合物”指的是含其他化學(xué)成分，如生理上合適的載體和賦形劑的這里所述的活性組分的制劑。這些成分是為了促進對受試者給予活性組分(如，促紅細胞生成素)。這里使用的術(shù)語“活性組分”指的是促紅細胞生成素或負責(zé)預(yù)期生物效應(yīng)(B卩，提高脂肪細胞存活率)的脂肪細胞。在下文中，可交換使用的短語“生理上可接受的載體”和“藥學(xué)上可接受的載體”指的是不會對受試者造成很大刺激且不會廢除可作為給藥的活性組分的生物活性或特性的載體或稀釋藥。其還包括輔助藥。在此處，術(shù)語“賦形劑”指的是用于加入成分(藥物組合物)中的惰性物質(zhì)，從而進一步促進給予本發(fā)明的活性組分。藥物的配方和給藥技術(shù)可見“Remington，sPharmaceutical Sciences”，MackPublishing Co. , Easton, PA,最新版,其以引用方式并入本文。如上所述，合適的促紅細胞生成素給藥途徑，例如，可包括含口服、直腸、經(jīng)粘膜，尤其是經(jīng)鼻、腸的遞送或含肌肉內(nèi)、皮下和骨髓內(nèi)注射和鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射的非腸道遞送的全身方式。另一方面，可以局部而不是全身方式，給予包含促紅細胞生成素的藥物組合物，例如，通過直接將藥物組合物注入患者的脂肪細胞移植物區(qū)域或通過將組合物直接應(yīng)用到靠近患者脂肪細胞移植物的組織區(qū)域。組合物的合適給藥途徑可，例如，包括局部(例如，角質(zhì)組織，如，皮膚、頭皮)和粘膜(如口、鞘、眼睛)給藥。本發(fā)明的藥物組合物可利用本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的方法進行制備，例如，通過傳統(tǒng)的混合、溶解、制粒、制備糖衣、磨細、乳化、包囊、包埋或凍干的方法。依照本發(fā)明使用的藥物組合物因此可以傳統(tǒng)方式，利用一個或更多包括賦形劑和輔助劑的生理上可接受的載體進行制備，其可促進活性組分進入藥學(xué)上使用的藥劑。合適的制備方法取決于所選擇的給藥途徑。當(dāng)用于注射時，藥物組合物中的活性組分可配制在水溶液中，優(yōu)選地，配制在生理上兼容的緩沖溶液中，如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理鹽水緩沖液。當(dāng)粘膜給藥時，制備時利用滲透液可適當(dāng)阻止?jié)B透。這些滲透液都是本領(lǐng)域內(nèi)一般所熟知的滲透液。當(dāng)口服給藥時，藥物組合物可通過將活性組分和本領(lǐng)域內(nèi)熟知的藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合而很快制得。這些載體可使藥物組合物制備成藥片、藥丸、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、淤漿、懸浮液和諸如此類，以便患者口服攝入。用于口服的藥物制劑可通過固體賦形劑，可選擇地研磨結(jié)果的混合劑，然后如果需要加入合適的輔助劑后對混合劑進行加工，以獲得藥片或糖衣丸的核心而制得。合適的賦形劑具體為填料，如包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇的糖；纖維素制劑，如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、凝膠、明膠、黃耆膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉；和/或生理上可接受的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解劑，例如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或其鹽，如藻酸鈉。糖衣核心具有合適的涂層。為了這個目的，可利用濃縮的糖溶液，其可選擇地包括阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇、二氧化鈦、溶漆溶液和合適的有 機溶劑或溶劑混合物?？蓪⑷玖匣蝾伭霞尤胨幤蛱且峦繉樱员阕R別或表征具有不同活性組分劑量的制品?？煽诜褂玫乃幬锝M合物包括由明膠和制備的推入適配膠囊，和由明膠制備的柔軟、密封膠囊以及增韌劑，如甘油和山梨糖醇。推入適配膠囊的填料混合物中包含活性組分，如乳糖，粘合劑如淀粉，潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂和，可選擇地，穩(wěn)定劑。在軟凝膠中，活性組分被溶解或懸浮在合適的液體中，包括脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。另外，可加入穩(wěn)定劑。所有口服給藥的配方劑量都應(yīng)適合于選定的給藥途徑。對于頰給藥，可利用傳統(tǒng)方法將組合物制成藥片或潤喉糖形式。對于通過鼻吸入給藥，根據(jù)本發(fā)明，有用的活性組分通常由增壓包或具有合適推進物如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳的噴霧器產(chǎn)生氣溶膠噴霧進行遞送。當(dāng)為增壓噴霧時，劑量單位由閥確定，以遞送測定的量。配藥器中使用的如凝膠的膠囊和藥筒可制備成包含化合物粉末混合物和適宜的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的膠囊和藥筒。這里使用的藥物組合物可制備用于非腸道給藥，例如，通過單次快速靜脈注射或靜脈持續(xù)輸注。用于注射的制劑可制成單位劑量形式，例如，安瓿或多劑量容器，可選擇地加入防腐劑。組合物在油性或水性介質(zhì)中可為懸浮液、溶液或乳狀液，且可包含調(diào)配試劑，例如，懸浮、穩(wěn)定和/或分散試劑。用于非腸道給藥的藥物組合物包括水溶形式的活性制劑水溶液。此外，活性組分的懸浮液可制備成合適的油或水基的注射懸浮液。適宜的親脂性溶劑或介質(zhì)包括脂肪油如芝麻油或合成脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酸酯或脂質(zhì)體。水注射懸浮液可包含增加懸浮液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或右旋糖酐?？蛇x擇地，懸浮液還可包括適宜的穩(wěn)定劑或提高活性組分溶解度的試劑，以便制備高度濃縮的溶液?？蛇x擇地，活性組分可為粉末形式，以便使用前和適宜的介質(zhì)如無菌、無熱原的水基溶液溶合。本發(fā)明的藥物組合物還可制成直腸施用的組合物，例如栓劑或保留灌腸劑，如利用傳統(tǒng)的栓劑基質(zhì)如可可脂或其他甘油酯。適用于本發(fā)明的藥物組合物包括其活性組分的含量可有效完成預(yù)期目標(biāo)的組合物。更具體地，治療有效量意味可有效提高脂肪細胞存活率的活性組分(促紅細胞生成素)的含量。測定治療有效量是本領(lǐng)域內(nèi)那些技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的，尤其根據(jù)本文提供的詳細公開。本發(fā)明方法中所使用的任何制劑，其治療有效量或劑量可通過體外或細胞培養(yǎng)試驗初步估計。例如，劑量可通過動物 模型配制，以便獲得所需濃度或滴定量。這些數(shù)據(jù)可用于更精確地測定人體中的有用劑量。這里描述的活性組分的毒性和療效可通過體外、細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏械臉?biāo)準(zhǔn)配藥方法測定。從體外和細胞培養(yǎng)方法以及動物研究得到的這些數(shù)據(jù)可用于制定用于人體的劑量范圍。該劑量取決于所采用的劑量形式和使用的給藥途徑。精確配方、給藥途徑和劑量可由醫(yī)師基于患者病情選定(如見Fingl等，1975，“The Pharmacological Basis ofTherapeutics，，,中第一章,第一頁)。劑量和間隔可單獨調(diào)整成足以誘導(dǎo)和抑制生物效應(yīng)的活性組分水平(最低效應(yīng)濃度，MEC)。雖然每個制劑的MEC都不同，但其可從體外數(shù)據(jù)估算出來。達到MEC的劑量取決于各自特征和給藥途徑?？衫脵z測方法確定血藥濃度。根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)，可利用評估這里描述的組合物的生物效應(yīng)的動物模型包括SCID小鼠(如下面實施例部分中的詳細描述)。根據(jù)所治療病癥的嚴重程度、植入的脂肪細胞數(shù)量和受試者對治療的響應(yīng)，在從幾天持續(xù)至幾周或幾個月或直到產(chǎn)生有效治療或直到可維持足夠的脂肪組織的治療期間，劑量給藥可為單次或多次給藥。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，可對受試者進行促紅細胞生成素組合物一次給藥、兩次給藥、三次給藥、四次給藥、五次給藥、六次給藥、七次給藥、八次給藥、九次給藥或十次給藥，以便提高脂肪細胞存活率。應(yīng)該理解如果移植多種脂肪細胞，需要進行大量次數(shù)的促紅細胞生成素給藥且如果需要(如本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員確定)其會持續(xù)很久。優(yōu)選地，每天至少進行一次本發(fā)明組合物給藥。應(yīng)該理解給藥次數(shù)可由本領(lǐng)域內(nèi)的每個普通技術(shù)人員確定。組合物的給藥次數(shù)取決于所治療的受試者、病癥的嚴重程度、給藥方式、開處方醫(yī)生的意見等。通過測量所移植脂肪細胞的數(shù)量和活力(如，通過超聲)、測量移植物內(nèi)細胞凋亡數(shù)(如，通過PCR)以及評估移植脂肪細胞的血管化(如，通過超聲)測定治療療效。如果需要，本發(fā)明組合物可放置在包裝或分配器裝備中，例如，包含一個或更多含活性組分的單位劑型的FDA批準(zhǔn)的套件。包裝，例如，可包含金屬或塑料箔，如透明包裝。包裝或分配器裝備上可附有給藥說明。包裝或分配器裝備上還可附有由政府機構(gòu)規(guī)定藥品制造、使用或銷售的注意事項，注意事項反映了機構(gòu)批準(zhǔn)的用于人或獸醫(yī)給藥的組合物形式。例如，這些注意事項可包含由美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的處方藥標(biāo)簽或經(jīng)批準(zhǔn)的產(chǎn)品說明書標(biāo)簽。還可配制本發(fā)明在藥學(xué)上可接受載體制劑的組合物，將其放置在合適的容器中并貼上如上進一步詳細描述的標(biāo)示指定條件下治療的標(biāo)簽。因為本發(fā)明組合物用于體內(nèi)，所以該組合物優(yōu)選為高純度和基本無潛在有害污染物的組合物，例如，至少為國家食品(NF)級，一般至少為分析級，且優(yōu)選至少為醫(yī)藥級。就指定化合物必須在使用前合成而言，這些合成或隨后的純化應(yīng)優(yōu)選基本無任何潛在的污染有毒物質(zhì)的且可用于合成或純化步驟的制品。可將其他因子并入本發(fā)明的組合物(即，上文描述的促紅細胞生成素)，以提高脂肪細胞存活率。其包括，但不局限于，胞外基質(zhì)成分(如，玻連蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白)，生長因子(如，F(xiàn)GF 1，F(xiàn)GF 2，IGF 1，IGF 2，PDGF, EGF, KGF, HGF, VEGF, GM-CSF,CSF，G-CSF，TGF- a，TGF- β，NGF 和 ECGF),缺氧誘導(dǎo)因子(如，HIF-1 α 和 HIF-1 β 和HTF-2)，激素(如，胰島素、生長激素(GH)、CRH、瘦素、催乳素和TSH)，血管生成因子(如，血管生成素和促血管新生蛋白因子),凝結(jié)和抗凝結(jié)生成因子[如，F(xiàn)actor I, Factor XIII，組織因子，鈣、vWF、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、纖連蛋白、抗凝血酶、肝素、血纖維蛋白溶酶原、低分子量肝素(Clixan)、高分子量激肽原(HMWK)、前激肽釋放酶、纖溶酶原激活劑抑制物-I(PAI1)，纖溶酶原激活劑抑制物-2 (PAI2)、尿激酶、血栓調(diào)節(jié)蛋白、組織型纖溶酶原激活物(tPA)、α 2抗血纖維蛋白酶和蛋白Z依賴的蛋白酶抑制劑(ZPI)]，細胞因子(IL-Ια，IL-Iβ ， IL-2, IL-3, IL-4， IL-5， IL-6， IL-7， IL-8， IL-9， IL-10， IL-11， IL-12， IL-13 和INF- a , INF- β和INFi )，趨化因子(如，MCP-1或CCL2)，酶(如，糖苷內(nèi)切酶、外切糖苷酶、 核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、肽酶、脂肪酶、氧化酶、脫羧酶、水化酶、軟骨素酶、軟骨素酶ABC、軟骨素酶AC、透明質(zhì)酸酶、角質(zhì)素酶、類肝素酶、類肝素酶剪接變體、膠原酶、胰蛋白酶、過氧化氫酶)，神經(jīng)遞質(zhì)(如，乙酰膽堿和單胺類神經(jīng)遞質(zhì))，神經(jīng)肽(如，P物質(zhì))，維生素(如，D-生物素、氯化膽堿、葉酸、肌醇、煙酰胺、D-泛酸、鈣鹽、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆辛、核黃素、鹽酸硫胺、維生素B12、維生素E、維生素C、維生素D、維生素B1-6、維生素K、維生素A和維生素PP)，碳水化合物(如，單/ 二 /多糖，包括葡糖糖、甘露糖、麥芽糖和果糖)，離子，螯合劑(如，F(xiàn)e螯合劑、Ca螯合劑)，抗氧化劑(如，維生素E、槲皮素、超氧陰離子清除劑、超氧化物歧化酶，H2O2清除劑，自由基清除劑、Fe清除劑)，脂肪酸(如，甘油三酯、磷脂、膽固醇、游離脂肪酸、非游離脂肪酸、脂肪醇、亞油酸、油酸和硫辛酸)，抗生素(如，青霉素、頭孢菌素和四環(huán)素類)，止痛劑，麻醉劑、抗菌劑、抗酵母劑，抗真菌劑，抗病毒劑，益生菌劑，抗原生動物劑，抗癢劑，抗皮炎劑，止吐藥，消炎藥，抗角化過度劑，止汗劑，抗牛皮癬劑，抗脂溢性劑，抗組胺齊IJ，氨基酸(如，必需氨基酸和非必需氨基酸(從A到Ζ)，尤其是谷氨酸和精氨酸)，鹽(如，戊醛酸鹽(prurivat)和硫酸鹽)，硫酸鹽(如，硫酸鈣)，類固醇(如，雄激素、雌激素、孕激素、糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素)，兒茶酚胺類(如，腎上腺素和去甲腎上腺素)，核酸和核苷酸(如，嘌呤和嘧啶)，前列腺素(如，前列腺素E2 ),白三烯,促紅細胞生成素(如,血小板生成素)，蛋白多糖(如，硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素)，羥基磷灰石[如，羥基磷灰石(Caltl (P04) 6 (OH)2)]，觸珠蛋白類(Hpl-1，Hp2-2和Hpl-2)，超氧化物歧化酶(如，SOD 1/2/3)，氮氧化物，一氧化氮供體(如，硝普鹽，Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA),谷胱甘肽過氧化物酶,吸水化合物(如，抗利尿激素)，細胞(如，血小板)，細胞培養(yǎng)基(如，M199，DMEM/F12，RPMI，Iscovs)，血清(如,人血清、胎牛血清、牛胎血清),緩沖液(如，HEPES，碳酸氫鈉)，除污劑(如，吐溫),消毒齊IJ，草藥，水果提取物，蔬菜提取物(如，白菜、黃瓜)，花提取物，植物提取物，黃酮類(如，石榴汁)，香料，葉片(如，綠茶、洋甘菊)，多酚類(如，紅葡萄酒)，蜂蜜，外源凝集素，微粒，納米粒(如，脂質(zhì)體)，膠束，碳酸鈣(CaCO3,如，輕質(zhì)碳酸鈣、重質(zhì)/粉狀碳酸鈣、沉降碳酸鈣、PCC、GCC)，方解石，石灰石，粉碎的大理石，石灰石粉，石灰，白塵粉(如，白堊粉、香檳色白堊粉、滑石粉)以及輔助因子如BH4 (四氫生物喋呤)。
本發(fā)明組合物還包含組分、物質(zhì)、要素和材料，其包含氫、烷基、芳基、鹵素基團、羥基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、酰基、羧基、甲酰胺基、氨磺酰基，氨基?；?、酰胺基、胺基、硝基、有機硒化合物、烴和環(huán)烴。本發(fā)明組合物可與物質(zhì)如過氧化苯甲酰、血管收縮劑、血管擴張劑、水楊酸、視黃酸、壬二酸、乳酸、乙醇酸、多尿酸(pyreuric acid)、鞣酸類、亞芐基樟腦和其衍生物，α-羥基類，表面活性劑結(jié)合。本發(fā)明一些實施例中的組合物可與聚乙二醇(如，PEG, SE-PEG)形成生物共軛，聚乙二醇可保持活性組分(如，促紅細胞生成素)的穩(wěn)定性(如，抵抗蛋白酶活性)和/或溶解性(如,生物流體如血液、消化液內(nèi)),與此同時還保持其生物活 性并延長其半衰期。應(yīng)該理解本發(fā)明組合物可與目前精通的其他治療方法結(jié)合用于脂肪細胞的移植，如，但不限制于，借助生長因子治療受試者，在支架上移植脂肪細胞或在聚酯乙烯珠上移植脂肪細胞。如上所述，本發(fā)明的脂肪細胞可來源于自體或源于非自體(如，同種異體或異種)。由于在給身體給藥時，非自體細胞可能會誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，所以需要制定多個方法以降低排斥非自體細胞的可能性。這些方法包括抑制受體的免疫系統(tǒng)或在移植前，利用免疫隔離、半透膜包囊非自體細胞或組織。包囊技術(shù)一般可分類為微囊化技術(shù)，其包括小球狀載體和微型膠囊，還包括較大的平板式或中空纖維膜(Uludag, H.等，Technology of mammalian cell encapsulation,Adv Drug Deliv Rev. 2000；42 :29_64)。微膠囊的制備方法已被本領(lǐng)域內(nèi)所熟知，其包括，例如，Lu MZ等公開的Cellencap suIation with alginate and alpha-phenoxy cinnamyl idene-acetylatedpoly (allylamine), Biotechnol Bioeng，2000，70 :479_83， Chang TM and Prakash S，Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineeredmicroorganisms, Mol Biotechnol，2001，17 :249-60 以及 Lu MZ 等，A novel cellencapsulation method using photosensitive poly (allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate)，J Microencapsul,2000,17 :245_51。例如，可通過將修飾后的膠原蛋白與甲基丙烯酸-2-羥乙酯(HEMA)的三元共聚物外罩、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)絡(luò)合制備微膠囊，其產(chǎn)生的膠囊厚度為2-5 μ m0這些微膠囊可進一步借助附加的2-5 μ m的三元共聚物外罩進行包囊，以便產(chǎn)生帶負電荷的光滑表面并使得血衆(zhòng)蛋白質(zhì)的吸收降到最低(Chia, S.M.等，Multi-layeredmicrocapsules for cell encapsulation Biomaterials, 200223 :849_56)。其他微膠囊是基于海藻鹽、海洋多糖(Sambanis, A. Encapsulated islets indiabetes treatment, Diabetes Thechnol. Ther. 2003, 5 :665-8)或其衍生物制成。例如，微膠囊可在氯化鈣存在時，借助聚陽離子聚亞甲基二胍鹽酸鹽，通過聚陰離子海藻酸鈉和纖維素硫酸鈉間的聚電解質(zhì)絡(luò)合制備得到。應(yīng)該理解使用更小膠囊可提高細胞包囊。因此，當(dāng)膠囊大小從Imm降至400 μ m時，包囊細胞的質(zhì)量控制、機械穩(wěn)定性、擴散性能和體內(nèi)活性都得到提高(Canaple L.等，Improving cell encapsulation through size control,J Biomater Sci Polym Ed. 2002 ；13 :783-96)。此外，孔徑大小被很好控制在小至7nm的納米多孔生物膠囊，發(fā)現(xiàn)其特制的表面化學(xué)作用和精確的微體系結(jié)構(gòu)可成功免疫隔離細胞微環(huán)境(Williams D. Smallis beautiful microparticle and nanoparticle technology in medical devices,Med Device Technol，1999，10 :6_9 ;Desai，T.A. Microfabrication technology forpancreatic cell encapsulation, Expert Opin Biol Ther，2002，2 :633_46)。如上所述，為了促進非自體脂肪細胞的植入，本發(fā)明方法進一步有利地包括了在脂肪細胞移植之前、當(dāng)中或之后，調(diào)節(jié)受試者的免疫抑制治療。根據(jù)具體實施例，相比沒有借助促紅細胞生成素治療的受試者，本發(fā)明中的方法減少了免疫抑制治療。示例性合適類型的免疫抑制治療包括進行免疫抑制藥物給藥和/或進行放射免疫抑制。合適免疫抑制治療的選定和進行合適免疫抑制治療給藥的詳細指導(dǎo)可見本領(lǐng)域內(nèi)文獻(例如，參考Kirkpatrick CH.和 Rowlands DT Jr.，1992，JAMA, 268, 2952 ； Higgins RM.等，1996,Lancet 348,1208 ；Suthanthiran M.和 Strom TB. ,1996,New Engl.J. Med. 331,365 ；Midthun DE.等，1997，Mayo Clin Proc. 72,175 ；Morrison VA.等，1994，Am J Med. 97,14 ；Hanto Dff. , 1995, Annu Rev Med. 46, 381 ;SenderowiczAM.等，1997, AnnIntern Med. 126,882 ；Vincenti F.等，1998, New Engl. J. Med. 338,161 ；Dantal J.等，1998，Lancet 351,623)。優(yōu)選地，免疫抑制治療包含至少為受試者進行一次免疫抑制劑給藥。示例性免疫抑制劑包括，但不局限于，氨甲葉酸、安道生、環(huán)孢霉素、環(huán)胞多肽么、氯喹、輕化氯喹、柳氮磺胺批唳(磺胺類柳氮磺胺批唳)、金制劑、D-青霉胺、來氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滯素、英夫利昔(類克)、依那西普、TNF α，阻斷劑、針對炎性細胞因子的生物制劑和非留體類抗炎藥(NSAID)。示例性NSAID包括，但不局限于，乙酰水楊酸、膽堿水楊酸鎂、二氟尼柳、水楊酸鎂、雙水楊酯、水楊酸鈉、雙氯芬酸、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、茚甲新、苯酮苯丙酸、酮洛酸、抗炎酸鈉、萘普生、萘布美酮、苯基丁氮酮、吡羅昔康、蘇靈大、甲苯酰吡啶乙酸、醋氨酚、布洛芬、Cox-2抑制劑和反胺苯環(huán)醇。這些試劑可單獨或聯(lián)合給藥。根據(jù)另一個實施例，相比沒有借助促紅細胞生成素治療的受試者，本發(fā)明方法減少了抗炎治療[例如，抗炎藥物如留體、非留體抗炎藥或免疫選擇抗炎衍生物(ImSAID)]。這里使用的術(shù)語“約”指的是±10%。術(shù)語“包括” “包含” “具有”以及其結(jié)合形式意味“包括但不局限于”。 術(shù)語“由…組成”意味“包括且局限于”。術(shù)語“基本由…組成”意味組成、方法或結(jié)構(gòu)可包括額外的成分、步驟和/或部分，但僅適用于額外的成分、步驟和/或部分不顯著改變權(quán)利要求限定的組成、方法或結(jié)構(gòu)的基本和新特征的情況。除非文中另有明確規(guī)定，否則這里使用的單數(shù)形式“一個(一種)”也可指復(fù)數(shù)。例如，術(shù)語“一種化合物”或“至少一種化合物”可包括多種化合物，包括其混合物。在整個申請中，本發(fā)明的不同實施例可用范圍的形式表示。應(yīng)該理解其中的描述僅僅是為了方便和簡潔，其不應(yīng)該解釋為限制本發(fā)明的保護范圍。因此，范圍描述應(yīng)該被視為已明確公開所有可能的子范圍和該范圍內(nèi)的單個數(shù)值。例如，如I至6的范圍描述應(yīng)該被視為已明確公開子范圍，如I至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及其范圍內(nèi)的單個數(shù)值，如1、2、3、4、5和6。無論多寬范圍均適用。這里示出的數(shù)值范圍均包括指定范圍內(nèi)的任何引用的數(shù)值(分數(shù)或整數(shù))。短語“在……之間變化/……之間的范圍”，其第一個表明數(shù)值且第二個也表明數(shù)值，而“從……變化/從……的范圍”，其第一個表明數(shù)值“到”，第二個表明這里所用的數(shù)值是可交換地且包括第一和第二指定的數(shù)值和數(shù)值間的所有分數(shù)和整數(shù)。這里使用的術(shù)語“方法”指的是用于完成指定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和步驟，其包括，但不局限于，那些化學(xué)、藥理、生物、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)人員所熟知的或容易地將已知的方式、手段、技術(shù)和步驟進行改進的方式、手段、技術(shù)和步驟。這里使用的術(shù)語“治療”包括廢除、顯著抑制、減緩或逆轉(zhuǎn)病癥發(fā)展，顯著改善病癥的臨床或?qū)徝腊Y狀或顯著抑制病癥的臨床或?qū)徝腊Y狀的出現(xiàn)。應(yīng)該理解，為清楚起見，描述于單獨實施例中的本發(fā)明的某些特性也可在單個實 施例中以結(jié)合形式存在。相反地，為簡便起見，描述于單個實施例的本發(fā)明的不同特性也可單獨存在或以任何合適的變形形式存在或同樣適合于任何其他描述的本發(fā)明實施例。各實施例中描述的不同特征不是那些實施例的基本特性，除非實施例不具備那些要素就無法發(fā)揮作用。如上述的和如下面權(quán)利要求部分所限定的本發(fā)明的不同實施例和方面可在下面實施例中得到實驗性支持。實施例現(xiàn)引用下面實施例，結(jié)合以上描述以非限制性方式說明本發(fā)明。一般地，這里使用的術(shù)語和本發(fā)明中所用的實驗方法包括分子、生物化學(xué)、微生物和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中有充分說明。例如，見“Molecular Cloning A laboratory Manual，，Sambrook 等，(1989) ;“Current Protocols in Molecular” Ι-ΠΙ卷 Ausubel, R. M.編著，(1994) ；Ausubel 等 “Current Protocols in Molecular，，，JohnWiley 和 Sons, Baltimore,Maryland (1989) ;Perbal,“A Practical Guide to MolecularCloning”，John ffiley&Sons,NewYork (1988);Watson 等，“Recombinant DNA”，ScientificAmerican Books, New York ;Birren 等(編著)“Genome Analysis A Laboratory ManualSeries”，Vols 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);方法如美國專利 NO. 4，666，828 ；N0. 4，683，202 ；N0. 4，801，531，NO. 5，192，659 和 NO. 5，272，057中描述；“Cell Biology A Laboratory Handbook”, I-U[卷 Cellis, J. E.編著(1994);“Current Protocols in Immunology，，I-U[卷 Coligan J. E.編著(1994) ;Stites 等(編著)，“Basic and Clinical Immunology” (第八版)，Appleton&Lange, Norwalk, CT (1994);Mishell 和 Shiigi (編著)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W. H. Freeman和Co.，New York (1980);可利用的免疫測定法在專利和科學(xué)文獻中有廣泛描述，例如，見美國專利 NO. 3，791，932 ；N0. 3，839，153 ；N0. 3，850，752 ；N0. 3，850，578 ；N0. 3，853，987 ；NO. 3，867，517 ；N0. 3，879，262 ；N0. 3，901，654 ；N0. 3，935，074 ；N0. 3，984，533 ；NO. 3，996，345 ；N0. 4，034，074 ；N0. 4，098，876 ；N0. 4，879，219 ；N0. 5，Oil, 771 和NO.5，281，521 ;“01igonucleotide Synthesis”Gait, M. J.編著(1984);“NucleicAcid Hybridization”Hames, B. D.和 Higgins S. J.編著(1985) !“Transcription andTranslationTiames, B. D.和 Higgins S. J.編著(1984);“Animal Cell Cu I ture ^reshney,R. I.編著(1986) Immobilized Cells and Enzymes，，IRL Press, (1986) ;“A PracticalGuide to Molecular Cloning”Perbal，B.，( 1984)和“Methods in Enzymology”l_317 卷，Academic Press ;“PCR Protocols A Guide To Methods And Applications，，，AcademicPress, San Diego, CA (1990) ;Marshak 等，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-Α Laboratory Course Manua，，CSHL Press (1996);其全部都以引用的方式并入本文中。本文還提供其他一般參考文獻。其中的方法為本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法并且提供這些方法為了方便讀者理解。這里包含的所有信息都以引用的方式并入本文。實施例I通過脂肪移植物的重量和體積來比較低劑量ΕΡ0、高劑量EPO和VEGF治療
材料和實驗方法人體脂肪組織的分離和制備脂肪取自40歲女人的大腿，在其全身麻醉情況下通過抽吸輔助脂肪切除術(shù)獲得。在局部麻醉時，利用14號鈍頭插管吸出脂肪，然后在無菌環(huán)境中進行處理，隨后根據(jù)此前公開的方法[Ullmann 等，(2005) Dermatol Surg 31 1304-7 ；Kurita 等，(2008) PlastReconstr Surg 121 :1033-1041]，在其采集的兩個小時內(nèi)植入裸鼠中。實驗設(shè)計此處設(shè)計了兩種不同的動物實驗。第一個實驗包含30只七周齡的雌性⑶-I裸鼠(Harlan, Jerusalem, Israel)。將這些小鼠圈在房間的籠子里，保持恒定的溫度范圍(24±2°C )和相對濕度(55土 10%)，人為地進行12小時光/暗循環(huán)。在實驗前，對小鼠進行一周的馴化，并無限制性地飼喂標(biāo)準(zhǔn)的實驗室飼料和水。將這30只小鼠隨機地分成三組，并按以下步驟進行處理第一組小鼠注入Iml的人體脂肪并利用無菌的PBS進行處理(對照組)。第二組小鼠注入Iml人體脂肪并利用lOOOIU/kg ΕΡ0(低劑量EPO組)進行處理。第三組小鼠注入Iml人體脂肪并利用5000IU/kgΕΡ0(高劑量EPO組)進行處理。用手控制小鼠，利用14G注射針通過皮下注射將脂肪注入頭皮。脂肪移植后，立即對PBS處理的脂肪移植物注入100 μ I PBS(對照組)，并對EPO處理的脂肪移植物注入20IU EP0/100 μ I PBS (低劑量EPO組)或100IU ΕΡ0/100 μ I PBS (高劑量EPO組)，每三天注射一次，總共18天(總共注射6次)。購買EPO注射安瓿(ARANRSP ,Amgen AG, Zug, Switzerland),其包含 150 μ g/ml (18，000IU)的 ΕΡ0。第二個動物實驗包含20只七周齡的雌性⑶-I裸鼠，且與第一個實驗不同的是移植后利用VEGF (2 μ g/ml, SigmaAldrich, Mo, USA)進行處理。將脂肪注入10只小鼠后，再注入200ng VEGF/100 μ I的PBS，每三天注射一次，總共18天。剩下的10只小鼠組成第二個對照組，其利用第一個實驗中處理對照組的相同方法進行處理。兩個實驗均不為小鼠提供術(shù)后鎮(zhèn)痛藥和抗生素。跟蹤和數(shù)據(jù)采集兩個實驗研究從脂肪移植開始均持續(xù)15周。在其期間，稱量每只小鼠的體重；收集尾部靜脈血樣，以便測定紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)和血小板數(shù)；并測量血漿血紅蛋白、VEGF和EPO的濃度。在三種不同場合實施該測量脂肪注入當(dāng)天，脂肪注入后18天和最后。利用脂肪移植物樣品的組織勻衆(zhòng)，借助商用的酶聯(lián)免疫吸附法(<5uantilcineS‘VEGF immunoassayKit and QuantildlieeIVDeKry山丨OpoiCiill Kit, R&D Systems, MN, USA),根據(jù)制造商提供的使用說明，測定VEGF和EPO濃度。15周后，人道地殺死所有小鼠并從其頭皮小心謹慎地切割出脂肪移植物(圖1C)。稱量每個脂肪移植物的重量并利用前面描述的液體溢出法測量其體積[Ayhan等，(2001)Aesthetic Plast Surg 25:338-342]。測量完體重和體積后，將每個脂肪移植物從中間分割成兩部分。一部分放在_80°C下儲存，用于之后EPO濃度、VEGF含量、細胞凋亡程度和血管生成因子即bFGF、胰島素生長因子-I (IGF-1)、PDGF-BB, VEGF受體-2 (VEGFR-2)、EPO受體(EPOR)和MMP-2、生存因子PKB和磷酸化PKB以及促凋亡因子即半胱氨酸蛋白酶_3和細胞色素C的表達水平的測量。第二部分放于4%的福爾馬林，用于測量巨噬細胞浸潤、微血管密度(MVD)、VEGFR-2和EPOR定位以及組織學(xué)檢查。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析匯集經(jīng)PBS、VEGF或EPO處理的脂肪移植物的每個研究參數(shù)數(shù)據(jù)，結(jié)果表示為平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布。利用計算機的統(tǒng)計軟·件(Prism version 5. O, GraphPad Software Inc, CA, USA),通過 ANOVA 分析第一個實驗中的數(shù)據(jù)，通過學(xué)生氏t檢驗分析第二個實驗中的數(shù)據(jù)。P ^ O. 05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。有關(guān)內(nèi)部審查者可重復(fù)性的組織學(xué)分析的盲法評估、MVD和基質(zhì)膠中管形成的Kappa值分別為 O. 94,0. 89 和 O. 93。結(jié)果兩個實驗的處理組中的所有小鼠均完成15周的研究期。它們在研究期間均健康且在研究結(jié)束時，未出現(xiàn)惡病質(zhì)。含磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)處理或低劑量EPO處理的脂肪移植物(如下表I)的小鼠的紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)、血小板數(shù)、血漿血紅蛋白和EPO濃度均沒有顯著變化。利用高劑量EPO處理脂肪移植物的小鼠的紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)、血小板數(shù)、血漿EPO濃度，除血漿血紅蛋白濃度外均顯著增加(如下表I )。移植后的18天，兩組利用EPO處理脂肪移植物的小鼠的血漿VEGF濃度顯著增加。在15周研究期結(jié)束時，兩組利用EPO處理脂肪移植物的小鼠的血漿VEGF濃度與利用PBS處理脂肪移植物的小鼠的基線值和血漿VEGF相比，沒有顯著不同。在15周研究期結(jié)束時，PBS和EPO處理的移植物中的EPO濃度與基線值相同，然而，脂肪注入的18天后，EPO和VEGF值均顯著高于EPO-低劑量和EPO-高劑量處理組中的EPO和VEGF值(如下表I)。表I :ΕΡ0處理對體重、血液細胞、血漿和組織EPO濃度的影響
權(quán)利要求
1.一種提高對其有需要的受試者中脂肪細胞存活率的方法，所述方法包括 Ca)將脂肪細胞群植入所述受試者；和 (b)給予所述受試者促紅細胞生成素，從而提高所述受試者中的脂肪細胞存活率。
2.一種提高對其有需要的受試者中脂肪細胞存活率的方法，所述方法包括 Ca)將脂肪細胞群與促紅細胞生成素接觸；和 (b)將所述脂肪細胞群植入所述受試者中，從而提高所述受試者中的脂肪細胞存活率。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，進一步包括在所述植入前，用促紅細胞生成素接觸所述脂肪細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中在所述脂肪細胞的所述植入前，利用促紅細胞生成素治療所述受試者。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進一步包括在所述植入后，給予所述受試者促紅細胞生成素。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中在所述植入后，實施所述給藥。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或5所述的方法，其中實施所述給藥是通過將所述促紅細胞生成素直接注入所述脂肪細胞群。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述促紅細胞生成素的劑量為每注入每I,000，000個脂肪細胞約1-lOOOIUo
9.根據(jù)權(quán)利要求I或5所述的方法，其中通過全身途徑給予所述促紅細胞生成素。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述促紅細胞生成素的劑量為約每kg體重10-7500IU。
11.根據(jù)權(quán)利要求I或5所述的方法，其中至少進行兩次所述給藥。
12.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，進一步包括給予所述受試者選自由以下組成的組中的至少一種因子胞外基質(zhì)組分、生長因子、激素、血管生成因子、凝結(jié)因子、細胞因子、趨化因子、酶、神經(jīng)遞質(zhì)、維生素、碳水化合物、離子、鐵螯合劑、脂肪酸、抗生素和氨基酸。
13.促紅細胞生成素在制備確定用于治療軟組織缺損的藥物中的應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的利用，其中所述軟組織缺損選自由皮膚狀況、皮膚病、創(chuàng)傷、燒傷、癌癥、手術(shù)、整形手術(shù)、皮膚凹陷、先天畸形和獲得性疾病組成的組。
15.促紅細胞生成素在提高脂肪細胞存活率中的應(yīng)用。
16.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述脂肪細胞包括自體細胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述脂肪細胞包括非自體細胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述非自體細胞為同種異體細胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述非自體細胞為異種細胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述非自體細胞來自哺乳動物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中在取出所述脂肪細胞之前，用促紅細胞生成素處理所述哺乳動物。
22.—種藥物組合物，包含脂肪細胞群和促紅細胞生成素。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物，進一步包含選自由以下組成的組中的至少一種因子胞外基質(zhì)組分、生長因子、激素、血管生成因子、凝結(jié)因子、細胞因子、趨化因子、酶、神經(jīng)遞質(zhì)、維生素、碳水化合物、離子、鐵螯合劑、脂肪酸、抗生素和氨基酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其中所述促紅細胞生成素的劑量為約每注入每I, 000，000個脂肪細胞1-lOOOIUo
全文摘要
公開了一種提高對其有需要的受試者中脂肪細胞存活率的方法。所述方法包括(a)將脂肪細胞群植入受試者中；和(b)給予受試者促紅細胞生成素，從而提高受試者中的脂肪細胞存活率。
文檔編號C12N5/16GK102906250SQ201180020587
公開日2013年1月30日 申請日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月23日
發(fā)明者沙赫爾·汗默德 申請人:賽巴納醫(yī)藥有限公司